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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reprod-
uctiveand respiratory syndrome，HP-PRRS）于 2006 年
在我国南方一些省份暴发，以高发病率、高死亡率、
高热为主要特征，是引起妊娠母猪流产、木乃伊胎、
死产、早产等繁殖障碍的一种高度传染性疫病。该
病传播迅速，波及全国几十个省份，造成巨大的经
济损失［1，2］。HP-PRRSV 基因组主要特征是 Nsp2 中
间区域有 30 个氨基酸缺失［3］，也是自 2006 年以来
收稿日期 ：2013-05-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30901063）
作者简介 ：王彤彤，女，硕士研究生，研究方向 ：免疫病理学 ；E-mail ：wangtong.1021@163.com
通讯作者 ：肖一红，女，副教授，硕士生导师，研究方向 ：免疫病理学 ；E-mail ：xiaoyihong01@163.com
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 TA-12 株 ORF6
基因的克隆、鉴定及真核表达
王彤彤1  汪晓飞1  李心安1  田国宁2  刘立涛1  王广文1  李宁1   
王方昆1  李红梅1  赵孝民1  肖一红1
（1. 山东农业大学动物科技学院，泰安 271018 ；2. 潍坊出入境检验检疫局，潍坊 261041）
摘 要 ： 旨在获得 HP-PRRSV TA-12（GenBank 登录号 ：HQ416720）分离株 ORF6 蛋白的高效表达，将 HP-PRRSV TA-12 分
离株的 ORF6 基因克隆到载体 PfastBac HTB，并经转座进入 E. coli 含有杆状病毒质粒 Bacmid 的 DH10BacTM 细胞株，通过蓝白斑筛
选和 PCR 鉴定出阳性重组杆粒，再将提取的重组杆粒 Bacmid-ORF6 转染昆虫细胞 sf9，使其表达 ORF6 蛋白。经 Western blot 鉴定，
在感染重组杆状病毒后第 4 天 ORF6 蛋白表达量最大，达到 0.05 μg/μL。表达的 ORF6 蛋白主要存在于细胞质中。
关键词 ： 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF6 蛋白 真核表达
Cloning，Identification and Eukaryotic Expression of ORF6 Gene
from Highly Pathogenic PRRSV Strain TA-12
Wang Tongtong1 Wang Xiaofei1 Li Xin’an1 Tian Guoning2 Liu Litao1 Wang Guangwen1 Li Ning1
Wang Fangkun1 Li Hongmei1 Zhao Xiaomin1 Xiao Yihong1
（1. College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Taian 271018 ；2. Weifang Entry-Exit Inspection And
Quarantine Bureau，Weifang 261041）
Abstract:  To obtain the efficient expression of ORF6 proteins of HP-PRRSV strain TA-12, the eukaryotic expression plasmid PfastBac
HTB-ORF6 was constructed and transformed into DH10BacTM to get Bacmid-ORF6. The recombined plasmid was screened and identified by
blue-white color selection and PCR using specific primers. Then the Bacmid-ORF6 was transfected into sf9 cells for expression. The results
showed that the protein was expressed and the highest expression amount of 0.05 μg/μL was found at four days post infection using Western blot,
and the expressed protein was mainly located in cytoplasm. The successful expression of the ORF6 protein has laid good foundation for the study
of its potential function in the process of PRRSV infection.
Key words:  HP-PRRSV ORF6 protein Eukaryotic expression
在我国流行的优势毒株［4］。PRRSV 是有囊膜的单
股正链 RNA 病毒，属于尼多病毒目，动脉炎病毒
科，动脉炎病毒属家族的成员［5］，包含至少 6 种结
构蛋白［6］。其中 ORF6 编码 M 蛋白，为非糖基化的
基质蛋白，分子量 18-19 kD。M 蛋白的 N 端有 3 个
疏水性跨膜区，位于 17-88 位氨基酸残基处。M 蛋
白聚集在感染细胞的粗面内质网上，并与 GP5 蛋白
形成以二硫键相连的异源二聚体，被认为与病毒宿
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期160
主细胞受体相互作用有关［7，8］。Delputte 等［9］报道
肝素与 PRRSV GP5/M 二聚体相互作用可能是一种
PRRSV 受体，推测在病毒吸附靶细胞中扮演重要的
角色。M 蛋白在增强中和抗体中起到部分作用，据
报道能引起弱的中和抗体［10］。
通 过 与 经 典 株 PRRSV VR-2332 基 因 组 比 较，
HP-PRRSV ORF6 基因编码的 M 蛋白有 5 种氨基酸
发生突变。为了对 HP-PRRSV M 蛋白的特性进行研
究，本试验克隆获得 HP-PRRSV TA-12 株 ORF6 基
因，并将其克隆转至杆状病毒载体中，利用 Bac-to-
Bac 杆状病毒表达系统表达重组 ORF6 蛋白，旨在为
进一步研究 HP-PRRSV TA-12 分离株 ORF6 蛋白在
PRRSV 感染过程中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
HP-PRRSV TA-12 分离株、菌株 E. coli Top10、E.
coli DH10Bac、草地贪夜蛾细胞（Spodoptera frugipe-
rda 9，Sf9）、Marc-145 细胞均由山东农业大学动物
科技学院预防兽医系流行病及病原分子生物学实验
室保存 ；DMEM 细胞培养基和胎牛血清购自 Hyclone
公司 ；昆虫杆状病毒表达系统的转移载体 PFastBacTM
HTB、SF-900 II 培养基、M13 通用引物、Trizol RNA
提取试剂、细胞转染试剂 Lipofectamine 2000 购自
Invitrogen 公司 ；RevertAidTM Reverse Transcriptase、
RT Buffer、10 mmol/L dNTP 购 自 Fermentas 公 司 ；
RNase inhibition、OligdT、DNA Marker、低相对分子
质量蛋白 Marker、限制性内切酶（EcoR Ⅰ和 Hind
Ⅲ ）、T4 连 接 酶、Buffer、2.5 mmol/L dNTP 购 自 大
连宝生物工程有限公司 ；HiFi polymerase、DNA 胶
回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自北京全式金
生物技术有限公司 ；大提质粒试剂盒购自 QIAGEN
公司。
1.2 方法
1.2.1 HP-PRRSV TA-12 ORF6 基因的克隆测序
1.2.1.1 引物设计与合成 根据 HP-PRRSV TA-12 分
离 株（GenBank 登 录 号 ：HQ416720）ORF6 基 因 序
列设计和合成一对特异性上下游引物（F1 ：5-AA-
GAATTCTTATGGGGTCGTCCTTAGATGAC-3 和 R1 ：
5-CCGAAGCTTTTTGGCATATTTGACAAGG-3）， 并
分别在引物上下游引入 EcoR I 和 Hind Ⅲ 酶切位点
（下划线标明的部分），引物由上海生工生物科技有
限公司合成。
1.2.1.2 RNA 的提取和 RT-PCR 扩增 将 HP-PRRSV
TA-12 分 离 株 感 染 单 层 Marc-145 细 胞， 细 胞 病 变
（CPE）达到 80% 时收获病毒，按照 Trizol RNA 试剂
盒说明书提取病毒总 RNA，测定 RNA 浓度。建立 20
μL 反转录体系合成 cDNA ：RNA 1 μL，OligdT 1 μL，
H2O 10.5 μL 混匀后 65℃反应 5 min ；加入反转录酶
1 μL，RRI 0.5 μL，RT Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP
2 μL 混合后微离心，退火温度 42℃ 60 min，延伸
70℃ 10 min，最后 4℃终止。用上述合成的 cDNA
为模板，用 HP-PRRSV ORF6 基因特异性引物 F1 和
R1 用 HiFi polymerase 扩 增 HP-PRRSV TA-12 ORF6
基 因。 建 立 25 μL PCR 扩 增 体 系 ：ddH2O 16 μL，
10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，F1 和 R1
引 物 混 合 物 2 μL，cDNA 2 μL，HiFi polymerase 0.5
μL。PCR 扩增程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃ 30 s，
55℃ 30 s，72℃ 35 s，共 35 个循环 ；最后 72℃延伸
10 min。PCR 产物经电泳检测后，用 PCR 产物回收
试剂盒回收目的片段。
1.2.1.3 转移载体 PFastBac HTB-ORF6 的构建与鉴
定 将上述回收的目的片段与载体 PfastBac HTB 同
时用 EcoR I 和 Hind Ⅲ进行双酶切，酶切产物分别
胶回收，用 T4 DNA 连接酶将目的片段与 PFastBac
HTB 载体于 16℃过夜连接，并转化 E. coli Top10 感
受态细胞。转染的细胞经氨苄抗性选择性培养基初
筛，挑取阳性菌落培养后提取质粒，用 EcoR I 和
Hind Ⅲ进行双酶切鉴定，将鉴定正确的 PFastBac
HTB-ORF6 重组质粒送公司测序进一步鉴定。
1.2.2 Bacmid-ORF6 重组杆状病毒质粒杆粒的构建
与鉴定 为了表达 HP-PRRSV TA-12 ORF6 蛋白，将
重组的 PFastBac HTB-ORF6 质粒转座 E. coli 含有杆
状病毒质粒 Bacmid 的 DH10BacTM 细胞株，通过两
次蓝白斑筛选，挑取白色菌斑为阳性菌落目的菌落。
转 化 的 PFastBac HTB-ORF6 经 过 转 座 作 用，ORF6
基因连接至杆状病毒，用 M13 通用引物进行 PCR 鉴
定，PCR 产物预期扩增片段为 2 430 bp，加上目的
片段长度 525 bp。通过 PFastBac HTB-ORF6 和杆状
病毒质粒 Bacmid 的转座，获得重组 Bacmid-ORF6。
2013年第11期 161王彤彤等 ：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 TA-12 株 ORF6 基因的克隆、鉴定及真核表达
1.2.3 重 组 杆 粒 Bacmid-ORF6 在 sf9 细 胞 中 的 表
达 将上述鉴定正确的阳性菌落克隆，用 LB 培养
基 37℃过夜培养，用 QIAGEN 质粒提取试剂盒大量
提取重组的 Bacmid-ORF6 杆粒，测定浓度后根据细
胞转染试剂盒说明书将重组的 Bacmid-ORF6 杆粒转
染 sf9 细胞，待 CPE 达到 80% 后收取培养上清，反
复感染至第 3 代（P3）杆状病毒液，利用噬斑测定
P3 代病毒液的病毒含量。取处于对数期的 sf9 细胞
铺于 6 孔细胞培养板上，待细胞完全贴壁后感染重
组的 P3 代杆状病毒液（MOI=0.075），接毒后放置于
27℃恒温箱培养，待 CPE 达到 80%，收取细胞和培
养基，经 1 221 r/min 离心 5 min 使其分离，细胞经
超生破碎后用 12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离，湿法
转移至 PVDF 膜上，用 His 单抗进行 Western blot 检
测目的蛋白的表达情况。
1.2.4 重组蛋白在 sf9 细胞中表达时间的优化 取
处于对数期的 sf9 细胞铺于 6 孔细胞培养板上，用
SF-900 II 培养基在 27℃恒温培养，待细胞完全贴壁
后感染重组的 P3 代杆状病毒液（MOI=0.075），分别
在接毒后第 2、3、4 和 5 天收集细胞和培养基，经
1 221 r/min 离心 5 min 使其分离，用 250 μL PBS 重
悬细胞，经超生破碎后 10 000 r/min 离心 3 min，分
别收集不同时间的培养上清、细胞沉淀和细胞上清，
通过 Western blot 分析目的蛋白的表达量，选择最佳
表达时间。
2 结果
2.1 HP-PRRSV TA-12 ORF6基因的克隆测序结果
PCR 扩增产物经电泳检测，获得 525 bp 的特
异条带（图 1-A），与预期扩增片段大小一致。将此
PCR 产物克隆到 PFastBac HTB 载体，经双酶切鉴定，
结果与预期基本一致（图 1-B），测序结果显示，扩
增克隆目的片段的 DNA 序列与 GenBank（登录号 ：
HQ416720）中 ORF6 基因序列同源性达 100%。
2.2 HP-PRRSV TA-12 ORF6重组蛋白在sf9细胞中
表达结果
2.2.1 重 组 杆 粒 Bacmid-ORF6 的 鉴 定 M13 引 物
位于 lacZα-互补区 mini-attTn7 的侧翼，按试验设计
PCR 扩增的条带包含目的片段和载体上两侧 Tn7 侧
翼之间的部分，扩增出大小为 2 959 bp 的特异性
DNA 片段（图 2），结果（图 3）表明 PCR 产物与预
先设计结果一致。
525
1000
bp
1 M 2M
bp
750
500
5369
bp
525
1000
bp
750
500
A B
1 ：PCR 产物 ；2 ：重组质粒酶切 ；M ：DL2k plus Marker
图 1 ORF6 基因的克隆（A）及酶切鉴定结果（B）
Tn7R
M13F M13R1 208 bp 525 bp 1 225 bp
ⴞⲴ⡷⇥ Tn7L
1 ：重组杆粒 PCR 产物 ；M ：DL2k plus Marker
图 3 重组杆粒 Bacmid-ORF6 PCR 鉴定
图 2 M13 引物 PCR 扩增条带大小示意图
5000
bpbp
1 M
30002959
2000
2.2.2 ORF6 蛋白的表达鉴定 用小鼠抗 His 单克隆
抗作为一抗，用酶标羊抗鼠二抗，做常规 Western
blot 检测表达的 ORF6 蛋白。结果（图 4）显示，在
约 23 kD 处检测到蛋白条带，与预期理论值（23.4
kD）蛋白大小一致。
30
kD
1 2 3 M
24
14
1 ：正常细胞 ；2 ：空载体对照病毒感染的细胞 ； 3 ：重组病毒感染的细胞 ；
M ：蛋白相对分子质量标准
图 4 ORF6 蛋白表达鉴定
2.2.3 ORF6 重 组 蛋 白 在 sf9 细 胞 中 表 达 时 间 优
化 通过 Western blot 检测细胞在接毒后不同时间
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期162
的表达量（图 5），结果表明第 2 天细胞上清、细胞
沉淀和培养上清中均未检测到目的蛋白，从第 3 天
开始细胞上清、细胞沉淀中检测到少量蛋白，浓度
仅 0.009 μg/μL，第 4 天在细胞上清、细胞沉淀中明
显检测到目的蛋白表达，浓度达到 0.05 μg/μL，第 5
天时细胞沉淀中未检测到蛋白表达，并且细胞上清
中的蛋白表达量开始降低，此时浓度为 0.012 μg/μL，
表明细胞在接毒后第 4 天时蛋白表达量最大，并且
蛋白主要存在于细胞质中。
用［16，17］。ORF6 基因具有高度保守性，使其在作为
诊断抗原时具有很大的优势。研究分析表明，ORF6
蛋白是一种免疫原性较强的蛋白质，可诱导产生抗
体反应，且在感染后 10 d 即可检出［18］。ORF6 蛋白
作为弱的中和抗体，是否在病毒感染中起到一定的
作用，ORF6 蛋白结构和功能的关系将是今后试验所
研究的目标。ORF6 蛋白获得成功的真核表达为进一
步研究其在 PRRSV 感染及免疫学功能奠定了基础。
4 结论
成功构建了 HP-PRRSV TA-12 分离株 ORF6 基
因的真核表达载体 PFastBac HTB-ORF6，获得重组
杆粒 Bacmid-ORF6，转染 sf9 细胞获得了表达。
参 考 文 献
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M.：蛋白相对分子质量标准；1，4，7，10：分别为接毒后第 2 天、 3 天、4 天、
5 天的培养上清 ；2，5，8，11 ：分别为接毒后第 2 天、3 天、4 天和 5 天的
细胞沉淀；3，6，9，12：分别为接毒后第 2 天、3 天、4 天、5 天的细胞上清；
13-15 ：正常细胞的培养上清、细胞沉淀、细胞上清
图 5 ORF6 蛋白表达时间的优化结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15
30
kD
24
14
3 讨论
杆状病毒表达体系的主要特点是可以获得大量
抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的
可溶性重组蛋白，因此是表达有生物活性蛋白质的
理想载体［11-15］。到目前为止已有几百个包括动植物、
病毒、细菌、真菌的基因在昆虫细胞体内得到高效
表达。本试验从已分离的北美洲型 HP-PRRSV TA-12
株扩增获得 ORF6 基因，与 GenBank 中 PRRSV VR-
2332 ORF6 基因进行比对符合率为 95.6%。将获得
的 ORF6 基因克隆到杆状病毒载体上，利用 Bac-to-
Bac 杆状病毒表达系统对 TA-12 株 ORF6 基因进行
表达，并用 His 单抗检测到 ORF6 蛋白的表达，并
具有较好的反应原性。
在时间优化上，重组 ORF6 蛋白在第 3 天开始
表达，第 4 天表达量最高，随后第 5 天蛋白开始降
解，表达量降低，说明利用杆状病毒表达系统表达
重组 ORF6 蛋白呈时间依赖性。中和抗体被认为在
抵御 PRRSV 感染的第一道防线中扮演重要角色，尤
其是在抵抗再次感染和预防及降低病毒传播中起作
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（责任编辑 马鑫）