全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7
基因的克隆与原核表达
李国旺 苗志国 陈俊杰
(河南科技学院动物科学学院,新乡 453003)
摘 要 : 猪繁殖与呼吸综合征 ( PRRS)是严重危害全球养猪业的重要病毒性传染病。通过 PCR方法从高致病性 PRRSV
WUH 1株中扩增得到结构蛋白 ORF7的基因片段,并将目的基因插入原核表达载体 pET30a中, 得到重组表达质粒 pET30a
ORF7。重组表达质粒转化大肠杆菌 BL21( DE3)细胞, 经 IPTG诱导, SDSPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,融合蛋白得到
了高效表达, 表达的融合蛋白分子量约 20 kD。
关键词: 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 结构蛋白 ORF7基因 克隆 原核表达 融合蛋白
C loning and Prokaryotic Expression ofGene ORF7 ofH ighly Pathogenic
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome V irus
L iGuow ang M iao Zhiguo Chen Junjie
(H enan Institute of Science and T echnology, Co llege of Animal Science, X inx iang 453003)
Abstrac:t Po rc ine reproductive and respiratory syndrom e is an im po rtan t v iral infectious d isease tha t severe ly threatens g lobal p ig
industry. In this study, the gene sequence o f structura l prote in ORF7 w as am plified from highly pathogenic PPRSV isolate WUH 1 by
PCR and the targ et gene w as inse rted into prokaryo tic expression vector pET30a, generating a recom binant expression p lasm id, pET
30aORF7. The recom binant express ion p lasm id w as then used to transfo rm com petent ce lls o fE scherichia coli BL21( DE3) and the ex
pression w as induced by IPTG. SDSPAGE e lec trophoresis analysis show ed an effic ient expression of the targe t fusion pro te in, o f wh ich
m olecularw e ight w as about 20 kD.
Key words: H ighly pa thogen ic porcine reproductive and resp ira tory syndrom e v irus Structural prote in ORF7 gene C loning
P rokaryotic express ion Fusion pro tein
收稿日期: 20100817
基金项目:河南省教育厅自然科学基金项目 ( 2010A230002)
作者简介:李国旺,男,本科,讲师,研究方向:中草药在临床兽医和预防兽医中的应用; Em ai:l x inxiang 20100101@ 163. com
通讯作者:苗志国,男,博士,副教授,研究方向:动物营养与肉质调控; Em ai:l m iaozh iguo2000@ yahoo. com. cn
猪繁殖与呼吸综合征 ( Porcine reproductive and
resp iratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合
征病毒 ( Porc ine reproduct ive and resp iratory syndrome
v irus, PRRSV )引起的病毒性传染病 [ 1 ]。该病可引
起猪群多系统病症, 繁殖母猪感染可导致流产、早
产、死胎、木乃伊胎等严重的繁殖障碍, 死胎率可达
20% - 60%, 是威海规模化养猪的主要疾病之一;
PRRSV粒子呈球形,有囊膜, 直径约 50- 65 nm,囊
膜表面有明显的纤突,核衣壳直径约 30- 35 nm,呈
20面体对称, 内含单股线状正链基因组 RNA,长约
15 kb,是 4种动脉炎病毒成员中最大的, 外绕一脂
质双层膜 [ 2, 3] ;由于 PRRSV对热和 pH敏感, 在环境
中不会存活太长时间,因此用于病毒分离的血清和
组织样品应保存在 - 20 或 4 条件下, 以保护样
品中 PRRSV的感染性。
本研究以从 2006年发生高热病的猪体中分离
获得的WuH1株 PRRSV为材料, 通过 PCR方法从
高致病性 PRRSV WuH1株中扩增得到结构蛋白
ORF7的基因片段,并将目的基因插入原核表达载
体 pET30a中, 得到重组表达质粒 pET30aORF7。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
重组表达质粒转化大肠杆菌 BL21 ( DE3)细胞, 经
IPTG诱导, SDSPAGE电泳分析表明, 融合蛋白得
到了高效表达, 表达的融合蛋白分子量约 20 kD。
ORF7原核表达的蛋白可用于单克隆抗体的制备和
蓝耳病变异株的鉴定,以期为进一步研究 PRRSV的
免疫特性和分子生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 毒株与菌株 PRRSV WuH1株、大肠杆菌
DH5和 BL21( DE3)均由华中农业大学动物传染
病室提供。
1. 1. 2 载体与质粒 KGN质粒和 pET30a表达载
体由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供。
1. 1. 3 工具酶及试剂 各种限制性内切酶、Taq
DNA聚合酶及 T4 DNA聚合酶、DNA Ligase等购自
TaKaRa公司; DNA快速回收试剂盒购自北京博大
泰克公司;三羟甲基氨基甲烷 ( T ris base) ,甲酰胺为
B ioRAD产品; 低分子量蛋白质 Marker、琼脂糖、胰
蛋白胨 ( T ryp tone) , 酵母浸出物 ( Y east Ex tract)为
OXO ID产品。
1. 1. 4 培养基与抗生素 LB液体培养基、LB固体
培养基、氨苄青霉素 ( Amp)均为华中农业大学农业
微生物国家重点实验室配制。
1. 1. 5 质粒提取用缓冲液及试剂 电泳缓冲液
( 50 TAE ): T ris base 242 g加入到 700 mL ddH2O
中,再加入冰醋酸 57. 1mL, 0. 5mo l/L EDTA ( pH80)
100mL,用 ddH2O定容至 1 000 mL。凝胶上样缓冲
液 ( 6 贮存液 ) : 0. 25% 溴酚蓝, 0. 25%二甲苯青,
30%甘油水溶液。TE缓冲液 ( pH80) : 1mmol /L
EDTA ( pH80 ), 10 mmo l/L T risC l( pH80)。 13%
PEG 8000( 1. 6 mo l/L NaC l): 13 g PEG 8000, 9. 35 g
N aC ,l溶于 ddH 2O中, 定容至 100 mL,高压灭菌后室
温保存备用。DEPC处理水: 0. 1% DEPC。
1. 1. 6 SDSPAGE缓冲液及试剂 30%聚丙烯酰
胺母液;考马斯亮蓝染色液; 脱色液: 45 mL 甲醇,
45 mL ddH2O, 10 mL冰乙酸,混匀后室温保存。
12 试验方法
12. 1 ORF7基因的扩增 PRRSV ORF7基因片段
的扩增根据 PRRSV W uH1株序列, 采用 Primer
Prem ier 5. 0软件,以 ORF7为靶基因设计合成一对
引物,引物位于缺失区域两端的相对保守区,设计合
成的特异性引物如下 (下划线表示引入的酶切位点
BamH I和 H ind ):
上游引物 P1( ORF7F): 5GCGGGATCCATGC
CAAATAACAACGGC3,
下游引物 P2( ORF7R ): 5GGGAAGCTTTCAT
GCTGAGGGTGATGC3,
反应体系如表 1所示。
以 ORF7F 和 ORF7R 为上下游引物扩增
ORF7: 94 变性 5 m in, 55 退火 1 m in, 72 延伸
1m in,共 35个循环,最后 72 延伸 10m in。设不加
重组质粒的阴性对照,预期扩增产物长度为 390 bp。
表 1 PCR反应体系
试剂 体积 ( L)
10 PCR Buf fer 5. 0
MgC l2 3. 0
ORF7上游引物 1. 5
ORF7下游引物 1. 5
dNTP m ixture 1. 5
Taq酶 1. 0
H 2O free 35. 5
KGN 1. 0
122 PCR产物或酶切产物的电泳检测 PCR或
酶切结束后, 用 1 TAE电泳缓冲液配制 0. 8% -
12% (W /V )琼脂糖凝胶溶液, 加热至琼脂糖完全溶
解后,加 EB ( 10mg /mL)至终浓度 05 g /mL,混匀倒
入选定的胶模中,插入相应的梳子,凝胶厚度在 3- 5
mm之间。待凝胶完全凝固,小心拔出梳子,将凝胶
放入装有 1 TAE电泳缓冲液的电泳槽中,使电泳液
刚没过胶面 (约 1mm)。取适量 ( 5- 10 L)待电泳
的 PCR产物或酶切产物样品在封口膜上与 1 /6体积
加样缓冲液混匀,用微量加样器将样品加到梳孔中,
同时加入 DNA M arker作对照, 以 5 V /cm的电压电
泳。当溴酚蓝电泳至适当位置, 在长波紫外灯下 /凝
胶成像系统观察或拍照。
12. 3 PCR产物或酶切产物回收与纯化 用 DNA
快速回收试剂盒回收纯化 PCR或酶切产物 DNA。
具体步骤参照北京博大泰克公司 DNA快速回收试
剂盒说明书。
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2011年第 2期 李国旺等:高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因的克隆与原核表达
12. 4 外源 DNA片段与质粒载体的连接反应
反应体系如表 2所示。所有成分加完后,轻轻
混匀, 离心, 置于 16 水浴连接过夜 ( 12 - 16 h)。
一般外源 DNA片段与质粒载体连接的摩尔比例为
31,平端连接可更高; 一般粘端连接置 16 水浴过
夜或至少 1- 4 h,取 5 L连接产物转化大肠杆菌感
受态细胞, 平端连接, 16 连接 20- 24 h, 取 10 L
连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞。
表 2 回收纯化的酶切产物或 PCR产物与目的
质粒的连接反应体系
试剂 体积 (L)
10 T4 DNA L igase Bu ffer 3. 0
T4 DNA L igase 1. 5
pET30a 10. 0
回收纯化的 PCR酶切产物 ORF7 15. 5
125 连接产物的转化 制备抗性平板 (氨苄青
霉素 (Amp), 50- 100 g /mL)。取制备好的感受态
细胞 100 L(或取 - 70 冻存的感受态细胞于冰上
融化后,取100 L)于一无菌的 1. 5 mL EP管, 加入
连接产物 (约 10 L),混匀, 冰浴 30 m in后,于 42
水浴热激 90 s,再冰浴 2- 5m in。加入 400 L的 LB,
37 200- 220 r /m in摇床复苏培养 45 - 60 m in,
5 000 r/m in离心 3m in,弃去 400 L上清,用余下部
分上清轻轻重悬细菌沉淀,并均匀涂布抗性平板,先
正放于 37 温箱中 1- 2 h,使平板表面液体充分吸
入琼脂中后 (以培养基表面无液体流动为适宜 ) ,再
倒放继续培养至 12- 18 h,观察转化单菌落的出现。
若是转化现成质粒,则于 42 水浴热激 90 s,
放回冰上 2 m in后, 直接取 30- 50 L菌液直接涂
布含 Amp的 LB平板,然后即可于 37 温箱培养。
126 质粒的制备与鉴定
12. 6. 1质粒的小量制备 ( 1)用灭菌牙签挑取平
板上的单菌落, 接种到 4mL含 Amp的 LB培养液
中, 37 300 r /m in振摇培养过夜; ( 2)将菌液转入
1. 5mL EP管中, 12 000 r /m in离心 1 m in, 弃上清,
倒立离心管, 使液体流尽, 收集菌体; ( 3)加入 100
L冰预冷的溶液 I,涡旋至菌体充分悬浮; ( 4)加入
新鲜配制的溶液 II 200 L,颠倒混匀, 冰浴 5 m in;
( 5)加入预冷的溶液 III 150L,颠倒离心管几次混匀
后冰浴 5m in; ( 6) 12 000 r /m in离心 5m in, 吸取上
清至另一 1. 5mL离心管内, 加入等体积的异丙醇,
涡旋混匀, 室温静置沉淀 10 m in; ( 7 ) 12 000 r/m in
离心 10m in,弃上清, 沉淀用 75%冷乙醇漂洗后, 抽
干或自然干燥, 用 200 L含适量 RNA酶 ( RN ase,
20 g /mL)的 TE ( pH8. 0)或 ddH 2O溶解沉淀, 56
水浴 30m in或 37 水浴 1 h以去除 RNA; ( 8)加入
1 /2倍体积的冰预冷 7. 5mo l/L NH4A c 100 L,混匀
后冰浴 10m in; ( 9) 4 12 000 r /m in离心 10m in,吸
取上清到另一支 1. 5mL离心管中,加 1倍体积的异
丙醇或 2倍体积的无水乙醇室温沉淀 30 m in; ( 10)
12 000 r/m in离心 5 m in, 弃上清, 75% 冷乙醇漂洗
沉淀,抽干后溶于适量 ddH2O或 TE ( pH80), 取样
1- 2 L电泳观察提取质粒的质量, 其余置 - 20
保存备用。如在 ( 7)不去除 RNA, 可在 ( 10 )中进
行, 将沉淀溶于适量含 RNase的 ddH2 O 或 TE
( pH80)中, 37 温育 1 h,取样电泳检查,其余置 -
20 备用。
12. 6. 2限制性内切酶酶切及回收体系 反应体系
见表 3,表 4。
表 3 酶切鉴定体系
试剂 体积 ( L)
pET30 a /ORF7 6. 0
B amH I 1. 0
H ind 1. 0
10 Bu ffer( 1. 5 T ) 3. 0
H
2
O 9. 0
表 4 酶切回收体系
试剂 体积 ( L)
pET30 a /ORF7 10. 0
B amH I 2. 0
H ind 2. 0
10 Bu ffer( 1. 5 T ) 6. 0
H2O 20. 0
12. 7 SDSPAGE电泳检测目的基因在原核细胞
中的表达
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
12. 7. 1 样品制备 将重组表达质粒和空白载体
分别转化 BL21( DE3)感受态细胞,在转化的平皿中
挑取一个单菌落接种于含 Amp的 3mL LB液体培养
基,于 37 振荡培养约 10- 12 h,至 OD600达到 0. 6-
1. 0时,放入 4 冰箱过夜。第 2天, 将培养物 5 000
r /m in离心3 m in,然后用新鲜 LB洗涤 1次,沉淀用 3
mL LB悬浮,取 100 L接种于 10mL含 Amp的新鲜
LB液体培养基中,于 37 振荡培养约 3 h,至 OD600达
到 0. 6- 1. 0时,加 IPTG至终浓度为 0. 8mmo l/L, 继
续培养 5 h,其间每隔 1 h(在第 0、3、4、5 h)取 1mL菌
液至 EP管中。将收集于 EP管中的细菌 5 000 r/m in
离心 3m in,弃上清, 加 100 L无菌去离子水吹散混
匀, 加 100L 2 蛋白质电泳 loading buffer,混匀后沸
水浴 8m in,于 12%的 SDSPAGE电泳检测重组蛋白
的表达。
12. 7. 2 SDSPAGE电泳 ( 1 )配胶: 参照文献
[ 4]方法制备 12%分离胶和 5%浓缩胶。 ( 2)倒胶:
夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板,将制好的 12%
的 SDS丙烯酰胺分离胶约 5 mL迅速灌入两玻板的
间隙中,留出灌注浓缩胶所需空间,在分离胶上加入
一层异丁醇, 置 37 温室聚合 45 m in, 分离胶聚合
后,倾出覆盖层液体, 用去离子水洗凝胶顶部数次,
用纸巾吸净残留液体, 再将刚制好的 5%浓缩胶灌
入分离胶上, 立即插入梳子, 置 37 温室聚合
45 m in,待胶全部聚合后移出梳子,用水洗去加样槽
的残留液体,用针头拨掉加样槽的胶将齿弄直,固定
于电泳装置。 ( 3)电泳: 往电泳装置加入适量 1
Tris甘氨酸电泳缓冲液,取处理好的样品上样, 每孔
上 20 L样品。接通电源, 电压调到 80 V, 待溴酚
蓝指示剂跑到分离胶时, 将电压调到 120 V, 等溴酚
蓝指示剂跑到分离胶底部 (约需 2 h)时断电,结束
电泳。 ( 4)染色与脱色:结束电泳后, 取出凝胶,置于
考马斯亮蓝染料 R250中染色 4 h以上,取出放入脱
色液中脱色数次, 每次 30 - 60 m in。观察分析并
拍照。
2 结果与分析
2. 1 PRRSV ORF7基因的扩增与鉴定
以 KGN为模板,通过 PCR扩增 ORF7基因,获
得了大小约 390 bp的片段 (图 1 ) , 与预期大小
相符。
M. DL2000DNA marker; 1.阴性对照; 2. PRRSV ORF7基因的
PCR扩增
图 1 ORF7基因的 PCR扩增
2. 2 重组质粒 pETORF7的构建与鉴定
回收大小为 390 bp的外源片段, 用 BamH I和
H ind 双酶切 pET30a, 连接到 pET30a的相应位
点, 转化大肠杆菌 DH 5, 小量提取质粒, 经 BamH I
和H ind 进行双酶切鉴定, 得到大小约 390 bp和
5 300 bp的两条带 (图 2), 证实 ORF7基因已正确插
入 pET30a中,将获得的阳性重组质粒命名为 pET
30aORF7。
M. DL15000 DNA m arker; 1. pET30aORF7 /B amH I+
H ind
图 2 重组表达质粒 pET30aORF7酶切鉴定
2. 3 ORF7基因在原核细胞中的表达与检测
将重组表达质粒和空白载体分别转化 BL21
( DE3)感受态细胞,在转化的平皿中挑取一个单菌
落接种于含 Amp的 3mL LB液体培养基, 于 37 振
荡培养约 10- 12 h,将培养物转化菌 5 000 r/m in离
心 3m in,然后用新鲜 LB洗涤 1次,沉淀用 3mL LB
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2011年第 2期 李国旺等:高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因的克隆与原核表达
悬浮, 取 100 L接种于 10mL含 Amp的新鲜 LB液
体培养基中,于 37 振荡培养约 3 h, 加 IPTG至终
浓度为 0. 8mmo l /L,继续培养 5 h,其间每隔 1 h(在
第 0、3、4和 5 h)取 1 mL菌液至 EP管中。将收集
于 EP管中的细菌 5 000 r /m in离心 3 m in, 弃上清,
用 100 L无菌去离子水吹散混匀,加 100 L 2 蛋
白质电泳 Load ing Buffer, 混匀后沸水浴 8 m in, 于
12%的 SDSPAGE电泳检测, 由 SDSPAGE电泳可
见经 IPTG诱导 3、4和 5 h的转化菌在约 20 kD处
有一条较浓的蛋白带,其大小与预期结果相当;而未
经诱导的 pET30aORF7转化菌和空载体在该处没
有蛋白带 (图 3)。
M. S tand ard protein m arker; 1.经诱导的 pET30a空载体;
2, 3, 4, 5.分别为经 0、3、4、5 h诱导的 pET30 aORF7
图 3 pET30aORF7原核表达产物的 SD SPAGE电泳
3 讨论与结论
3. 1 讨论
目前, 免疫接种仍是防控 PRRS的主要措施。
但使用的 PRRS商用常规疫苗弱毒疫苗及灭活疫苗
因存在安全隐患或免疫效果差的缺陷而不能提供理
想的免疫保护, 从而导致 PRRS的防治非常困难。
另外,疫苗免疫效果不理想的一个重要原因可能是
因为 PRRSV同其他有囊膜的 RNA病毒一样, 基因
组存在高度的变异性。到目前为止, 各国均分离到
多种毒株,越来越多的序列及抗原性分析资料显示,
不同的 PRRSV分离毒株之间的毒力、基因序列和抗
原性等方面都存在较大差异, 而且也报道了 PRRSV
出现同源重组的现象。
总体来说,原核表达系统与真核表达系统相比,
进行外源目标蛋白表达时原核表达系统具有高效、
快速而且经济等优点。本试验所选的 pET30a表达
系统是一种方便而且高效的原核表达载体,含有 T7
Lac启动子,可用 IPTG诱导产生高表达、含小分子
量融合肽的融合蛋白,有利于蛋白的提纯。
3. 2 结论
321 利用 PCR方法, 扩增获得了 PRRSV W uH1
株的 ORF7基因。
322 成功构建了 PRRSV WuH1株的 ORF7基因
原核表达质粒 pET30aORF7, 并在大肠杆菌中实现
了高效表达。
参 考 文 献
[ 1] 方六荣.猪繁殖与呼吸综合征 自杀性 DNA疫苗与或病毒载体
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( PRRSV) E蛋白基因真核表达质粒的构建. 生物技术, 1999, 9
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术出版社, 2000.
[ 4] S amb rook J;金冬雁等译. 分子克隆实验指南 (第 2版 ) [M ] .北
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(责任编辑 马鑫 )
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