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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-14
基金项目 : 国家自然科学基金资助面上项目（30973445）, 校级青年科学基金项目（KJ2008A039）
作者简介 : 杨建林 , 女 , 硕士 , 副教授 , 研究方向 : 抗肿瘤免疫等 ; E-mail: mmgbb2002@126.com
通讯作者 : 王艳林 , E-mail: fzswangyl@ctgu.edu.cn
siRNA 沉默 ERp57 对细胞中 CRT 表达与定位的影响
杨建林 韩钰 王艳林
（三峡大学 分子生物学研究所 , 宜昌 443002）
摘 要： 探讨 ERp57 基因表达沉默对人小细胞肺癌 A549 细胞中 CRT 表达和定位的影响。利用 siRNA 技术获得 ERp57 基因
表达沉默的人 A549 肺癌细胞株 , 分析该细胞株中 ERp57 基因以及 CRT 基因的蛋白表达水平，免疫荧光法检测细胞中 CRT 的表达
和亚细胞定位，荧光法检测细胞凋亡。成功获得 ERp57 基因表达沉默的人 A549 肺癌细胞株。在该细胞中，CRT 表达上调但仍定
位于内质网中。用米托蒽醌处理对照细胞 14 h 后，可使 CRT 大量转移到细胞膜表面并发生簇集，但在 ERp57 表达沉默的细胞中，
CRT 的膜转移和簇集现象不明显。细胞凋亡分析显示，米托蒽醌处理细胞 48 h 后，所有细胞均出现凋亡细胞典型细胞核固缩、分
裂现象。试验证明抑制 ERp57 蛋白表达会增加 A549 肺癌细胞中 CRT 的含量，但同时也阻断蒽环类药物诱导的 CRT 膜转移，提示
ERp57 也是介导肿瘤细胞免疫原性凋亡的重要因子。
关键词： siRNA ERp57 钙网蛋白 肺癌细胞
Effect of Silencing ERp57 by siRNA on CRT Expression and
Localization in A549 Human Lung Cancer Line
Yang Jianlin Han Yu Wang Yanlin
（Institute of Molecular Biology, Medical College, Three Gorges University, Yichang 443002）
Abstract: It was to investigate the effect of silencing ERp57 on calreticulin（CRT） expression and localization in A549 cells. siRNA
technique was used to silence expression of ERp57 gene in human A549 lung cancer line. Western blotting was performed to assay the expression
level of ERp57 and CRT genes. The localization of CRT in A549 was tested by immunofluorescrence. Cell apoptosis were determined with
fluoresce microscope. An A549 cell line with silenced ERp57 expression was obtained successfully. In this cell line, an increased expression
level of CRT was determined, but no change of CRT localization was observed. Immunofluorescence assay indicated that mitoxantrone treatment
resulted in CRT exposure on the cell surface quickly in the control cells, but no obvious effect was observed in siRNA-silenced cells. Knocking
down ERp57 could facilitate the expression of CRT, but also block the anthracycline-induced CRT membrane translocation, suggesting that
ERp57 is also an important factor in mediating immunogenic apoptosis of tumor cells.
Key words: siRNA ERp57 Calreticulin Lung cancer cell
近年来研究显示，钙网蛋白（calreticulin, CRT）
从内质网移位到细胞膜表面是凋亡肿瘤细胞具有免
疫原性的重要标志，决定着机体特异性抗肿瘤免疫
应答的发生［1-3］。但 CRT 向细胞膜表面移位的机制
尚不清楚。新近研究发现，ERp57 这种蛋白质二硫
化物异构酶（PDI）成员之一，与 CRT 同属于内质
网伴侣分子，主要与 CRT 紧密结合存在于细胞内质
网腔中，在 CRT 向细胞膜移位过程中起着至关重要
的作用［4］。国外有学者研究证实，只有当肿瘤细胞
中正常表达 ERp57 蛋白时，蒽环类药物才能诱导该
细胞发生 CRT 外翻的现象，从而出现免疫原性凋亡
细胞的形成［5］。本试验旨在利用 siRNA 技术，封闭
人小细胞肺癌 A549 细胞中 ERp57 的表达，筛选建
立稳定低表达 ERp57 的细胞株，然后用蒽环类药物
米托蒽醌处理细胞诱导凋亡，由此观察稳定低表达
ERp57 细胞株中 CRT 表达量以及定位的变化，为阐
2012年第1期 121杨建林等 ：siRNA 沉默 ERp57 对细胞中 CRT 表达与定位的影响
明 ERp57 与 CRT 介导的抗肿瘤免疫的相关性提供理
论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人 非 小 细 胞 肺 腺 癌 A549 细 胞 株、 菌 株 E.
coli DH5α 为 本 研 究 所 保 存。LipofectamineTM2000
（Invitrogen 公司）；兔抗人 CRT 抗体、兔抗人 ERp57
抗 体 和 兔 抗 人 β-action 抗 体（Santa Cruz 生 物 工 程
公司），羊抗兔 IgG-HRP（北京中杉金桥公司），预
染 蓝 色 中 分 子 量 蛋 白 Marker（Fermentas 公 司 ）；
细 胞 培 养 基 RPMI-1640 为 美 国 Sigma 公 司 产 品，
ECL 化学发光检测试剂为 GE Healthcare 公司产品，
pSilencer 2.1-U6 载体为 Ambion 公司产品 ；其他试
剂为 Sigma 和 NEB 公司产品。寡核苷酸链合成以及
DNA 测序由上海生物技术工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 pSilencer 2.1-U6/ ERP57 真核表达载体的构建
　依据参考文献［5］合成两条互补的寡核苷酸链 ：
5-GATCCCATAGTCCCATTAGCAAAGGTTCAAGAGA
CCTTTGCTAATGGGACTATTTTTTTGGAAA-3 ；
5-GGTATCAGGGTAATCGTTTCCAAGTTCTCTGGAA
ACGATTACCCTGATAAAAAAACCTT TTCGA-3。两互
补 链 经 退 火 后， 形 成 的 双 链 DNA 两 端 分 别 含 有
Bam H I 和 Hind III 酶切位点的粘性末端。将上述退
火后的 DNA 片段克隆入 pSilencer2.1-U6 表达载体中，
然后转化 E.coli DH5α 感受态细胞，经氨苄青霉素
（50 mg/L）琼脂平板筛选后，挑取单个菌落接种液
体 LB 培养基过夜振荡培养，提取质粒进行测序鉴
定。试验中同时设计两条互补的含随机碱基序列的
寡核苷酸链，以相同的方法构建质粒用于对照试验。
对照寡核苷酸链的碱基序列为 ：5-GATCCACTACCG
TTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGT
AGTTTTTTGGAAA-3；5-AGCTTTCCAAAAAACTACC
GTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACG
GTAGG-3。
1.2.2 筛选 ERp57 表达沉默的细胞株 取 5 μg pSilen
cer2.1/ERp57 质粒或对照质粒用脂质体试剂法转染
A549 人肺癌细胞（100 mm 培养皿），转染 24 h 后使
用含有 0.2 g/L Hygromycin B 的 1640 培养基筛选培养。
3 周后，挑选肉眼可见的单克隆细胞，将其依次转移
至 24 孔、12 孔、6 孔细胞培养板中扩大培养，West
ern blotting 法鉴定成功抑制 ERp57 表达的细胞株。
1.2.3 Western blotting 法检测细胞内 ERp57 和 CRT
蛋白表达 将长满细胞的 6 孔板中每孔加入 300 μL
细胞裂解液，收集细胞冰上放置 30 min，4℃高速
离心后保留上清，考马斯亮蓝法检测上清中的总蛋
白浓度。取含等量蛋白的上清液加入上样缓冲液沸
水中水浴 5 min 使得蛋白变性，100 V 电压下 12%
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离蛋白，常规电转
法将蛋白转移到 PVDF 膜上（60 V，60 min）。电转
后的 PVDF 膜首先用 50 g/L 脱脂奶粉-TBST 液封闭
非特异蛋白结合位点（室温，2 h），随后分别用兔
抗人 ERp57 抗体（1 1 000）和兔抗人 CRT 抗体（1
1 000）结合目的蛋白（室温，2 h）；TBST 缓冲液洗
涤 3 次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG
抗体（室温，45 min），再次用 TBST 缓冲液洗涤 3
次后，使用 ECL 法（增强化学发光法）显色。
1.2.4 免疫荧光法检测 CRT 细胞内定位及表达 用
米托蒽醌处理细胞培养 14 h 后 PBS 洗涤细胞，每孔
加入 4% 多聚甲醛 200 μL，4℃固定 20 min，PBS 洗
涤后，用 10% 山羊血清于 37℃封闭 60 min，再次 PBS
洗涤，用兔抗人 CRT 抗体（0.01%BSA 稀释，1 150）
结合细胞中的相应蛋白，放置于 4℃过夜处理。PBS
洗涤后，加入罗丹明标记的羊抗兔 IgG 抗体（室温，
45 min），PBS 洗涤后，加入 300 nmol/L DAPI 与细胞
核相结合，作用 20 min，PBS 再次洗涤后，荧光显
微镜下观察。
1.2.5 凋亡细胞形态学观察 用米托蒽醌处理细胞
培养 24 h 后， 同 1.2.4 法 4% 多聚甲醛固定细胞，直
接加入 300 nmol/L DAPI 对细胞核染色 20 min，PBS
洗涤后，倒置荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 构建pSilencer 2.1-U6/ ERp57真核表达载体
合 成 的 两 条 针 对 ERp57 的 互 补 寡 核 苷 酸 链，
经 退 火 后 产 生 的 DNA 双 链 被 克 隆 入 siRNA 载 体
pSilencer2.1-U6 中。重组质粒 pSilencer2.1/ERp57 和
对照质粒经 DNA 测序鉴定，插入片段的碱基序列和
插入方向无误。在细胞内，载体上的 U6 启动子将
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期122
指导转录出含 ERp57 靶序列的小分子 RNA，后者自
身折叠生成茎环结构，然后在细胞特定酶系统的作
用下，剪切出靶向 ERp57 的 siRNA 小分子。
2.2 获得ERp57表达抑制的细胞株
将 pSilencer2.1/ERp57 稳 定 转 染 A549 细 胞 后，
以兔抗人 ERp57 特异性抗体进行 Western blotting 鉴
定，结果（图 1）显示，筛选出的克隆细胞株全细
胞裂解液中 ERp57 蛋白含量显著低于 A549 细胞和
A549/pSilencer2.1-U6 对照细胞，证实获得了 ERp57
表 达 沉 默 的 A549 肺 癌 细 胞 株， 将 此 细 胞 株 记 为
A549/ pSilencer2.1-U6/ ERp57。
2.3 ERp57表达抑制上调CRT表达水平
Western blotting 法 检 测 细 胞 内 CRT 蛋 白 表 达
量，发现蛋白总量相等的全细胞裂解液中，A549/
pSilencer2.1-U6/ERp57 细胞株的 CRT 蛋白表达量略
有 升 高，A549/pSilencer2.1-U6 对 照 细 胞 株 与 A549
2.4 A549/pSilencer2.1-U6/ERp57细胞内CRT表达
定位
细胞免疫荧光法检测结果（图 2）显示，A549/
pSilencer2.1-U6/ ERp57 细胞中红色荧光强度高于对
照 A549 细胞，并且集中在细胞质中。提示 ERp57
表达抑制的细胞中，CRT 蛋白表达升高，但仍定位
于细胞质中。
1. A549/pSilencer2.1-U6/ ERp57 细胞 ; 2.
A549/ pSilencer2.1-U6 细胞 ; 3:A549 细胞
图 1 Western blotting 分析细胞中 ERp57 和
CRT 蛋白表达
A. A549 细胞 ; B. A549/pSilencer2.1-U6 细胞 ; C. A549/pSilencer2.1-U6/ERp57 细胞
图 2 免疫荧光法检测 CRT 在细胞内的表达定位
2.5 ERp57表达抑制阻断米托蒽醌诱导的CRT膜移位
米托蒽醌处理细胞 14 h 后，以兔抗人 CRT 特
异性抗体通过细胞免疫荧光法检测 CRT 的表达与
亚细胞定位。结果（图 3）发现药物处理后，A549/
pSilencer2.1-U6 细胞株与 A549 细胞株细胞膜上有
团块状红色荧光物质聚集，且两组细胞中红色荧光
强度相似，而 A549/pSilencer2.1-U6/ERp57 细胞内
红色荧光强度较高，大部分仍集中在细胞质中。提
示在药物的作用下，ERp57 表达正常的细胞内 CRT
向细胞膜移动并聚集成团，而 ERp57 表达抑制的
细胞 CRT 向细胞膜移动较少，大部分依旧定位在
细胞质中。
A. A549 细胞 ; B. A549/pSilencer2.1-U6 细胞 ; C. A549/pSilencer2.1-U6/ERp57 细胞
图 3 米托蒽醌处理对 CRT 在细胞内表达定位的影响
细胞株的 CRT 蛋白表达量无明显变化（图 1）。
2012年第1期 123杨建林等 ：siRNA 沉默 ERp57 对细胞中 CRT 表达与定位的影响
2.6 ERp57表达抑制不影响米托蒽醌诱导的A549
细胞凋亡
米托蒽醌处理 A549 细胞 48 h 后，经 DAPI 染色，
在倒置荧光显微镜下可见 3 组细胞均出现凋亡细胞典
型的细胞核固缩和分裂现象，差异无显著性（图 4），
提示 ERp57 的表达不影响细胞对米托蒽醌的敏感性。
A. A549 细胞 ; B. A549/ pSilencer2.1-U6 细胞 ; C. A549/ pSilencer2.1-U6/ ERp57 细胞
图 4 荧光法检测细胞凋亡
3 讨论
蒽环类药物能诱导某些肿瘤细胞在凋亡早期出
现细胞内 CRT 向膜表面移位与聚集，当用这种凋
亡的肿瘤细胞免疫动物后，可激发机体产生特异性
抗肿瘤免疫反应［6］。此外，ERp57 蛋白与 CRT 的
膜向移位密切相关。本研究采用 siRNA 技术，成功
获得了在人小细胞肺癌 A549 细胞株中稳定低表达
ERp57 蛋白的单克隆细胞株。CRT 蛋白在 ERp57 低
表达细胞株中含量有所升高，但在细胞中的定位并
不随 ERp57 表达量改变而发生改变。由于 ERp57
蛋白与 CRT 蛋白同为内质网中的分子伴侣，都是主
要组织相容性复合物 MHC 分子肽运载复合体中的
重要组成成分［7,8］，推测 ERp57 表达抑制时 CRT 表
达上调，可能源于细胞代偿性增加 CRT 的合成以补
偿 ERp57 的功能。蒽环类药物诱导细胞发生凋亡时，
虽然 A549/pSilencer2.1-U6/ERp57 细胞中 CRT 含量
较高，但因 ERp57 蛋白表达不足，CRT 向胞膜移
动的过程受到影响，仍大量聚集在细胞质中。而对
照细胞中 ERp7 表达正常，蒽环类药物处理后可见
CRT 蛋白向细胞膜转移并在膜上聚集成团块状，提
示 ERp57 蛋白在 CRT 向细胞膜移动的过程中起重
要作用。
4 结论
抑制 ERp57 蛋白表达会增加 A549 肺癌细胞中
CRT 的含量，但同时也阻断蒽环类药物诱导的 CRT
膜转移，提示 ERp57 也是介导肿瘤细胞免疫原性凋
亡的重要因子。
参 考 文 献
［1］ Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F, et al. Calreticulin exposure
dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med, 2006, 13
（1）:54-61.
［2］ Qin Y, Han Y, Cao C, et al. Melanoma B16-F1 cells coated with
fusion protein of mouse calreticulin and virus G-protein coupled
receptor induced the antitumor immune response in Balb/C mice.
Cancer Biol Ther, 2011, 11（6）:574-80.
［3］ Mosca PJ, Robertson GP. Augmentation of tumor-specific immunity
by upregulation of apoptotic melanoma cell calreticulin expression.
Cancer Biol Ther, 2011, 11（6）:581-583.
［4］ Obeid M. ERP57 membrane translocation dictates the immunogenicity
of tumor cell death by controlling the membrane translocation of
calreticulin. J Immunol, 2008, 181（4）:2533-2543.
［5］ Panaretakis T, Joza N, Modjtahedi N, et al. The co-translocation of
ERp57 and calreticulin determines the immunogenicity of cell death.
Cell Death Differ, 2008, 15（9）:1499-1509.
［6］ Cao C, Han Y, Ren Y, et al. Mitroxantronemediated apoptotic B16-F1
cells induce specific antitumor immune response. Cell Mol Immunol,
2009, 6:469-75.
［7］ Rizvi SM, Raghavan M. Mechanisms of function of tapasin, a critical
major histocompatibility complex class I assembly factor. Traffic,
2010, 11（3）:332-47.
［8］ Jessop CE, Tavender TJ, Watkins RH, et al. Substrate specificity
of the oxidoreductase ERp57 is determined primarily by its
interaction with calnexin and calreticulin. J Biol Chem, 2009, 284
（4）:2194-2202.
（责任编辑 李楠）