全 文 ：中国科学: 生命科学 2013年 第 43卷 第 10期: 897 ~ 904
SCIENTIA SINICA Vitae www.scichina.com life.scichina.com
引用格式: 陈少霞, 何航, 邓兴旺. 利用拟南芥杂交组合研究 siRNA与等位基因 DNA甲基化调控中的联系. 中国科学: 生命科学, 2013, 43: 897–904
Chen S X, He H, Deng X W. Allelic DNA methylation analysis in Arabidopsis hybrids Associated with siRNA. SCIENTIA SINICA Vitae, 2013, 43:
897–904, doi: 10.1360/052013-282
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS
论 文 中国知名大学及研究院所专栏 北京大学专辑
利用拟南芥杂交组合研究 siRNA与等位基因 DNA
甲基化调控中的联系
陈少霞, 何航*, 邓兴旺*
北京大学生命科学学院, 北京 100871
* 联系人, E-mail: hehang@pku.edu.cn; deng@pku.edu.cn
收稿日期: 2013-09-03; 接受日期: 2013-09-18
国家重点基础研究发展计划(批准号: 2012CB910900)和国家转基因生物新品种培育科技重大专项(批准号: 2010ZX08010-003)资助
doi: 10.1360/052013-282
摘要 近年来, 越来越多的实验结果表明, 表观遗传因子, 如 DNA 甲基化、小
RNA、组蛋白修饰等在杂种优势形成中起到重要作用, 然而对于这些表观遗传因子在
F1中遗传调控方式的认识仍很有限. 本实验室先前工作曾以拟南芥 C24和 Ler两种生
态型及其正反交子一代为材料, 运用新一代测序方法获得该杂交组合中 DNA 甲基化
及小 RNA单碱基分辨率的全基因组图谱. 本文进一步对这批数据中的等位基因 DNA
甲基化水平进行分析, 区分 DNA 甲基化遗传过程中的顺式与反式调控方式, 并发现
这两种调控方式均有重要的贡献. 研究发现, siRNA与DNA甲基化的两种调控方式有
密切联系, 尤其在 DNA 甲基化的反式调控中, F1中 DNA 甲基化变化程度越大, 该区
域内 siRNA富集程度越强, 二者可能存在某种调控机制. 通过等位基因表观遗传组的
分析研究杂交过程中DNA甲基化和小RNA遗传调控的规律, 为更好地理解杂种优势
机制提供了帮助.
关键词
单核苷酸多态性(SNP)
DNA甲基化
siRNA
顺式作用
反式作用
等位基因
DNA 甲基化作为一种重要的表观修饰, 在基因
表达、细胞分化以及系统发育过程中起着重要的调节
作用, 植物 DNA 甲基化模式的改变可以影响植物的
花期、育性、花和叶的形态等[1~8]. DNA甲基化具有
遗传效果 , Morgan 等人 [ 1 ]发现 , 控制小鼠 (Mus
musculus)体色的等位基因 DNA甲基化状态遗传到子
一代; 拟南芥(Arabidopsis thaliana)的研究也已证实
了 DNA甲基化可以忠实地遗传给子代[2,3]. 同时大量
研究发现[4~9], DNA甲基化在遗传过程中不是一成不
变的, 在生殖发育过程中, DNA甲基化状态是一个动
态变化的调节过程, 并且通过等位基因的 DNA 甲基
化分析可知, 这种调节包含顺式和反式的作用方式.
这种 DNA甲基化的重塑方式在不同的生物中存在差
异: 小鼠中, 两个亲本来源的基因组通过不同的去
DNA甲基化机制, 父本激活的去 DNA甲基化, 母本
削弱的 DNA 甲基化, 最后达到一个与两个配子都不
同的高度 DNA 甲基化状态 [4~7]; 最新的对斑马鱼
(Danio rerio)的研究表明, 生殖发育过程中父本基因
陈少霞等: 利用拟南芥杂交组合研究 siRNA与等位基因 DNA甲基化调控中的联系
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组 DNA甲基化模式保持稳定, 依靠母本基因组 DNA
甲基化的动态变化调节该过程[8,9]; 早期拟南芥胚胎
发育过程中母本基因组甲基化占主导作用, 随着胚
胎发育父本的贡献逐渐增大, 这一过程与 siRNA 相
关[10], 而生殖发育完成后, 亲本来源的基因组 DNA
甲基化状态在不同的组织器官中基本稳定; 小鼠等
位基因差异 DNA 甲基化研究, 表明顺式作用元件很
大程度上影响了 F1 中等位基因差异[11]; 在拟南芥、
水稻(Oryza sativa)、番茄(Solanum lycopersicum)等物
种中也开展了等位基因差异 DNA 甲基化的研究, 并
分析了影响这些差异的顺式作用和反式作用的比例,
指出了 siRNA与这种差异的相关性[12~18].
DNA 甲基化常与 siRNA 通路共同作用, 以构建
或保持染色体的螺旋或松弛状态, 一些 20~24 nt 的
siRNA 通常通过调节特定位点的 DNA 甲基化状态,
间接调控基因转录 . RNA 指导的 DNA 甲基化
(RNA-directed DNA methylation, RdDM)首次发现于
植物系统 [19], 指内切核糖核酸酶 DICER LIKE3
(DCL3)产生的24 nt siRNA[20], 通过与含有PIWI结构
域的 ARGONAUTE4(AGO4)结合 , 来指导 DRM2
(domains rearranged methyltransferase 2)的活性[21~23],
从而催化 DNA 从头甲基化. 水稻的实验数据支持等
位基因上 siRNA 的差异表达可能介导等位基因差异
DNA 甲基化[12]; 对拟南芥和斑马鱼的研究, 也充分
证实了 24 nt 的 siRNA 的表达与 DNA 甲基化正相
关[8,14].
本实验室利用新一代测序方法, 在拟南芥 Ler和
C24的杂交组合中获得了全基因组 DNA甲基化和小
RNA图谱, 分析了基因组水平DNA甲基化和小RNA
的变化以及它们的联系[17]. 本文通过进一步分析杂
交子一代中等位基因上的DNA甲基化水平和小RNA
水平, 研究调控 DNA 甲基化的顺式和反式作用, 并
探索 siRNA在这两种调控中扮演的作用.
1 材料与方法
1.1 材料
本文的实验材料和测序原始数据为本实验室的
前期研究[17]获得, 原始数据存于 NCBI的测序数据库
(登录号: GSE24658).
1.2 C24与 Ler间核苷酸多态性鉴定
C24的基因组被切割为 38983个 3 kb片段, 利用
Blastn[24]比对到 Ler 基因组上, 得到 38921 个最佳比
对结果, 其中 301个片段的结果比对在非同一条染色
上, 1117 个片段比对在 Ler 基因组的重复序列区域,
在经过过滤后的 37503 个片段的比对结果中得到
586902个单核苷酸多态性(single-nucleotide polymor-
phism, SNP)位点. 将 Ler 上对应位置的碱基替换为
C24的基因型, 作为 C24生态型的参考基因组.
1.3 小 RNA测序
获得 Illumina 测序数据后, 先进行质量控制: 去
掉接头序列、N的比例大于 10%的序列、质量值小于
5的碱基占全长比例超过 50%的低质量序列, 剪切掉
序列 3′端质量值小于 5的部分, 最后保留 16 bp以上
的测序数据. 用 bowtie分别比对到 Ler和 C24的基因
组上[25], 不允许错配, 根据 SNP 标签分离出两个亲
本来源的测序数据. 本实验中, 小 RNA 的表达量以
每 200 bp内小 RNA的序列数作为标准, 以 20 bp步
移(step)在基因组上移动, 计算出每 200 bp的区间Ler
和 C24来源的小 RNA的表达量.
1.4 DNA甲基化测序
获得测序数据后, 采用 1.3小节的方法进行质量
控制, 去掉低质量和接头序列. 使用 bismark 软件将
序列比对到 Ler 和 C24 的基因组上[26], 根据 SNP 标
签分离出两个亲本来源的测序数据. 本实验中, 以
DNA 甲基化序列数除以 DNA 甲基化序列和未 DNA
甲基化序列数的总和作为衡量单个 C/G位点 DNA甲
基化程度的标准, 并计算出有 4 个以上序列覆盖的
C/G DNA甲基化程度, 应用 R语言中的“binom.test”
负二项分布检验方法检测每个 C/G 在 Ler 和 C24 间
的差异DNA甲基化情况, 挑取 P<0.05, 且DNA甲基
化程度差值大于 0.1 认为是差异 DNA 甲基化位点.
应用“Wilcox.test”秩检验, 检测以 20 bp 步移在基因
组上移动, 每 200 bp的区间 Ler和 C24来源的 DNA
甲基化差异程度, 挑取 P<0.05, 且 DNA 甲基化程度
差值大于 0.1 认为是差异 DNA 甲基化区间(differen-
tial methylated regions, DMR).
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2 结果与讨论
2.1 利用 C24 与 Ler 基因组有效地分析等位基因
DNA甲基化和小 RNA水平
C24和 Ler是两种拟南芥生态型, 它们的基因组
中存在大量 SNP[27~29], 这是本实验设计的可行性基
础. 将 C24 的基因组序列分为 38983 个 3 kb 长度的
片段, 利用 Blastn 比对到 Ler 基因组上, 去除重复序
列区域, 在 37503片段中共发现 586902个 SNP, 平均
约 200 bp 存在一个 SNP, 而其中 53.1%都为“C/T”
(C/T, G/A, T/C, A/G)型 SNP, 与水稻比例接近[12].
运用新一代测序方法, 在拟南芥 C24和 Ler两种
生态型及其正反交子一代 FLC 和 FCL 的组合中, 获
得大量这一杂交组合中全基因组单碱基分辨率的
DNA甲基化及小 RNA数据(网络版附表 1). DNA甲
基化测序数据中落在 SNP 上的序列数为 C24:
7149819(4.81%), FCL: 8238223(5.52%), FLC: 7257946
(5.29%)和Ler: 6931506(5.21%). 将 4个材料中均不低
于 4 条序列覆盖的 C/G 位点挑出进行研究, 共有
523278个位点, 其中CG, CHG和CHH分别为 117928,
108727和 296623个. 而小RNA测序数据中落在 SNP
上的序列数为 C24: 613731(3.00%), FCL: 1825776
(7.63%), FLC: 1872542(7.83%)和 Ler: 785619(3.80%).
说明本实验获得了充分的测序数据以进行等位基因
表观遗传分析.
利用基于 bowtie 比对算法的 bismark[26], 将 F1
中的 DNA甲基化测序序列分别比对到 C24及 Ler基
因组上, 从而获得等位基因上的不同 DNA 甲基化水
平. 同样将亲本中 DNA 甲基化测序序列分别比对到
两个基因组上, 发现 C24中有 17.33% (7149819中的
1239415条)的测序序列比对到Ler基因组上, Ler中有
6.60%(6931506 中的 457407 条)的测序序列比对到
C24 基因组上, 说明本实验寻找等位基因 DNA 甲基
化的差异方法具有较高的准确性(网络版附表 2). 亲
本 C24与 Ler之间 CG型 DNA甲基化水平有一定差
异, 而 CHG 和 CHH 型 DNA 甲基化水平基本一致.
F1 中基因组整体 DNA 甲基化水平与亲本保持一致
(图 1A).
2.2 子代 DNA甲基化的顺式作用与反式作用
在遗传过程中, 不仅亲本的基因组序列信息会
保留到子代基因组中, 亲本的表观遗传信息也会以
不同方式传递至子代中[2,30]. 本研究中, 父母本中均
检测到 DNA甲基化修饰的位点, 绝大多数在 F1中也
遗传了 DNA 甲基化修饰(FLC 中 94.5%, FCL 中
94.8%); 而对于仅在一个亲本中检测到 DNA 甲基化
修饰的位点, 大约一半在 F1中也遗传了 DNA甲基化
修饰: C24中无 DNA甲基化, Ler中有 DNA甲基化的
位点, FLC中 49.47%, FCL中 49.4%被 DNA甲基化;
C24中有 DNA甲基化, Ler中无 DNA甲基化的位点,
FLC中 37.26%, FCL中 38.09%被 DNA甲基化(网络
版附表 3); 至于在两个亲本中均未检测到 DNA 甲基
化修饰的位点, 在 F1中检测到 DNA甲基化修饰 FLC
中仅为3.64%, FCL中为3.62%, 而且考虑到亲本中检
测深度不够的情况, 说明了在全基因组水平 DNA 甲
基化修饰信息的遗传是基本稳定的. 进一步, 比较了
亲本中 DNA 甲基化水平与 F1中相同基因组来源的
DNA 甲基化水平的差异, 共有 2.77%~3.18%的胞嘧
啶位点在亲本与 F1 中 DNA 甲基化水平有差异, 在
CG, CHG和 CHH 3种 DNA甲基化中, 亲本与 F1中
DNA 甲基化水平有差异的位点占不低于 4 个读长
(reads)覆盖的胞嘧啶位点比例分别为 2.19%~2.48%,
3.49%~4.00%和 2.68%~3.16%(图 1B和网络版附图 1).
在较为稳定地遗传亲本表观遗传组信息的前提
下, F1中的DNA甲基化水平会受众多因素的调控, 从
而动态地影响个体的生长发育, 因此在一系列实验
中都发现了 F1中大量位点DNA甲基化水平相对于亲
本的变化[12,31,32]. 将任一 F1与亲本比较 DNA 甲基化
水平存在差异的胞嘧啶位点集合起来, 在 CG, CHG
和CHH 3种类型中分别发现了 28727, 24181和 50555
个此类胞嘧啶位点. 其中一些 DNA 甲基化水平的差
异是由顺式作用引起的, 即由父母本基因组序列的
不同而导致的 DNA甲基化水平差别, 并在 F1中保留
这种差别; 而另一些 DNA 甲基化水平的差异则是反
式作用的结果, 即由反式作用因子的调控导致 F1 中
DNA甲基化水平变化. 通过将 F1中等位基因DNA甲
基化的差异与父母本之间相同位点 DNA甲基化的差
异做比较, 可以有效地将这两种作用区分(图 1C). 将
这 2 种差异值进行比较, 基于负二项分布检验, P＜
0.05 且 DNA 甲基化程度的差值大于 0.1 的认为有反
式作用参与调控, 否则认为属于顺式作用调控. 通过
此方法发现, FLC和FCL中CG类型 60.19%和 59.59%
的 DNA甲基化差异是由顺式作用所引起, 而 39.81%
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图 1 Ler与 C24正反交子一代中的 DNA甲基化调控模式
A: 亲本和子一代中 C, CG, CHG及 CHH型平均 DNA甲基化水平; B: 亲本中 DNA甲基化水平与 F1中相同基因组来源的 DNA甲基化水平
的差异位点所占比例; C: CG, CHG和CHH类型DNA甲基化差异位点的热图. P示亲本中等位基因上Ler与C24的DNA甲基化水平差异; FCL
示FCL材料中等位基因上分别由Ler与C24来源的DNA甲基化水平差异; P-FLC示亲本中的DNA甲基化水平差异与 FLC中的差异相减. 在
P-FCL与 P-FLC列中, 黑色部分示顺式作用, 红色或绿色部分示反式作用
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和 40.41%的DNA甲基化差异是反式作用参与的结果,
而 CHG与 CHH的 DNA甲基化差异中, 反式作用所
占比例更高, 分别在 FLC 和 FCL 中占 65.05%与
64.23%, 75.66%与 74.65%(图 1C, 网络版附表 4), 说
明因为不同 DNA 甲基化类型调控方式不一样, 其在
遗传过程中的调控模式也有区别. 网络版附图 2显示
了 F1中的顺式作用与反式作用的例子.
2.3 siRNA可能参与子代 DNA甲基化水平的调控
DMR 被认为与基因表达的调控有着密切的联
系[12], 以 20 bp 的步移在整个基因组上移动, 在每
200 bp的区段(window)内采用 Wilcox秩检验的方法
来检测父母本之间以及 F1的等位基因之间的DNA甲
基化差异区域. 通过这一方法, 获得父母本之间的差
异DNA甲基化区域有 55759(28374个C24
DNA 甲基化差异区域数量分别为 39338(26244 个
C24
C24
行研究: (ⅰ) 在父母本之间 DNA 甲基化差异, 同时
在 F1的等位基因之间 DNA甲基化差异, 并且 2种差
异有着相同的方向; (ⅱ) 在父母本之间 DNA甲基化
差异, 而在 F1的等位基因之间 DNA 甲基化无差异;
(ⅲ) 在父母本之间DNA甲基化无差异, 而在 F1的等
位基因之间 DNA 甲基化差异. 其中第一类仅受顺式
作用调控, 而后两类仅受反式作用调控, 这样的区分
为分析 2种调控模式的差别提供了便利, 这 3类区域
的数量在 FCL 中分别为 9452, 37499 和 21078, FLC
中分别为 10171, 36635和 21473 (网络版附表 5).
siRNA属于影响 DNA甲基化的反式作用因子之
一, 它可以通过 RNA 介导的 RdDM 指导基因组的
DNA甲基化修饰[19], 因此可以通过小 RNA测序的结
果研究差异 DNA 甲基化区域与 siRNA 表达的联系.
选取上文所述 3类区域中亲本 Ler的 DNA甲基化大
于 C24的 DNA甲基化水平, 或者 F1中 Ler等位基因
的 DNA甲基化水平大于 C24等位基因的 DNA甲基
化水平的位点, 在每一类区域中按照 Ler 的 DNA 甲
基化大于 C24的 DNA甲基化的位点所占比例分为 5
组, 5组从 50%~60%直到 90%~100%, 代表 Ler等位
基因 DNA甲基化大于 C24等位基因 DNA甲基化的
程度依次增强(图 2A). 发现, 随着 DNA 甲基化差异
程度的增加, 第一类区域内的 siRNA 数量无显著变
化, 但都显著高于基因组平均水平, 说明在顺式作用
调控中差异 DNA 甲基化区域总有大量 siRNA 富集,
并暗示这些 siRNA可能并不影响差异DNA甲基化水
平的遗传; 而在第二类、第三类区域内的 siRNA数量
随着差异程度的变高都显著上升, 暗示 F1中 DNA甲
基化的变化与 siRNA的大量富集可能有因果关系(图
2A). 进一步 , 对 F1 中这三类区域内等位基因上
siRNA 的数量进行了比较, 观察 siRNA 丰度差异与
DNA甲基化水平差异的关系, 图 2B中统计了每类差
异DNA甲基化区域中, Ler来源 siRNA占据比例大于
75%的区域所占的百分比, 发现在顺式作用调控的区
域内, 等位基因 siRNA 丰度的差异与等位基因 DNA
甲基化水平的差异呈正相关, 暗示在这样的区域内,
siRNA 与 DNA 甲基化同样为顺式作用调控; 而在后
两类受反式作用调控的区域中, 等位基因 siRNA 丰
度的差异与等位基因 DNA 甲基化水平的差异无关,
并且与基因组等位基因 siRNA 差异的平均水平相当,
暗示在反式作用调控的 DNA 甲基化中, siRNA 可能
是反式作用因子之一, 而其本身不受反式作用调控.
将第一类区域与第三类区域进行比较, 可以发现对
于亲本中 DNA甲基化水平差异的区域, 其 F1中是否
仍保留一致的差异取决于亲本中 siRNA 丰度. 当亲
本中 siRNA丰度的差异与亲本中DNA甲基化水平差
异一致时, 说明该区域受顺式作用调控, F1中的DNA
甲基化水平将会保留这种差异; 当亲本中 siRNA 丰
度的差异与亲本中 DNA 甲基化水平差异不一致时,
说明该区域受反式作用调控, F1中的 DNA 甲基化水
平会受反式作用因子调控而改变. 图 2C 中分别显示
了这两类区域受不同调控作用的例子.
3 结论
本实验重点研究了全基因组单核苷酸分辨率的
2个拟南芥亲本 C24和 Ler以及正反交子一代中等位
基因的 DNA 甲基化变化. 首先, 观察到全基因组平
均水平的 CG, CHG和 CHH的 DNA甲基化程度分别
在大约 25%, 10%和 5%的水平(图 1A), 亲本与 F1中
基本保持稳定. 而在 4个材料中均不低于 4条序列覆
盖的胞嘧啶共有 523278 个, 并且亲本 C24 及 Ler 中
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的 DNA 甲基化序列大部分都比对到自身基因组上
(80.50%和 96.12%), 说明本实验测序数据可以有效
并准确地进行等位基因 DNA甲基化水平分析.
通过等位基因 DNA甲基化水平的分析, 发现 F1
中遗传了亲本的大部分 DNA 甲基化修饰 (最低
96.00%, 最高 97.81%, 图 1B). 对 F1与亲本 DNA 甲
基化水平差异的位点, 通过比较等位基因 DNA 甲基
化差异与父母本 DNA甲基化差异程度的方法进行分
析, 利用系统聚类方法, 获得 F1中 DNA 甲基化水平
变化的模式, 可以显著地区分顺式作用与反式作用
的模式, 在 CG 型 DNA 甲基化中顺式作用为主导
(60.19%), 而在 CHG 与 CHH 型 DNA 甲基化中反式
作用占较高比例(75.66%, 图 1C, 网络版附表 4).
结合小 RNA测序的数据发现, F1及亲本的 DMR
图 2 差异 DNA甲基化区域与 siRNA差异表达
A: 差异 DNA甲基化区域内 siRNA的丰度. X轴示 Ler来源 DNA甲基化高于 C24来源 DNA甲基化的位点的区域所占比例, Y轴示区域内每
200 bp的 siRNA丰度, 对照组示 DNA甲基化没有差异的区域; B: 差异 DNA甲基化区域内 siRNA的差异表达. X轴示 Ler来源 DNA甲基化
高于 C24来源 DNA甲基化的位点的区域所占比例, Y轴示 Ler来源 siRNA占据比例大于 75%的区域所占比例, 蓝色与红色均示 F1中 siRNA
差异区域的比例, 绿色示亲本中 siRNA差异区域的比例; C: 同样亲本中DNA甲基化水平差异的区域. 因 siRNA调控方式不同, F1中的DNA
甲基化表现为顺式作用和反式作用. 蓝色柱示甲基化程度, 红色柱示 siRNA表达水平, 坐标示读长数量
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内 siRNA 明显富集. 具体对顺式作用的区域而言,
siRNA 总是具有较高丰度, 同样为顺式作用; 而对反
式作用的区域而言, siRNA 的富集程度与 DNA 甲基
化水平的变化程度正相关. 尤其发现, 对同样亲本中
的差异 DNA甲基化区域, F1的基因 DNA甲基化水平
是否变化与亲本中的 siRNA 丰度是否差异是一致的,
提示 F1中的DNA甲基化调控方式可能取决于该区域
内 siRNA与DNA甲基化的作用模式, 说明 siRNA可
能通过 RNA介导的 RdDM在 F1的DNA甲基化形成
中起到重要调控作用.
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Allelic DNA Methylation Analysis in Arabidopsis Hybrids
Associated with siRNA
CHEN ShaoXia, HE Hang & DENG XingWang
School of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China
Recently, accumulating evidence suggests that epigenetic factors including DNA methylation, small RNA and
histone modifications may play important roles in hybrid vigor in plants. However, knowledge about the mechanism
of these epigenetic factors in hybrids is still limited. Based on genome-wide DNA methylation and small RNA maps
of Arabidopsis thaliana Ler and C24 ecotypes and their reciprocal F1 hybrids in previous work, we further analyzed
allelic specific DNA methylation. Our study indicated that both trans- and cis-factors play roles in DNA methylation
regulations in hybrids. In addition, we found that siRNAs correlate with DNA methylation trans-regulations. High
degree trans-regulation DNA methylation is significantly concurrent with enriched siRNA regions. Our study
analyzed DNA methylation regulations associated with siRNAs in hybrids, and shed light on understanding the
mechanism of hybrid vigor.
SNP, DNA methylation, siRNA, cis-effect, trans-effect, allele
doi: 10.1360/052013-282