全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
四 聚 体 技 术 是 目 前 国 内 外 研 究 的 热 点， 其
核 心 技 术 就 是 在 主 要 组 织 相 容 性 复 合 体（Major
histocompatibility complex，MHC）I 类 分 子 重 链 末
端进行生物素修饰，以结合亲和素构建四聚体检测
收稿日期 ：2013-09-11
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31172304），辽宁省大学生创新项目（201311258009），大连大学本科生创新项目（2012029）
作者简介 ：刘筏，女，研究方向 ：动物分子免疫学 ；E-mail ：729652171@qq.com
通讯作者 ：高凤山，男，副教授，博士，研究方向 ：基因工程和动物分子免疫学 ；E-mail ：gfsh0626@126.com
烟台黑猪 SLA-I 重链基因末端生物素修饰及表达
刘筏  杨金刚  翟晓鑫  董宋鹏  高凤山
（大连大学生命科学与技术学院，大连 116622）
摘 要 ： 为构建烟台黑猪 SLA-2 重链基因偶合生物素化酶 BirA 底物肽（BirA substrate peptide，BSP）并研究其在 pET-28a
（+）中的表达，设计烟台黑猪 SLA-2-BSP 复合基因引物，PCR 扩增烟台黑猪 SLA-2-YTH-BSP 复合基因，并克隆至 pMD 19-T Simple
Vectorp，经酶切鉴定后将 SLA-2-YTH-BSP 复合基因与表达系统 pET-28a（+）链接，并转化到 BL21（Rosseta）菌进行诱导表达，
SDS-PAGE 检测目的蛋白。表达蛋白经过 Ni-NTA 亲和纯化，并经 SDS-PAGE 检测蛋白纯化效果。PCR 结果显示 SLA-2-BSP 大小为
900 bp，并成功克隆到 pMD 19-T Simple Vector，酶切鉴定大小为 876 bp，该基因链接到 pET-28a（+）并转化到 BL21（Rosseta）菌，
经诱导表达和 SDS-PAGE 检测目的蛋白的大小为 32.4 kD。目的蛋白以包涵体形式存在，纯化后蛋白纯度达到 90% 以上。成功构建
烟台黑猪 SLA-I 重链偶合生物素化酶 BirA 底物肽（BSP）的 pET-28a（+）的重组表达系，为下一步的 SLA-I 类分子四聚体研究鉴
定基础。
关键词 ： 烟台黑猪 SLA-2 重链基因 生物素化酶 BirA 底物肽 纯化
Biotinylated the Carboxyl Terminal of Heavy Chain of SLA-I from
Yantai Black Pig and Its Expression
Liu Fa Yang Jingang Zhai Xiaoxin Dong Songpeng Gao Fengshan
（College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622）
Abstract:  To construct the heavy chain of SLA-2 conjugated with the BirA substrate peptide（BSP）and express the recombinant
genes in pET-28a（+）for Yantai Black Pig（YTH）, a pair of primers to express the recombinant SLA-2-YTH-BSP was designed and the
recombinant SLA-2-YTH-BSP was amplified by PCR followed by sub-cloning the gene into pMD19-T Simple Vector. After identification by
cleavage with Nde I and Xho I, the SLA-2-YTH-BSP was ligated to pET-28a（+）and the recombinant plasmids was transformed into BL21
（Rosseta）to be induced to express followed by analysis of the expressing products by SDS-PAGE. The expressed interest of protein was purified
by Ni-NTA column and detected by SDS-PAGE. The PCR results showed that the length of nucleotides of SLA-2-YTH-BSP was about 900 bp
which was consistent with the calculated value. Then, the SLA-2-YTH-BSP with 876 bp was successfully inserted into the pMD-19-T Simple
Vector identified by cleavage with Nde I and Xho I, and then the genes were inserted into pET-28a（+）and transformed into Escherichia coli
BL21（Rosseta）. After induction, SLA-2-YTH-BSP was successfully expressed with the interest of protein about 32.4 kD. After purification,
the purity of the interest of the inclusion protein reached to 90%. It was concluded that the recombinant expressing system containing SLA-2
conjugated with BSP in pET-28a（+）was successfully constructed and the research would pave the base to construct tetramer in SLA class I.
Key words:  Yantai black pig SLA-2 Heavy chain gene BirA substrate peptide Purification
病毒 CTL（cytotoxic T lymphocyte）表位，从而放大
MHC I-peptide 的检测信号，有利于精确检测病毒的
CTL 表位［1］。目前，国内外分别构建了人［2］、鼠［3］、鸡［4］
等 MHC I 类分子四聚体，并筛选或证实了多种病毒
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期192
CTL 表位。然而，目前关于猪 MHC I 四聚体链构建
鲜有报道。猪的 MHC I 类分子也称为猪白细胞抗原
（Swine leukocyte antigen，SLA）I 类分子。课题组最
近报道了我国荷包猪 SLA-I 末端生物素化的研究，
并在 pET-21 成功进行了表达，从而开始了我国地方
品系猪 SLA-I 重链生物素修饰及表达的研究［5］。由
于我国有丰富的地方品系猪资源，有必要开展其他
地方品系猪 SLA-I 的相关研究。烟台黑猪是我国山
东省烟台地区的优质地方品系猪［6］，其重链 SLA-I
基因已经克隆，并具有特征性［7］。本研究拟在前期
研究的基础上，以国内品系烟台黑猪 SLA-I 类分子
SLA-2 功能基因为研究对象，采用分子克隆和基因
工程手段在体外构建我国地方品系猪 SLA-2 偶合生
物素化酶 BirA 底物肽的重组表达系，并在原核表达
系统 pET-28a（+）进行表达和纯化，为下一步构建
SLA-I/ 肽复合物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
重 组 质 粒 SLA-2-YTH01/ pMD 18-T 为 大 连 大
学 分 子 免 疫 学 实 验 室 构 建 保 存， 克 隆 载 体 pMD
19-T Simple Vector，表达载体 pET-28a（+）及菌株
Escherichia coli. BL21（Rosseta）来自于中国科学院
微生物研究所 ；Escherichia coli Top10 菌株为大连大
学分子免疫学实验室保存。
低 分 子 量 蛋 白 Marker、DL2000 DNA Marker、
Nde I、Xho I 和 DNA 纯化试剂盒购于大连宝生物公
司 ；IPTG、胰化蛋白胨、甘氨酸酵母提取物、丙烯
酰胺氨苄青霉素、过硫酸胺、二甲基甲叉双丙烯酰胺、
TEMED、三羟甲基氨基甲烷等购自上海生工。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计 烟台黑猪 SLA-I 重链分子 SLA-2
四聚体链表达引物设计 PS-21F ：5-GGAATTCCATA
TGGGCCCGCATTCCCTGAGCTATTTC-3（ 下 划 线 部
分为 Nde I 酶切位点）；P21BSPR ：5-AGTCTCGAGTT
AACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATAT
GATGCAGGCTGCCGTCCCATCTCAGGGTGAGGGGC-
3（下划线部分为 Xho I 酶切位点，斜体部分为 BSP
序列）。
1.2.2 SLA-2-YTH-BSP 亚克隆 以重组质粒为模板，
以 PS-21F/P21BSPR 为引物对，扩增基因链 SLA-2-
YTH-BSP，PCR 条 件 为 94 ℃，5 min ；94 ℃，30 s ；
56℃，45 s ；72℃，90 s ；30 个循环，72℃延伸 10
min，PCR 结束后进行核酸电泳，琼脂糖凝胶浓度为
1.0 %，电泳结束后在凝胶成像仪下检查 PCR 扩增
产物，然后用 DNA 胶回收试剂盒回收目的片段。
回 收 之 后 SLA-2-YTH-BSP 产 物 连 接 pMD19-T
Simple 并转化大肠杆菌 Top10，37℃过夜培养。按
照碱裂解法提质粒，酶切筛选阳性克隆并保存菌种，
阳性克隆送到生物公司进行测序。
1.2.3 表达载体的构建 将筛选的阳性克隆提质粒，
经 Nde I、Xho I 双酶切，凝胶纯化回收 SLA-2-YTH-
BSP 基因 。将 SLA-2-BSP 与 pET-28a 连接，转化至
感受态细胞 BL21（Rosseta），涂布到含有卡那霉素
的平板中，在 37℃培养箱中过夜培养，挑选菌落接
种至 LB 培养基（含卡那），从培养的菌液中提取质
粒，经 Nde I、Xho I 双酶切筛选阳性质粒，阳性质
粒 命 名 为 pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP， 见 图 1，
并送生物公司测序。
GAGCTCAAT-SLA-2-YTH-BSP-GTATACATATAGAGGAA
Xho I
Dra III5127
Terminator
T7 promoter
f1 origih
pET-28a+/SLA-2-YTH-BSP
5369 bp/876 bp3994-4807
Kan
lac I
ori 3286773-1852
4903-5358
Nde I rbs
酶切位点分别为 Nde I（CATATG），Xho I（CTCGAG）
图 1 构建 pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP 重组质粒
1.2.4 SDS-PAGE 检测 SLA-2-YTH-BSP 蛋白表达
将 阳 性 重 组 菌 100 μL 接 种 5 mL LB 液 体 培 养 基，
37 ℃、170 r/min 振 荡 培 养 直 至 OD600 在 0.4-0.6 之
2014年第1期 193刘筏等 ：烟台黑猪 SLA-I 重链基因末端生物素修饰及表达
间。加入 1 mol / L IPTG 5 μL，诱导 5 h 后，取菌液
1 mL，12 000 r/min，2 min，去上清，菌体经 TE 溶
解并经 5×SDS 样品 buffer 处理，SDS-PAGE 测蛋白
表达［8］。
1.2.5 SLA-2-YTH-BSP 蛋 白 纯 化 SLA-2-YTH-BSP
表达蛋白按照文献报道进行［9］。表达后的 SLA-2-
YTH-BSP 重组菌（Rosseta）按 1% 比例接种后扩大
培养，IPTG 诱导重组蛋白表达，5 000 r/min，4℃离
心收集细胞并洗涤后，冰浴超声裂解细胞，高速离
心后分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE，检测重组
蛋白表达形式。收集包涵体并用 1% Triton X-100 洗
涤后，用 8 mol/L 尿素溶解，离心收集上清液，透析
过夜后，进行 Ni-NTA 亲和层析，用 60 mmol/L 咪唑
充分洗去杂蛋白后，用 0.3 mol/L 咪唑洗脱目标融合
蛋白，SDS-PAGE 检测纯化蛋白。
2 结果
2.1 SLA-2-YTP-BSP链的PCR扩增
经 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳检测到一条约
900 bp 的条带，与理论设计值 898 bp 大小相符，见
图 2。
2.4 序列分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP
经序列测定分析，pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP
与原序列 100% 同源，另外，序列末端含有 BSP 序
列部分，见图 5。
2.5 SDS-PAGE分析pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP
中的表达
将 经 鉴 定 阳 性 的 重 组 表 达 菌 加 入 IPTG 至 1
mmol/L，然后再诱导培养 5 h，SDS-PAGE 检测目的
基因的表达情况，结果发现重组菌诱导后，与对照
相比表达出约 30 kD 的条带，与理论值 32.4 kD 相符，
而且相对表达含量达到 40% 以上，见图 6。
2.5 SLA-2-YTH-BSP蛋白纯化
SLA-2-YTH-BSP 超 声 裂 解 后， 检 测 主 要 以 包
涵体形式存在，包涵体经过 Ni-NTA 柱纯化，SDS-
PAGE 检测，结果（图 7）显示纯化后的蛋白大小约
为 30 kD，与全菌表达蛋白大小一致。另外，蛋白
的纯度达到 90% 以上，符合进行下一步蛋白结构和
功能研究的要求。
3 讨论
本项目前期研究中，已经成功克隆了烟台黑
1 M
2000
bp
1000
750
500
250
100
898
bp
M ：DNA 分子量标准 DL2000 ；1 ：PCR 扩增 SLA-2-YTH-BSP
图 2 SLA-2-YTH-BSP 的 PCR 扩增结果
2.2 SLA-2-YTP-BSP链亚克隆到pMD-19-T Simple
Vector
经连接转化后，挑取单菌落培养，用 Nde I、
Xho I 双酶切，电泳显示插入片段约 900 bp，与目的
片段 876 bp 相符合，见图 3。
2.3 SLA-2-YTP-BSP链亚克隆到pET-28a（+）
将与 pMD 19-T Simple 载体链接的重组质粒经双
酶切，回收后与 pET-28a（+）连接，转化至感受态
细胞 BL21（Rosseta），经双酶切鉴定发现插入片段
大小为 870 bp 左右，与理论值 876 bp 相符，见图 4。
1 M
2000
bp
1000
750
500
250
100
876
bp
2692
M ：DNA 标准 DL2000 ; 1 ：重组质粒双酶切鉴定
图 3 pMD-19-T Simple Vector/SLA-2-YTP-BSP 重组质粒
双酶切鉴定
bp
1000
2000
750
500
250
100
876
bp
M 1
䖭փ
M ：DNA 标准 DL2000 ；1 ：双酶切鉴定 pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP
图 4 重组质粒 pET-28a（+）/SLA-2-YTH-BSP 双酶切鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期194
猪 SLA-I 类分子功能基因 SLA-2，并已经在 DDBJ/
EMBL/GenBank 注册，获得序列号 AB672508，为进
行本研究奠定了基础［6］。经分析，所克隆烟台黑猪
SLA-2 共 1 119 bp，其中 75-896 位属于胞外区，编
码 274 个氨基酸残基（本研究为了提高 SLA-2 胞外
区结合多肽的延展性，实际表达了 275 个氨基酸）。
SLA-2 抗原多肽结合区结合抗原多肽后在细胞表面
与 CD8+ T 淋巴细胞的 T 细胞受体（T cell receptor，
TCR） 结 合， 形 成 MHC I-peptide-TCR 复 合 物。 为
了增加在体外检测的信号，需要借助生物素 - 亲和
素结合原理构建 MHC I 四聚体［10］。为此，需要在
SLA-2 胞外区末端加含有 17 个氨基酸的生物素化酶
BirA 底物肽（BirA substrate peptide）［11］，以结合生
物素，而一分子亲和素能结合 4 分子的生物素，从
而形成 SLA I-peptide 四聚体。四聚体主要用于检测
下划线部分分别表示 BSP 核酸序列和相应的氨基酸序列
图 5 SLA-2-YTH-BSP 序列
1 2 3 4 5 6 M
97.2
kD
66.4
44.3
14.3
ⴞⲴ㳻ⲭ
20.1
29.0
M ：蛋白分子量（低）；1 ：pET-28/ SLA-2-YTH-BSP 在 BL21 中未诱导表达 ；
2-6 ：pET-28/SLA-2-YTH-BSP 在 BL21 中诱导表达
图 6 SDS-PAGE 分析 pET-28（+）/SLA-2-YTH-BSP 中
的表达
1 M
32.4
kD
66.4
97.2
kD
44.3
29.0
20.1
M ：蛋白分子量（低）；1 ：pET-28/ SLA-2-YTH-BSP 经 Ni-NA 纯化蛋白
图 7 SLA-2-YTH-BSP 蛋白纯化
2014年第1期 195刘筏等 ：烟台黑猪 SLA-I 重链基因末端生物素修饰及表达
SLA I 限制性的抗原多肽或 TCR。需要指出的是，本
研究中 PCR 扩增 SLA-2-YTH-BSP 的序列长度为 898
bp，是包含了酶切位点和末端的保护性碱基，而酶
切后插入片段的长度为 876 bp。尽管 PCR 产物可以
直接酶切，与 pET-28a（+）连接，但连接的成功率
一般不高。为了增加连接的成功率，采用先把插入
片段克隆入克隆载体 pMD 19-T simple 的方法，经大
量扩增后，再将酶切回收后的插入片段连接入 pET-
28a（+），经酶切后，显示插入片段存在，证明连接
成功。但图中载体质粒显示有两条 DNA 带，其中下
面的条带应当为未酶切完全的重组质粒，可能是酶
量不足或质粒不纯所致，但并不影响主要结果。
本研究中采用 pET-28a（+）载体，是由于尝试
了其他表达载体后，发现 pET-28a（+）更适合 SLA-
2-YTH-BSP 的表达。前期研究中曾报道了我国另一
地方品系猪荷包猪重链基因偶合底物肽及表达研究，
其中用到了另一表达载体 pET-21a（+）［5］，二者具
有相同的酶切位点 Nde I 和 Xho I，不同的是 pET-21a
表达的外源基因不携带任何非相关序列，而 pET-
28a（+）表达的外源基因会在 5 端携带 6 个 His 的
标签，从而便于亲和纯化。本研究中经过 SLA-2-
YTH-BSP 与 pET-28a（+） 重 组 后 转 化 Escherichia
coli. BL21（Rosseta），经诱导表达后表达蛋白大小为
32 kD，与之前报道的大小一致［5］。另外，重组表达
质粒不仅经过酶切鉴定，也经过了测序，序列分析
结果表明插入序列与设计的 SLA-2-YTH-BSP 完全一
致。目的蛋白的相对表达含量达到了 40% 以上，可
以用于今后四聚体构建等需要大量表达蛋白的相关
研究。另外，由于 pET-28a（+）载体多克隆位点上
游带有 His 标签，因此可以利用 Ni-NTA 进行亲和纯
化。本研究中，重组蛋白 SLA-2-YTH-BSP 主要以包
涵体形式存在，说明表达蛋白主要存在于细胞质内。
收集包涵体蛋白，经过 Ni-NTA 亲和纯化，蛋白纯
度达到了 90% 以上，可以用于今后进一步的蛋白结
构和功能的研究。
4 结论
构建了烟台黑猪 SLA-I 重链基因末端生物素修
饰的重组表达载体，并获得表达蛋白，为进一步构
建 SLA-I-肽复合物，并展开四聚体研究奠定基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）