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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):112-120
DNA 甲基化是 DNA 甲基转移酶（DNA methylt-
ransferase，DNMTs） 将 S-2 腺 苷 蛋 氨 酸（S-2 aden-
osine methionine，SAM）上活化的甲基基团转移到
DNA 链中，是哺乳动物中最常见和研究得最为深入
的表观遗传修饰。而胞嘧啶 C-5 位点的甲基化（5-
甲基 - 脱氧胞苷，5mdC）是最主要的 DNA 甲基化形
式［1］，主要发生在 CpG 核苷酸序列中。人类基因组
中绝大多数散在分布的 CpG 位点为甲基化修饰，而
CpG 岛（定义为长度大约 1 kb，G+C 含量大于 55%
并以二核苷酸 CpG 形式出现）通常为非甲基化状态
（尤其与启动子区相关的 CpG 岛区域），并与基因的
表达密切相关［2］。DNA 甲基化异常主要包括整体基
因组和基因启动子区甲基化水平的改变，基因组甲
基化改变导致染色质稳定性降低，基因启动子区甲
基化改变则会干扰基因转录，使基因正常表达受损，
可引起细胞的异常增殖和癌变［3］。此外，DNA 甲基
收稿日期 ：2015-02-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81273126），广东省自然科学基金重点项目（S2012020010903），深圳市科技计划重点项目
（201201027），深圳市基础研究项目（JCYJ20130329103949656）
作者简介 ：黄新凤，女，副主任技师，研究方向 ：卫生毒理检验 ；E-mail ：hxf111@126.com
通讯作者 ：刘建军，女，研究员，研究方向 ：化学污染物致机体损伤的蛋白质组学及生物标志物 ；E-mail ：junii8@126.com
质谱技术在 DNA 甲基化研究中的应用
黄新凤  叶金波  刘建军
（深圳市疾病预防控制中心 现代毒理学重点实验室，深圳 518055）
摘 要 ： DNA 甲基化是最重要的表观遗传修饰之一，主要发生在哺乳动物基因组 CpG 核苷酸序列中的胞嘧啶 C-5 位点，并
与机体生长发育、转座子沉默、X 染色体失活及许多疾病的发生相关。但对 DNA 甲基化的形成、维持和重构的分子机制的认识是
有限的，需要从基因组水平寻找最优的 DNA 甲基化定性和定量分析方法，而质谱技术以高敏感性、高通量、高准确率、高分辨率、
快速且重复性好等优势在该研究领域具有较大的应用价值。介绍质谱技术在全基因组 DNA 甲基化和启动子区甲基化分析中的应用。
关键词 ： 全基因组 DNA 甲基化 ；启动子区甲基化 ；质谱 ；液相色谱
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.012
Application of Mass Spectrometric Technology in
DNA Methylation Study
Huang Xinfeng Ye Jinbo Liu Jianjun
（Key Laboratory of Modern Toxicology of Shenzhen，Shenzhen Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen 518055）
Abstract: DNA methylation is one of most important epigenetic modifications, which mainly occurs in carbon-5 position of CpG
nucleotide sequence in mammal genomes and relates to organism development, transposable silence, X chromosome inactivation and many
diseases. The understanding for molecular mechanism of DNA methylation formation, maintenance and reconstruction remain limited.
however, in order to find an optimal method for DNA methylation qualitative and quantitative analysis, mass spectrometric technology with high
sensitivity, good performance, high precision, high resolution and good repeatability, has a great value in the study of DNA methylation. In the
following, we will make a introduction of mass spectrometric technology application in whole genomic DNA methylation and promoter DNA
methylation study.
Key words: whole-genomic DNA methylation ；promoter methylation ；mass spectrum ；liquid chromatography
2015,31(11) 113黄新凤等 ：质谱技术在 DNA 甲基化研究中的应用
化还与机体衰老、转座子沉默、X 染色体失活及基
因印记的形成有关［1-3］。
近年来，DNA 甲基化成为了生命科学的研究热
点，研究方法不断发展，而以往建立在常规分子生
物学技术基础之上的研究方法存在某些缺陷，如克
隆和 PCR 扩增缺乏甲基转移酶，5mdC 不能保存下
来，且此修饰存在于 DNA 双链的大沟中而杂交技
术难以识别等。此外，基于亲和富集 / 剔除、甲基
化敏感的核酸内切酶消化或亚硫酸氢盐修饰的 DNA
预处理方法，已建立了一系列分析技术，它们能
与其他的研究方法联合检测 5mdC 标记的存在和位
点，例如测序、杂交、质谱检测、凝胶电泳和 PCR
等，它们在灵敏度、分辨率、重复性、误差、通量、
成本和定量的程度上存在差异［4，5］。质谱（Mass
spectrometry）以高敏感性、高通量、高准确率、高
分辨率、快速且重复性好而成为该领域研究的关键
技术，尤其在检测大样本的微量甲基化时，高灵敏
度、高通量和定量 DNA 甲基化分析方法是必需的，
质谱联合液相色谱（Liquid chromatogram）等技术在
这方面显示了巨大潜力。本文将分别阐述利用质谱
和色谱联合质谱技术研究 DNA 甲基化的方法。
1 启动子区的甲基化检测
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-
assisted laser desorption/ionization time of flight mass
spectrometry，MALDI-TOF-MS） 在 遗 传 学、 表 观 遗
传学和核酸研究领域应用广泛，如单核苷酸多态性
基因分型、突变检测、基因拷贝数变异和剪接变
异检测等［6］。结合碱基特异性酶切反应与 MALDI-
TOF-MS 检 测 原 理，Sequenom 公 司 的 MassARRAY
检测系统，是用于单核苷酸多态性分型和 DNA 甲基
化定量检测的技术体系，具备高通量的检测性能，
实现多重 CpG 位点的分析检测，可量化 <5% 的甲
基化改变［7］，能用于基因组任何区域（如启动子区）
或候选基因的 DNA 甲基化定量分析［8］。
如图 1 所示，基因组 DNA 经亚硫酸氢盐处理
后，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶（C → U），而
甲基化的胞嘧啶保持不变 ；设计 5- 端含 T7 启动子
的引物扩增 DNA 双链，扩增片段长度一般为 200-
600 bp，碱性磷酸酶混合液去除反应体系中游离的
核苷酸 ；再加入 T7 RNA 聚合酶等进行体外转录和
碱基特异性的酶切反应 ；Nanodispenser 从 384 孔板
裂解反应液中取微量溶液转入基质芯片上，质谱仪
GCGC
GC
GC
GC GC
GC
CG CG
CG CG
GC
GCGC
GCGC
CGCG
UGUG
TGTG TG TG
ACAC AC AC
ACAC AC AC
ACAC
AC
ACU
U
Int.
#3 #1 #2 m/z
+16
U-specific cleavage
In-vitro transcription
PCR
T7T7
Bisulfite Treatment
genomic DNA
+32+16
U U
U
#3
#2
#1
U
UG UG CGCG
CGCG
GCGCGC GC GC GC
CGCG CG CG
图 1 MassARRAY 检测启动子甲基化的基本原理［9］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11114
收集质谱图［9］。
扩增产物完全的碱基特异性裂解可产生适合
MALDI-TOF-MS 检测范围的短小核苷酸片段，该系
统所配备的数据库含参考序列的信息，由特定的算
法计算序列的分子量改变并搜索相应的参考序列，
从而发现序列的变化。由于 C → T 变化致使反义链
中 G → A 变化，含有甲基化 CpG 位点的片段与不
含甲基化 CpG 位点的片段每个 CpG 位点之间分子量
相差 16 Da。计算获得核苷酸片段中每个 CpG 单位
的相对甲基化率（单个 CpG 单位可含有多个 CpG 位
点），EpiTYPER 软件对各 CpG 位点或 CpG 单位进
行甲基化定量分析。EpiTYPER 系统提供先进方便
的 DNA 甲基化定量分析手段，提供数字和图像注释
工具并将实验数据与检测的核苷酸序列相匹配［9，10］
（图 2 和图 3）。
MassARRAY 系统突出特点是能以极高的精确度
左侧纵轴代表样品编号，上部横轴代表核苷酸序列，颜色由深红色至深黄色表示甲基化程度的逐步升高，灰色表示未检出，每
一圆圈所代表的 CpG 位点与相应的核苷酸序列相对应
图 2 MassARRAY 系统检测结果［10］
0%
0
Case 1
Case 1
Case 3
Case 4
Case 5
Case 5
Case 7
Case 12
Case 13
Case 16
Case 6
Case 2
25
1 2 4 6 8 11 13 14 17 19 21 2326 27 28 31 34 3740 41 44 45 47 48
50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375
ZAR1
100% not analyzed:
快速进行基因型识别，直接获得序列的甲基化信息。
研究者们对该技术平台不断优化，例如，采用不同
碱基特异性的酶切反应，得到不同组合的核苷酸片
段，目的序列的覆盖率增加，95% 以上的序列能够
被检测出［11］。Thomson 设计了统计分析软件分析来
自 EpiTYPER 数据以检验亚硫酸氢盐处理的效率的
高低［12］。Wong 等［13］用干燥的血样提取高纯度的
DNA 并进行高效的亚硫酸氢盐修饰，降低了样本要
求，使该技术应用范围扩大。
该方法也存在一定不足，如碎裂的核苷酸片段
中，只有单个碱基对的改变能够被软件推测出，更
加复杂的突变和多态性则难以检出［14］。CG 位点是
常见的突变位点，甲基化的胞嘧啶经过脱氨基变成
胸腺嘧啶，此多态性不能被亚硫酸氢盐处理所辨别，
会导致 DNA 甲基化检测的错误［15］。SNP 的存在会
改变核苷酸片段断裂的模式和分子量，而 EpiTYPER
不能分辨出，会导致结果不准确。当核苷酸片段的
分子量超出软件分析（1.5-7 kD）范围时，此核苷
酸片段上一系列 CG 位点的信息难以获得 ；多个 CG
位点同时出现在同一核苷酸片段上且需要同时分析
时，导致分辨率下降。PCR 和亚硫酸氢盐处理也是
实验误差的重要来源，获得纯净的 PCR 产物对于检
测和分析至关重要。复杂组织中细胞类型的异质性
或同质细胞表观遗传性状的不一致使得分析变得复
杂，结果可靠性也会下降［16］。
Agrawal 等［17］ 利 用 MassARRAY 技 术 平 台 对
80 例急性骨髓性白血病病人骨髓样本的肿瘤抑制
基因 C/EBP 基因启动子区分析，发现该基因启动
子发生高甲基化且基因表达水平下降，说明该病的
发生可能与此基因启动子高甲基化有关。Raval［8］
发现，因启动子高甲基化导致死亡相关蛋白激酶 1
（DAPK1）基因沉默几乎发生在所有的慢性 B 淋巴
2015,31(11) 115黄新凤等 ：质谱技术在 DNA 甲基化研究中的应用
细胞白血病病例中。在乳腺癌危险性评价［18］，神经
管缺陷的危险因素研究［19］，慢性 B 淋巴细胞白血
病［8］、结直肠癌［20］和孕妇产前无创性诊断［21］等方
面，MassARRAY 技术平台都已有研究成果。
除 MassARRAY 技术平台外，根据质谱对核苷
酸的分析依赖其电荷状态的特性，Tost 等［22］开发
了一种称作 GOOD assay 分析样品的准备方法。亚硫
酸氢盐处理样品和甲基化 PCR 扩增目的片段后，碱
性磷酸酶消化未反应的底物。因为引物 3- 末端碱基
有磷硫桥，底物为 α-S-dNTP，延伸产物为磷硫骨架，
而用磷酸二酯酶只能消化正常的磷酸骨架，磷硫骨
架却能抗消化。烷基化中和磷硫骨架链后用 MALDI-
TOF-MS 分析。该方法只需少量样品，可实现多通路
检测，但实验步骤较多，并利用酶消化会致检测样
品纯度降低、杂质多，还需建立标准曲线，不利于
推广应用。基于肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）
与 DNA 结合的特异性高、不易被核酸酶降解、杂交
后热稳定性好并能在低盐状态下稳定存在等优点，
Schatz 等［23］建立了一种 PNA 探针杂交结合 MALDI-
TOF 检测研究 CpG 岛甲基化的技术，亚硫酸氢盐处
理 DNA 样品后，扩增目的片段，并固定于固相介
质上，与含有甲基化位点的 PNA 探针杂交，去除非
特异性结合后，洗脱下来的探针直接进行 MALDI-
TOF-MS 分析，分子量的大小与序列文库进行比对，
获得序列的甲基化信息。该方法能多重平行分析多
个甲基化位点，所需样品量小，但需设计探针，并
横轴代表各核苷酸片段，纵轴代表被检样本，颜色由深红色至深黄色表示甲基化程度的逐步升高，灰色表示未检出，
聚类分析得出各核苷酸片段在不同样本间的甲基化程度差异
图 3 MassARRAY 检测结果统计学分析［9］
0 0.2 0.6 1
Value
PR
A
M
E:
17
PR
A
M
E:
15
PR
A
M
E:
10
PR
A
M
E:
14
PR
A
M
E:
12
PR
A
M
E:
11
PR
A
M
E:
01
PR
A
M
E:
06
PR
A
M
E:
02
PR
A
M
E:
09
PR
A
M
E:
07
M
A
G
EE
1:
10
M
A
G
EE
1:
08
M
A
G
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1:
05
M
A
G
EE
1:
02
M
A
G
EE
1:
07
M
A
G
EE
1:
13
M
A
G
EA
3:
26
M
A
G
EA
3:
17
M
A
G
EA
3:
10
M
A
G
EA
3:
23
G
A
G
ED
2:
09
G
A
G
ED
2:
15
G
A
G
ED
2:
13
G
A
G
ED
2:
05
G
A
G
ED
2:
08
G
A
G
ED
2:
14
G
A
G
ED
2:
03
G
A
G
ED
2:
01
G
A
G
ED
2:
18
G
A
G
ED
2:
19
G
A
G
ED
2:
22
G
A
G
ED
2:
17
G
A
G
ED
2:
23
M
A
G
EA
3:
03
M
A
G
EA
3:
08
M
A
G
EA
3:
20
M
A
G
EA
3:
21
M
A
G
EA
3:
01
M
A
G
EA
3:
09
M
A
G
EA
3:
07
M
A
G
EA
3:
12
M
A
G
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1:
08
M
A
G
EE
1:
03
C
EA
C
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M
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04
C
EA
C
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M
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N
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R
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03
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B
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07
SE
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P1
N
B
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10
SE
R
P1
N
B
5:
01
SE
R
P1
N
B
5:
09
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EA
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M
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02
C
D
H
5:
02
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2
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2
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1
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5
A
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A
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P1
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8
A
Q
P1
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5
A
Q
P1
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2
A
Q
P1
:1
7
TN
A
:0
4
TN
A
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8
TN
A
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7
M
G
P:
05
M
G
P:
01
M
G
P:
03
C
D
H
5:
07
C
D
H
5:
08
C
D
H
5:
04
C
D
H
5:
01
TN
A
:0
1
Color Key
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11116
建立标准曲线，实验步骤较多，限制了该技术的推广。
2 全基因组 DNA 甲基化检测
研究基因组 DNA 甲基化水平的思路主要有 ：3H
标记的甲基供体 S-腺苷甲硫氨酸（3H-SAM）与 DNA
反应后，检测结合于 DNA 上的同位素标记的甲基基
团［24］，该方法需要的 DNA 样品量大，结果不能直
接反映 DNA 双链中 5mdC 的比率 ；基于 DNA 甲基
化限制性内切酶的 5mdC 含量检测［25］，实验步骤繁
琐且效率较低 ；应用特异性的抗 5mdC 抗体进行间
接免疫荧光法检测，所需样品量大且精确性较低［26］；
酶解或酸解 DNA 双链为单个核苷，以色谱技术分离
检测，或在色谱分离的基础上质谱检测。以色谱技
术检测基因组 DNA 甲基化水平的方法主要有薄层色
谱（TLC）［27］、气相色谱（GC）［28］、液相色谱（HP-
LC）［29，30］、 毛 细 管 电 泳（CE）［31］ 等， 此 类 方 法
可提供准确且重复性较好的结果，但也有不足。薄
层色谱实验的花费较少，但准确度不高且需大量的
DNA 样品 ；气相色谱实验数据准确，但核苷是强极
性的化合物，进样前需进行衍生化处理 ；液相色谱
能弥补气相色谱方法的缺陷，但紫外检测器不能选
择性地检测化合物，这要求将 DNA 水解后所有的核
苷达到全部分离，或至少使目标化合物与其他核苷
完全分离，且紫外检测器灵敏度有限，DNA 样品量
要求大 ；毛细管电泳的分离效率较高，但 DNA 水解
样品中的基质对实验的重复性影响很大。
色谱串联质谱法分析基因组 DNA 甲基化的基本
原理是用酶或酸分解 DNA 链为单个核苷，色谱分离
的基础上采用质谱检测器测定核苷含量，样本需要
量少，灵敏度高，质谱技术的发展使大规模、高通
量、全自动检测分析成为可能。Rossella 等［32］报道
的基于色谱串联质谱技术分析全基因组 DNA 甲基化
水平的方法主要有气相色谱串联质谱（GC-MS）和
液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS），Zhang 等［33］报
道采用亲水相互作用色谱串联质谱（HILIC-MS），但
此方法使用很少。由于 DNA 核苷为强极性化合物，
因此采用 GC-MS 方法分析全基因组 DNA 甲基化时
需要对核苷进行衍生化处理，衍生化步骤不仅繁琐，
而且衍生化不充分会给结果带来极大误差。HPLC-
MS/MS 方法具有高灵敏性和选择性，且不需对核苷
进行衍生化处理，给全基因组 DNA 甲基化定量分析
带来了新的解决思路，实验步骤也相对简单（主要
包括 ：优化色谱条件和质谱参数，用脱氧胞苷和 5-
甲基脱氧胞苷梯度标准溶液建立标准曲线，再将水
解并超滤去蛋白的 DNA 样品上样检测，参照标准曲
线获得甲基化率的大小）。现对 HPLC-MS/MS 检测全
基因组 DNA 甲基化的方法概括，见表 1。
采用不同的色谱仪、色谱柱及质谱仪可建立不
同的检测方法，各种方法各具特点。表 1 中的方法
强调提高敏感度（减少分析所需的 DNA 量，降低检
出限）和通量，新方法的建立也以高通量、快速准
确、价廉为目标。近年来，由于超高效液相色谱大
幅度改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度，
速度和分离度分别是传统 HPLC 的 9 倍和 1.7 倍，在
低流速下，增加了峰浓度，提高离子源的效率，使
灵敏度至少提高了 3 倍［33］，并在液相色谱和质谱联
用领域得到广泛发展。担负分离作用的色谱柱是色
谱系统的关键，对色谱柱的要求是柱效高、选择性
好、分析速度快，为提高分析的灵敏度并与质谱联用，
发展了窄径柱、毛细管柱和内径 <0.2 mm 的微径柱，
能增加灵敏度，减少样品量，通过使用长柱达到高
分离度，容易控制柱温。质谱检测器方面，Yang 等［34］
报道，三重四极杆质谱检测器比离子阱质谱检测器
灵敏度更高，可避免连续分析中离子丧失的影响。
DNA 甲基化定量也是该技术的关键之一，有
文献报道直接采用外标法定量并建立标准曲线来度
量甲基化率，另一些文献则采用昂贵的同位素内标
15N3-dC 和
15N5-dG
［36］、［15N3］2-dc 和［methyl-d3，
ring-6-d1］-5-methyl-2-dc
［29］，及生物合成的稳定同
位素［U-15N］-dc 和［U-15N］- 5mdC［43］，它们分别
代表 2dC 和 5mdC。Bagnyukova 等［44］ 报道，HPLC-
ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）检测同位素 31P
和 189Os（分别代表 dC 和 5mdC）的量来定量甲基化
比率。此外，有学者［34-45］采用 5mdC 和 2- 脱氧鸟
苷（dG） 物 质 的 量 比 值 法（［5mdC］/［dG］ 比 值
法）进行定量，这种方法的原理是假设 DNA 双链
中［5mdC］+［dC］=［dG］，DNA 分 子 中 5mdC 与
dG 物质的量的比值便可作为全基因组 DNA 甲基化
计算公式的替代，不需考虑检测和分析中物质的损
失，因为分子和分母比值分析会以相同的方式相互
2015,31(11) 117黄新凤等 ：质谱技术在 DNA 甲基化研究中的应用
表
1
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谱
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注
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量
限
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11118
影响和抵消，可避免高成本同位素内部标准。但该
方法在原理上也存在缺陷，即由于 DNA 分子中部分
dG 碱基会发生修饰，形成如 O6-甲基化、C8-羟基
化等修饰鸟苷，使得 DNA 分子中［5-mdC］+［dC］
≈［dG］，给准确性带来误差。总体来说，目前报
道的 HPLC-MS/MS 技术分析全基因组 DNA 甲基化水
平的方法几乎都未找到合适的内标来校正仪器误差
并进行准确定量［36］。因此，还需进一步发展新型的
基于液相色谱串联质谱检测全基因组 DNA 甲基化的
方法。
现阶段，已有学者采用 HPLC-MS/MS 研究疾病
与全基因组 DNA 甲基化的关联，例如，Lim 等［43］
用 HPLC-ESI/MS 研究无症状的大肠腺癌患者外周
血白细胞全基因组 DNA 甲基化状况，发现全基因
组 DNA 甲基化可能是大肠腺癌早期的致病因子。
Bagnyukova 等［44］研究发现，遗传毒性致肝癌物二
乙基氨基芴致雄性 SD 大鼠肝脏组织全基因组 DNA
甲基化水平大幅度下降，但未在雌性小鼠的肝脏组
织中发现此特征，而且雄性和雌性 SD 大鼠的肾脏
中也不存在此特征。Choi 等［45］用 HPLC-ESI/MS 检
测 Vitamin B-12 缺乏致 SD 大鼠结肠 DNA 甲基化水
平改变，初步认为这可能是肿瘤的诱因。
3 结语
DNA 甲基化作为重要的基因表达调控机制，不
仅是当前生命科学和医学的研究热点，也在毒物的
安全性评价中具有广阔的应用前景，其改变在许多
毒物的毒理学机制中起着重要作用。近年来，已有
学者研究毒物引起的 DNA 甲基化状态改变来探讨
其可能的毒理学机制。例如，Tao 等［46］研究发现，
饮用水氯化消毒副产物（DBPs）引起的全基因组
DNA 和 c-myc 基因低甲基化的能力与它们致小鼠和
大鼠肾脏和肝脏肿瘤及促进肿瘤发展的能力相关联。
Pereira 等［47］的研究表明，蛋氨酸作为甲基供体可
抑制二氯乙酸（DCA）诱导的 B6C3F1 小鼠全基因
组 DNA 甲基化水平下降，并抑制肝脏肿瘤进展，但
未改变 DCA 所诱导的肝脏 / 体重比值和过氧化物酶
增加，说明蛋氨酸对肝癌的抑制与其对 DNA 低甲基
化的抑制有关，也说明了 DNA 低甲基化对于 DCA
诱导的肿瘤发生是至关重要的。DNA 甲基化研究对
毒物早期潜在毒效应的探测、实验浓度组的设置、
剂量 - 反应曲线的有效定义和种属之间合适的浓度
外推具有重大意义，将促进对毒物毒理学机制的研
究，加快毒理学的发展［48］。在大规模基因组方面探
索 DNA 甲基化特征，质谱以其高通量、高准确性和
高灵敏度的特点将发挥着重要作用。熟悉其优势和
不足是利用该技术平台的基础，随着自动化、微型
化技术的发展和软件算法的改进，质谱技术将在高
灵敏度、高精确性和低成本的基础上开展高通量的
研究。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）