全 文 ：·综述与专论· 2012年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-07-21
基金项目 : 北京林业大学林木育种国家工程实验室开放课题（FOP2010-6）
作者简介 : 张丽 , 女 , 硕士 , 研究实习员 , 研究方向 : 植物生物技术育种 ; E-mail:lesley119@163.com
农杆菌介导的葡萄转化研究进展
张丽1,2 王敬东1,2 宋玉霞1,2
（1 北京林业大学 林木育种国家工程实验室，北京 100083 ；2 宁夏农业生物技术重点实验室，银川 750002）
摘 要 : 综述近年来以农杆菌介导法将外源基因转化葡萄的研究进展及基因型、再生途径、农杆菌菌株、菌液浓度、侵染时间、
共培养及抗生素等对葡萄遗传转化的影响，并指出当前存在的问题及研究趋势。
关键词 : 葡萄 农杆菌 遗传转化 进展
Progress on Genetic Transformation of Grape
Mediated by Agrobacterium
Zhang Li1,2 Wang Jingdong1,2 Song Yuxia1,2
（1National Engineering Laboratory of Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing 100083 ；2Ningxia Key Laboratory for Agro
Biotechnology，Yinchuan 750002）
Abstract: The advances in transgenic research by Agrobacterium-mediated transformation on grape were reviewed, and the factors
affecting the gene transformation efficiency, including the genotypes, Agrobacterium strains, the concentrations and times of infection, co-
cultivation conditions and antibiotics. Some existed problem and researching trend were further pointed.
Key words: Grape Agrobacterium Transformation Advance
葡萄（Vitis vinifera L.）在植物学分类中属于葡
萄科（Vitaceae Lindley 或 Ampelideae Kunih）葡萄属
（Vitis L.）的藤本浆果。葡萄是一种重要经济植物，
其营养价值高，市场需求量大，多年来其栽培面积
和产量一直处于各类水果的首位。长期的育种实践
证明，常规杂交育种方法虽对提高葡萄品质与产量
方面有一定的提高，但这种传统育种方法时间长，
且后代稳定性较差，难以有效地改良品种，存在很
大的局限性。随着生物技术的发展和广泛应用，转
基因技术因具备目的性强、周期短等优点，为改良
葡萄的性状、选育葡萄新品种提供了新的手段。自
20 世纪 90 年代初 Mullins 等首次获得转基因葡萄植
株以来，进一步证明了转基因在葡萄育种上的可行
性，葡萄的遗传转化研究得到了迅速的发展。现就
近年来国内外以农杆菌介导为主要手段在葡萄的遗
传转化方面所取得的进展作一简要综述，并指出当
前存在的问题及研究趋势，以期为葡萄基因工程育
种提供参考。
1 葡萄中导入的外源目的基因
葡萄的育种目标主要在提高抗性和品质两个
方面［1］。目前葡萄转化涉及的基因已经从报告基
因转向抗病、品质改良和促进生根的转基因研究上
来［2-17］。其中，葡萄病毒外壳病毒基因研究包括葡
萄扇叶病毒（GFLV）、葡萄病毒 A 运动蛋白正反义
基因、番茄斑点枯萎病毒（TSWV）及葡萄铬黄花叶
病毒（GCMV）的外壳蛋白（Coat protein）［18］。抗葡
萄真菌病害基因研究包括抑制白粉病的几丁质酶基
因（RCC2）、提高对灰霉病（Botrytis cinerea）抗性
的葡萄芪合酶基因（Vst1）［9］；提高对顶枯病（Eutypa
lata）抗性的菜豆还原酶基因（VR-ERE）［10］，还有
核糖体失活蛋白基因（RIPs）、类奇甜蛋白基因（Vvtl
1）、抗菌肽基因和多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因
（PGIP）、苯丙氨酸裂解酶基因（PAL）和 CuZn SOD
2012年第2期 15张丽等 ：农杆菌介导的葡萄转化研究进展
基因等。抗葡萄细菌病害基因研究包括对冠瘿病表
现出一定抗性的抗细菌肽（如溶菌蛋白、Shiva-I、
防卫素）基因、肽基 - 甘氨酸 - 亮氨酸基因（PGL）
进行遗传转化［12,13］。此外，有关果色发育（UFGT
基因及其调节基因、花葵素生物合成基因和花色苷
甲基转移酶基因）、糖积累转运（转化酶基因），蔗
糖转运体基因（Vvsuc11, Vvsuc12 和 Vvsuc27）、己
糖转运体基因（Vvht1，Vvht2）及无核化（雄性不
育基因）等与品质改良的相关基因的转化研究也有
一定的进展［16,19,20］。随着更多的功能性强的新基因
被不断克隆，转基因技术在葡萄抗病、品质改良以
及其他方面将有更广泛的应用。
2 影响葡萄遗传转化的主要因素
外源基因导入植物细胞的方法主要有农杆菌
介 导 法（Agrobacterium-mediated）［21-24］、 基 因 枪 法
（Biolistic）［25］及电击法等。其中，农杆菌介导法是
以农杆菌的 Ti 质粒或 Ri 质粒为载体，将外源基因
整合到植物细胞的染色体 DNA 上，从而实现外源基
因向植物体的转化。利用此方法的优点在于外源基
因能够稳定地整合到宿主植物的基因组中并得到表
达，且可直接用植物叶片等器官进行操作，方便进
一步培养与转基因植株的构建。该方法因具备成本
低、拷贝数低、重复性好、转育周期短及能转化
较大片段等优点而受到推崇，目前已成为葡萄等果
树遗传转化的主要方法。在应用农杆菌介导法转化
葡萄的过程中，高效稳定的再生体系和有效的侵染
及选择方式是影响转化成功与否的重要前提与基础。
2.1 基因型
高效稳定的植物再生体系是农杆菌侵染后的受
体材料能否高效再生的关键，其中基因型是影响植
株再生能力的最直接因素。因而选择再生性强、稳
定性好的品种及基因型对葡萄遗传转化成功十分重
要。研究表明，无论是对胚状体再生体系的建立还
是对直接分化再生系统的建立而言，不同葡萄品种
间均表现出了再生能力的差异。Clog 等［26］曾对砧
木葡萄品种 Kober5BB、S04、41B、LN33 和栽培种
黑比诺、霞多丽进行了叶片再生的研究，认为植物
基因型、培养基组成等因素对再生有重要影响。其
中仅砧木品种获得了再生植株，Kober5BB 诱导率
最高，为 38.6% ；栽培种均没有获得不定芽再生。
Peros 等［27］通过对 25 个传统栽培种和 7 个杂交种进
行快速繁殖、器官再生研究，发现不同基因型之间
茎尖节数和生根数差异明显，叶片不定芽再生在 20
个品种中平均再生率为 36.7%（其余 10 个品种诱导
率为 0%），其基因型之间差异也较明显。
2.2 受体材料
除基因型外，以不同再生途径的外植体作为
与农杆菌直接接触的转化受体，也是影响再生频率
的主要因素之一。目前葡萄再生主要有胚状体发
生、器官直接分化及顶端分生组织发生 3 种途径。
Mullins 等［28］认为转化植株获得的数量依赖于再生
系统的效率，胚状体细胞是遗传转化的良好受体材
料。在转化时，胚状体细胞再生体系不仅可使细胞
与农杆菌充分接触，产生大量的转化细胞，还能和
抗生素更好的紧密接触，减少逃脱筛选的细胞，且
胚状体源于单个细胞，因此胚状体发生途径更易
产 生 均 一 的 转 化 克 隆。Krastanova 等，Mauro 等 和
Scorza 等分别于 1994 年，1995 年证明了胚性细胞比
叶片、叶柄和茎段等有较高的再生能力。从目前的
研究来看，胚状体的发生多数是由花药和合子胚产
生［29］；对于叶片，叶柄而言不易再生出体细胞胚 ；
而卷须更难产生体细胞胚。
鲍雪珍等［30］以葡萄“胜利”品种的花药、花
丝为外植体，采用附加 2 mg/L 6-BA 和 0.5 mg/L 2,4-D
的改良 B5 培养基诱导葡萄胚性愈伤组织，获得的胚
性愈伤组织有很强的胚胎发生能力，在分化培养基
上能产生大量的胚状体，并分化出苗。卢炳芝等［31］
以葡萄品种“玫瑰香”的花丝在含有 2 mg/L 6-BA 和
1mg/L 2,4-D 的 B5 培养基上诱导获得结构紧密的胚
性愈伤组织，诱导率达 30%；张克忠，孙仲序等［22,32］
以葡萄花药、花丝诱导出的胚性愈伤组织作为转化
受体材料，分别将苏云金杆菌内毒素蛋白基因和甜
菜碱脱氢酶基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞，最终
获得了转基因植株。支玉玺等［33］以中国野生华东
葡萄（V. pseudoreticulata）感白粉病株系广西 -2 的
花药为试材进行了体细胞胚诱导与再生体系的建立 ,
并探讨了次生胚的诱导与畸形萌发胚状体正常成苗
的方法，提供了葡萄转抗病基因功能验证及遗传转
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期16
化研究的再生技术体系。 Vidal 等和 Gambino 等［34,35］
分别对欧洲葡萄品种的花药和子房在体胚诱导过程
中的若干因素进行了优化，进一步验证了葡萄的花
药与子房为外植体可诱导出胚性愈伤组织。此外，
研究还发现葡萄体细胞可保持较长时期的发生能力，
这一优点为葡萄遗传转化创造了有利条件［36］。但体
细胞胚的诱导过程繁琐、诱导时间较长，不仅与外
植体类型相关还受到基因型的限制，因而诱导率普
遍较低，最终的成苗率小于 50%。这些因素限制了
胚状体发生途径的进一步发展。
与胚状体发生途径相比，器官直接分化再生途
径中外植体细胞可越过脱分化产生愈伤组织而直接
分化出不定芽，因而获得再生植株周期短、再生芽
频率较高。器官直接分化再生途径的研究起步较早，
研究报道也相对较多，以叶片、茎段、子叶等为外
植体，都通过直接分化再生途径获得不定芽实现了
植株的再生［37-44］。Stamp 和 Colby 以欧洲葡萄的叶柄、
叶片诱导不定芽，叶柄的诱导率可达 90%。Mullins
等［28］以胚与下胚轴为外植体，均获得了含有报告
基因的转化植株。但由于直接再生出的不定芽其再
生起源常常是多细胞，因此转化后获得的再生芽出
现较多的嵌合体，获得的转基因植株大多也为嵌合
体［45,46］。
茎顶端分生组织细胞因具有特定的生理功能，
许多再生困难的葡萄品种可通过茎尖组织的进一
步繁殖而获得，随着近年来微体繁殖技术的进一
步成熟，在短时间内可获得大量的繁殖材料，且
不存在明显的体细胞无性突变，使得分生组织作
为转化外植体成为可能。目前以顶端分生组织作
为转化的外植体在太阳花、豌豆等植物上已有广
泛应用，在葡萄上的研究仍较少，Dutt 等［47］以微
茎尖为受体材料，初步得到了稳定的遗传转化植
株纯合体，比例达到 1%。
2.3 菌株
农杆菌的类型和株系不同，其侵染能力和染
色体背景也不相同。因此 , 不同材料存在最合适或
最为敏感的农杆菌菌株。目前采用根癌农杆菌介导
的葡萄遗传转化的报道最多，转化获得成功的多以
LBA4404、GV2260 和 GV3101 等侵染力较强的菌株
为主［48,49］。
2.4 侵染及共培养
农杆菌菌液浓度及受体材料在菌液中的侵染时
间均影响转化效果。菌液的浓度过高或浸泡时间太
长易导致受体材料被繁殖过多的农杆菌感染致死，
浓度过低或侵染时间过短不利于农杆菌附着在外植
体上，T-DNA 不易进入，使得转化效率降低。共培
养时间是影响外源基因从农杆菌向植物细胞转化的
重要因素。因为农杆菌附着后并不能立刻转化 , 只
有在创伤部位生存 16 h 以上后的菌株才有转化功能。
但共培养时间太长 , 农杆菌过度生长易导致植物细
胞受害。从已有的报道来看，双子叶植物的最佳共
培养时间通常位 2-3 d。关心等［50］通过对 Rossi 等
所描述的方法加以改进后，认为外植体在 OD600 为 0.4
农杆菌菌液中侵染 10 min、共培养 3 d 转化效率最高。
2.5 抗生素
农杆菌介导的遗传转化中常使用两类抗生素 ,
一类是选择性抗生素 ；另一类是抑菌性抗生素。卡
那霉素作为选择剂在当今遗传转化体系中应用最为
广泛。多数研究表明，葡萄组织对卡那霉素较敏
感［28,51,52］。转化后以高浓度卡那霉素筛选可引起葡
萄外植体褐化死亡，抑制葡萄转化细胞进一步生长。
而持续以低浓度卡那霉素筛选，使得一些非转化细
胞进一步分化生长成为假阳性植株，不能获得较好
的筛选效果。因此，针对这个问题，前期诱导阶段
以施加低浓度卡那霉素进行初步筛选，分化阶段再
进一步提高 Km 浓度的做法是可获得转化植株，提
高转化率的有效手段。
此外，在农杆菌介导的遗传转化中，如何减少
外植体在共培养后受农杆菌过度污染的机会也是转
化顺利进行的关键环节之一。共培养结束的同时，
农杆菌在外植体伤口处也完成诱发肿瘤的过程。若
不去除外植体表面的农杆菌，外植体将被农杆菌污
染，正常生长将受到严重影响，不利于转化。适宜
浓度为既要有效控制农杆菌生长又要对转化体的抑
制作用最小。目前葡萄转化中使用最多的是抑制农
杆菌的生长则使用头孢霉素（Cef）效果较好。
3 葡萄遗传转化存在的问题及对策
获得外源基因稳定表达的转基因植株，以及培
育性状优良的转基因葡萄新品系是葡萄基因工程研
2012年第2期 17张丽等 ：农杆菌介导的葡萄转化研究进展
究的最终目的。尽管转基因葡萄研究已经取得了进
步，但还存在着许多有待解决的问题。
3.1 嵌合体的产生
葡萄再生频率低一直是葡萄遗传转化进展缓慢
的原因之一。其中以器官为外植体虽然可获得较高
的再生频率，但转化植株易产生嵌合体，而以胚状
体发生途径更易产生均一的转化克隆，但目前体细
胞胚诱导过程繁琐、诱导过程漫长，诱导率普遍较低，
最终影响转化效率。如何进一步有效地提高体细胞
胚的诱导率，减少嵌合体的发生，探索更有利于遗
传转化的再生受体系统仍是今后的研究重点。
3.2 基因沉默
在转基因进程中，基因沉默是一个普遍存在的
现象，其严重影响了葡萄基因工程的应用效果。研
究发现 DNA 甲基化、重复序列、反式失活、共抑制
和位置效应都会引起基因沉默。目前虽然采取了一
些如用农杆菌介导的转化法对外源基因进行修饰，
消除甲基化及应用 MAR 等控制基因沉默的策略，但
这些方法对于提高外源基因在葡萄中的表达水平效
果尚不明显。深入系统地研究基因沉默的机制，寻
找克服基因沉默的手段，对促进葡萄基因工程的产
业化具有重要意义。
3.3 进展不平衡
当前葡萄转基因研究表现为 : 遗传转化研究的
多，进入大田试验的少 ；单基因转化的多，多基因
转化的少 ；获得抗病的转基因植株多，品质改良及
其他方面的转基因植株少。因此，采用基因工程手
段培育具有实际生产价值的多抗、丰产、优质葡萄
新品种，必将成为今后的研究热点。
3.4 性状联合改良研究薄弱
从遗传上讲，改良生物体的单个目标性状可能
会对其他性状产生影响，如提高葡萄对某种病毒病
的抗病性 , 有存在降低果实口感及品质的风险。从
需求上讲，未来的转基因葡萄不仅具有高抗性，同
时应具有优良的品质。因此，加强多基因联合转化
研究，研究多基因调控的转基因将是葡萄基因工程
的重要方面。
3.5 潜在生态危害
研究表明，外源基因的插入会导致生物体内基
因组的不稳定，发生各种劣性变异，甚至出现危害
人类的性状。就转基因植物而言，会产生新型有害
生物类型、外源基因逃逸对其他植物的基因污染、
产生新的毒性或过敏原等潜在生态伤害。因此，应
加强转基因植物特异表达的研究，尽可能避免转基
因植物对人与生态环境伤害。
3.6 基因清除技术的应用
抗生素抗性的转基因产品是引起公众对转基
因产品的安全性质疑的原因之一。如何代替使用抗
生素筛选，或消除标记基因，是未来转基因研究的
潜在方向［53］。 Luo 等［54］ 利用外源基因清除技术
（gene-deletor）使在特异启动子的作用下的 FRT/FLP
及 loxP/Cre 基因，在植物发育的特定时期和组织中，
可将外源基因和自身清除，产生非转基因食品。此
外，Luo 等［55］利用此技术，引入热激蛋白启动子
HSP18.2，获得了不含选择标记基因的转基因烟草。
Fladung 等［56］在杂交山杨中整合进 uidA 基因，成功
清除了抗性基因 npt Ⅱ和选择标记基因 bar。
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（责任编辑 狄艳红）