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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
一直以来，人们认为 D-氨基酸只在细菌细胞壁
的组成中起重要作用，但最近的一些分析技术研究
表明，在真核生物中也存在着一些高浓度的 D-氨基
酸，如 D-丝氨酸、D-天冬氨酸等。这些氨基酸在生
物体内也发挥着重要的生理作用［1，2］，研究发现，
在哺乳动物中 D-丝氨酸与记忆和学习有关［3］，D-天
冬氨酸与激素分泌功能有关［4］，而在垂体前叶，胰
腺和血浆中 D-丙氨酸浓度的波动与激素调节有关［5］。
一些 D-氨基酸的存在与某些疾病有关，研究人员发
现，在精神分裂症患者的血清和脊髓液中 D-丝氨酸
的浓度较低［6］，而在肌萎缩性侧索硬化症患者的神
收稿日期 ：2012-08-21
基金项目 ： 河北省自然科学基金项目（C2011205045） ，河北省科技支撑项目（10205521D） ，河北省留学回国人员资助项目（20100705） ，
河北省高等学校科学技术研究青年基金项目（2011102） ，河北师范大学博士启动基金项目（L2009B13）
作者简介 ：李辉欣，女，硕士研究生，研究方向 ：生物制药 ；E-mail ：hui_xin126@126.com
通讯作者 ：徐书景，女，副教授，硕士导师，研究方向 ：食品生物技术 ；E-mail ：josyokei@163.com
D-氨基酸检测方法研究进展
李辉欣  鞠建松  张琳琳  徐书景 
（河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024）
摘 要 ： 自然界中存在 20 种基本氨基酸，除甘氨酸外都有两种互成镜像的对映体 D-型和 L-型。长期以来，人们认为 D-氨
基酸仅存在于微生物中，参与构成细胞壁肽聚糖层。但随着分析方法的发展，人们相继在多种生物体中（包括人体）发现了多种 D-
氨基酸，D-氨基酸才引起人们的高度重视，并意识到它们在医药、农药和食品等的组成中起着重要作用。D-氨基酸检测方法还需
要不断发展与完善，以便更好地分析和认识 D-氨基酸的重要作用。主要介绍酶法、气相层析法、高效液相法及生物传感器等检测
方法。
关键词 ： D-氨基酸 检测 高效液相 生物传感器
Research Progress on the Detection Methods of D-amino Acids
Li Huixin Ju Jiansong Zhang Linlin Xu Shujing
（College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024）
Abstract:  As we all know there are 20 different kinds of basic amino acids in nature. In addition to glycine, each amino acid has two
enantiomers D-and L-type. D-amino acids have long been considered to be unique to microorganisms, which utilize some D-amino acids to
construct the peptidoglycan layer of their cell wall. However, several D-amino acids have been detected in many organisms including mammals
because of the advance of analytical techniques in the last two decades. It was realized that D-amino acids might play significant roles in living
things and as the important component of medicine, pesticide and food. In order to get a better analyzing and understanding the important role of
D-amino acids, the analytical methods for D-amino acids detection are constantly developing. Herein, several methods include enzymatic method,
Gas chromatography, HPLC and biosensor assay were introduced.
Key words:  D-amino acid Detection HPLC Biosensor
经胶质细胞中其浓度较高［7］。此外，精子畸形患者
精浆和精子中 D-天门冬氨酸的浓度比正常人低［8］。
食品中 D-氨基酸的浓度常取决于原材料中初始
D-氨基酸的含量。D-丙氨酸，D-谷氨酸，D-天冬氨
酸，D-丝氨酸，D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，D-精氨酸
和 D-亮氨酸等已被认定为各种食物中的天然成分，
在发酵产品中我们也可以检测到 D-氨基酸，它们是
在天然加工过程中产生的（D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、
D-天冬氨酸存在于奶酪、酸奶、酒和醋等中）［9，11］。
另外，在食物中 D-氨基酸的出现通常与蛋白的消化
下降有关，从而影响必需氨基酸的生物利用度，也
2013年第1期 69李辉欣等 ：D-氨基酸检测方法研究进展
就是最终影响食物的营养价值［9］。因此，D-氨基酸
的浓度与 D/（D+L）的比率可以作为评价食物质量
的指标（识别食物是否掺假）和成熟的分子标记。
然而，D-氨基酸的含量也与细菌感染有关。细菌细
胞壁中含有肽聚糖和多糖交联形成的多肽，其中 D-
丙氨酸是主要的成分 ；其次是 D-谷氨酸。因此，D-
丙氨酸和 D-谷氨酸含量可以作为食物是否受到细菌
污染的标志［10］：当果汁被细菌感染时可以检测到大
量的游离的 D-丙氨酸，牛奶在 4℃放置 1 h 后游离
的 D-丙氨酸急剧增长［11］。除了这些特定的例子之外，
所有氨基酸的 D-型同分异构体还可以作为食物中掺
假的推论依据 ：添加水解蛋白来掩饰低的营养成分
或不合理的工艺流程都会导致 D-氨基酸含量增加，
而在一些婴幼儿奶粉中发现大量 D-天冬氨酸就是由
于 L-型同分异构体在高温喷雾干燥或灭菌时经外消
旋产生的［11］。
有鉴于此，必须建立快捷而精确的 D-氨基酸检
测方法。本文主要介绍几种主要的用于检测 D-氨基
酸的方法。
1 D- 氨基酸检测方法
1.1 酶法
酶法是一种简单、实用的分析方法，由于酶的
活性中心是不对称环境，有利于识别消旋体。在一
定条件下，酶只能催化消旋体中的一种对映体发生
反应而生成不同化合物，从而达到对映异构体分离
和检测的目的。
D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）
是 一 种 以 黄 素 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸（Flavin adenine
dinucletide，FAD）为辅基的典型黄素酶。DAAO 催
化 D-氨基酸生成相应的 α-酮酸和氨。在分子氧存在
的条件下，还原性 FAD 被氧化，并将氧转化为过氧
化氢 ；亚氨基酸水解成为 α-酮酸和氨，当体内存在
过氧化氢时，α-酮酸即发生脱羧产生相应的酸。在
过氧化物与过氧化物酶存在的条件下，N-乙基 -N-
（2-羟基 -3-磺丙基）间甲苯胺钠盐（TOOS）与 4-氨
基安替比林（4-Aminoantipyrine，4-AAP）氧化偶合，
形成稳定的紫色或蓝色物质，该物质在 550 nm 下有
吸收峰，根据 550 nm 下吸光度的变化可以定量测定
D-氨基酸的含量。
RCHNH2COOH + E-FAD → RC=NHCOOH +
E-FADH2
E-FADH2 + O2 → E-FAD + H2O2
RC=NHCOOH + H2O → RCOCOOH + NH3
但 D-氨基酸氧化酶并不能作用于所有的 D-氨基
酸，来自猪肾的 D-氨基酸氧化酶对 D-天门冬酰胺，D-
半胱氨酸，D-谷氨酸等没有催化活性，而来自三角
酵母的 D-氨基酸氧化酶则对 D-酪氨酸，D-谷氨酸，D-
赖氨酸等没有催化活性［12］。因此，对于这些类型的
D-氨基酸则需要更专一的酶来检测。Fisher 等［13］发
现阿尔茨海默病人脑灰质中 D-Asp 明显高于正常人，
利用 D-天门冬氨酸氧化酶（DAspO）催化 D-天门冬
氨酸和 D-谷氨酸氧化生成草酰乙酸和 α-酮谷氨酸，
然后在苹果酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的作用下与
NADH 反应生成 L-苹果酸和 L-谷氨酸，通过 NADH
的变化，可测定出人血液中 D-氨基酸的含量［14］。
酶学检测方法具有很强的选择性，即只对 D-同
分异构体有活性。这种方法价格便宜，效率高，适
宜于从混合样品中特异的专一的检测出 D-氨基酸。
1.2 气相层析法
气相层析法先将氨基酸衍生为易气化的物质，
利用气态试样中各组分在两相间的分配系数不同进
行分析。目前有硅烷化、酯化和酰化等衍生法［15］。
由于样品需要脱盐处理，衍生处理时还要求无水及
高温条件，而且用一根色谱柱无法测定全部氨基酸，
故此法在氨基酸分析检测中应用并不广泛。
1.3 高效液相法
高效液相法是根据各组分在两相间分配系数不
同，经过反复的吸附—解吸过程对其进行分离检测。
液相色谱法根据作用机理的不同又分为如下几种 ：
手性衍生化试剂、手性固定相分离、手性流动相和
柱切换系统。
1.3.1 手性衍生化试剂 用于氨基酸对映体分离
的 手 性 衍 生 化 试 剂 有 很 多 种， 其 中 邻 苯 二 甲 醛
（o-Phthalaldehyde，OPA）-手性巯基化合物是最常用
的衍生化试剂，所有伯胺类的氨基酸对映体都能与
之反应从而实现分离。OPA 与巯基试剂，通常是 β-
巯 基 乙 醇（β-Mercap-toethanol，β-MCE） 连 用， 在
碱性条件下与一级胺反应产生荧光产物 1-巯代 -2-烷
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期70
基 -异 吲 哚（λEX=340 nm，λEM-450 nm）［16］。OPA
还可与 Boc-L-Cys 联用进行 D-氨基酸的检测和分离，
图 1 即为部分氨基酸以 Boc-L-Cys-OPA 为衍生化试
剂衍生处理后的高效液相色谱检测图。由图 1 可知，
通过这种方法处理后，D 型和 L 型氨基酸可以得到
很好的分离［17］。
形成螯合物，添加于流动相中，被分离的氨基酸对
映体衍生物（非手性试剂衍生）与手性配基及二价
金属离子形成非对映三元络合物，最后在反相色谱
条件下实现分离。手性冠醚是常用的手性固定相，
Armstrong 等［19］用手性冠醚固定相结合 ODS 柱成功
分离了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的对映异构体。
1.3.4 柱切换系统 手性固定相色谱和手性流动相
色谱法对对映异构体的分离有很好的选择性，但对
相似结构的物质（如 L-氨基酸之间）分离效果较差。
对于复杂的生物样品，可利用柱切换系统，采用多
维色谱（或称串联色谱）法，高效、灵敏地分析生
物样品中的 D-氨基酸。
1.4 生物传感器检测法
一般来说，采用高效液相法、气相色谱法或毛
细管电泳法是检测食品、饮料及生物样品中 D-氨基
酸含量的有效分析方法，这些方法安全可靠、灵敏
度很高，但是其专业化程度高、操作耗时和成本昂
贵等方面原因制约着它们在食品工业方面的应用。
对于常规分析和质量控制措施来说，开发简单、快
捷的分析方法迫在眉睫，生物传感器则恰好满足这
些要求。
在过去的几年里，许多研究小组提出使用酶反
应器检测 D-氨基酸。通过测定固定化酶猪肾 D-AAO
催化反应所产生的过氧化氢的量计算出 D-氨基酸的
量。但这些传感器的使用在一定程度上因哺乳类来
源的相关酶的底物特异性及对酸性氨基酸几乎没催
化活力而受到限制。
Rosini 等［20］开发了一种生物传感器，它解决
了以上两个问题。第一个问题可以通过使用来自酵
母的 D-氨基酸氧化酶来解决，这个酶具有更高的转
换率，更广泛的底物特异性，以及与 FAD 辅因子的
紧密结合［21］。第二个问题最近也得到解决，Sacchi
等［22， 23］通过理性设计和定向进化技术相结合成功
筛选获得了具有广泛的底物特异性的 RgDAAO 突变
体，同时这些突变体对酸性、中性以及非天然的氨
基酸的催化效率也有显著提高。
这个传感器以一个三极管电极和 RgDAAO 突
变体为基础（图 2）［20］。这个突变体酶蛋白最好
能 够 作 用 于 所 有 的 D-氨 基 酸。Rosini 等［20］ 成 功
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1：L-Asparate；2：D-Asparate；3：L-Glutamine；4：D-Glutamine；5：L-Asparagine；
6 ：D-Asparagine ；7 ：L-Serine ；8 ：L-Glutamine ；9 ：D-Serine ；10 ：D-Glutamine ；
11 ：Glycine ；12 ：L-Arginine ；13 ：L-Alanine ；14 ：β-Alanine ；15 ：D-Alanine ；
16 ：Taurine
图 1 高效液相色谱法测定衍生化氨基酸［17］
1.3.2 手性固定相分离法（CSP） 由于大部分氨基
酸没有紫外吸收，所以采用直接法分离氨基酸对映
体时仍需要非手性试剂进行柱前或柱后衍生化（其
中柱前衍生较为普遍），以提高检测灵敏度。常使用
的非手性衍生化试剂多为强荧光试剂，如 NBD-F、
DBD-F 和 ABD-F 等。对于生物样品中的氨基酸对
映体分析，最常用的手性固定相为 Pirkle 型手性固
定相，环糊精类手性固定相在氨基酸对映体分析中
也有广泛应用。Hamase 等［18］用 Pirkle 型手性柱分
离了 17 对构成蛋白质的氨基酸对映体衍生物（NBD-
AA），并结合反相高效液相色谱法和 Pirkle 型手性固
定相手性分离，分别测定了雄性和雌性大鼠脑组织
内 D-天门冬氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸和 D-亮氨酸
的分布，以及它们随年龄的变化情况。
1.3.3 手 性 流 动 相 色 谱 法 手 性 流 动 相 色 谱 法
（CMP）也称手性流动相添加法，在氨基酸对映体分
析中，使用最早、最多的是配基交换型手性添加流
动相（CLEC），主要分离方式是以光学活性的氨基
酸（常用 L-脯氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸等）或其衍
生物为手性配基，与二价金属离子（常用铜离子）
2013年第1期 71李辉欣等 ：D-氨基酸检测方法研究进展
构 建 了 RgDAAO 的 多 个 突 变 体， 其 中 M213G 和
T60A/Q144R/K152E 突变体表现最佳。当混合物中的
D-丙氨酸含量大于等于 20%，且酶处于固定化形式
时，这些酶对催化 D-氨基酸的反应表现出很低的变
化，即它们催化 D-氨基酸的活力相差不多。这个基
于 RgDAAO 的装置成功地用于检测奶酪样品中 D-氨
基酸的总量，所检测的奶酪中 D-氨基酸的含量与文
献报道相一致［11］。由此可见，这是一种有效地检测
D-氨基酸的方法。
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electrode
Working
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Reference
electrochemical cell
Reference
electrode
ΔE=250 mV
Recorder/PC
图 2 生物传感器检测 D-氨基酸示意图［20］
2 小结
酶法、高效液相法和生物传感器法是几种常用
的 D-氨基酸的检测方法。酶法价格便宜，效率高，
适宜于从混合样品中检测 D-氨基酸 ；而高效液相法
检测结果精确，目前被广泛用于 D-氨基酸的分离和
检测，但该方法专业化程度和成本均较高。生物传
感器法操作简单、准确度高，不过酶蛋白选择有一
定的局限性，且需要固定化处理。所以，对于 D-氨
基酸的检测还需要在现有试验手段的基础上进一步
加深研究，希望得到一种更加简便易行且灵敏度高
的检测方法。
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（责任编辑 狄艳红）