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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
1990 年，美国人 Tuerk 和 Gold［1］运用体外筛
选与 PCR 扩增相结合的技术从含有 8 个随机序列的
RNA 文库中筛选到了能特异性结合噬菌体 T4 DNA
聚合酶的 RNA 序列，他们将该技术定义为配体指数
富集系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment，SELEX）。 同 年，Ellington
和 Szoatak［2］运用该技术筛选到针对有机小分子染
料的 RNA 寡核苷酸，并命名为“Aptamer”，该词由
收稿日期 ：2012-11-05
基金项目 ：苏州市科技支撑项目 (SN201129)，苏州市科技基础设施建设项目（SZP201205）
作者简介 ：刘腾飞，男，硕士，研究实习员，研究方向 ：农产品农药残留检测技术 ；E-mail ：bbliutengfei@sina.com
通讯作者 ：杨代凤，女，硕士，副研究员，研究方向 ：农产品质量安全检测技术与标准 ；E-mail ：dfyang98@yahoo.com.cn
核酸适体的筛选制备及分析应用
刘腾飞1  杨代凤1  邓金花1  董明辉1  邓青青2
（1. 苏州市农业科学院，苏州 215155 ；2. 苏州农业职业技术学院，苏州 215008）
摘 要 ： 核酸适体（Aptamer）是通过配体指数富集系统进化技术（SELEX）在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列，它可
以和不同的靶标，如小分子物质、蛋白质、药物及抗生素等进行高亲和力和高特异性的结合。由于靶分子范围广、相对稳定、易
体外合成和修饰等特性，核酸适体在疾病检测、临床治疗、生化分析、药物研发等领域得到了广泛应用。以农药为靶标的核酸适
体技术在农药残留检测中也得到了初步应用。总结相关文献，介绍核酸适体的发现、特点及其筛选方法的基本原理和筛选过程中
的主要分离方法，列举核酸适体在农药、抗生素、金属离子、生物毒素、微生物以及蛋白质检测中的应用，并对核酸适体的检测
应用进行展望。
关键词 ： 核酸适体 配体指数富集系统进化技术 制备 分析应用
Screening and Preparation of Aptamer and Its
Analytical Application
Liu Tengfei1 Yang Daifeng1 Deng Jinhua1 Dong Minghui1 Deng Qingqing2
（1. Suzhou City Academy of Agricultural Sciences，Suzhou 215155 ；2. Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture，Suzhou 215008）
Abstract:  Aptamer is a kind of synthetic oligonucleotides by in vitro screening of systematic evolution of ligands by exponential
enrichment（SELEX）, which can bind to different targets, such as small organic molecules, proteins, drugs or antibiotics etc., with high affinity
and specificity. Due to their special characteristics of a wide range of targets, good stability, simple preparation and easy modification in vitro,
aptamers have been widely used in disease diagnosis, clinical therapy, bioanalysis, drug development and other fields. The SELEX method using
pesticides as targets has been preliminarily applied in the determination of pesticide residues. Based on recent literatures, this paper describes
the finding history and merits of aptamers, the principle as well as separation methods in aptamers sieving process by use of SELEX. Applications
of aptamers in pesticides, antibiotics, metal ions, biotoxins, pathogenic microorganism and proteins were also summarized. Furthermore, the
prospect of aptamers based detection techniques were proposed.
Key words:  Aptamer Systematic evolution of ligands by exponential enrichment Preparation Analytical application
拉丁文“aptus”（意为“适合”）与希腊语词缀“meros”
组成，国内将其翻译为“适体”、“核酸适（识）体”、
“核酸适配子（体）”。这种从体外人工合成的随机
DNA/RNA 文库中经过多轮指数式富集筛选得到的核
酸适体是一种功能类似抗体的新型仿生生物识别分
子，它的获取不依赖于生物体或细胞，所以又被称
为“化学抗体”［3］。核酸适体的出现使得筛选针对
各种靶标的高亲和力和强特异性的识别体成为可能，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期40
作为抗体的替代或互补试剂，对抗体为关键试剂的
快速检测技术的发展是一个重要的补充。SELEX 技
术是一种以组合化学技术、PCR 技术和基因克隆测
序技术为基础的整合技术［4］，历经 20 多年的发展
和创新，该技术已日渐成为一种重要的研究手段和
工具，在疾病检测、临床治疗、生化分析、药物研
发等领域中展现出巨大的应用潜力。
1 核酸适体的特点和不足
1.1 核酸适体的特点
核酸适体一般由几十个核苷酸（nt）组成，可
以是 RNA 或单链 DNA（ssDNA），它能够折叠形成
茎环（Stem-Loop）、发夹（Hairpin）、假结（Pseudoknot）
和 G-四聚体（G-tetramer）等热力学稳定的特殊三维
空间结构，通过结构互补、碱基堆积力、范德华力、
氢键和静电等作用与靶分子特异性结合［5］。与免疫
抗体相比，核酸适体主要具有以下生化特性［6-11］。
1.1.1 筛选方便，制备周期短 核酸适体的筛选过
程完全在体外进行，不依赖于动物，不受时间、质
量和数量上的限制。只要筛选到与靶分子特异性结
合的核苷酸序列，就可以通过 PCR 技术及其他化学
方法合成得到目标核酸适体。一个核酸适体的筛选
与制备周期通常为 2-3 个月，有的只需几周，与制
备免疫抗体需要至少 3-6 个月相比，时间大大缩短。
而且，筛选出来的核酸适体可以通过 PCR 技术大量
扩增，准确性和重复性好，几乎不存在批间的差异。
1.1.2 易于修饰和标记 核酸适体是一小段寡核苷
酸片段，通过一定的方法很容易在其特定位点上引
入氨基、硫醇等功能基团，较方便酶、荧光素、放
射性同位素或生物素的标记。
1.1.3 靶标分子范围广 核酸适体的靶标范围广泛，
包括染料、毒素、农药、氨基酸、抗生素及金属离
子等小分子物质以及蛋白质、糖类和核酸等大分子
物质，甚至完整细胞、病理组织切片等都可以作为
筛选核酸适体的靶标。理论上任何靶标物质都可以
通过 SELEX 筛选得到相应的核酸适体。
1.1.4 亲和力高 核酸适体对可结合的靶标具有精
确的识别能力和高度的亲和力，与靶标作用的解离
常数（Kd）可达到 nmol/L 甚至 pmol/L 水平。以蛋白
VEGF165/164 的核酸适体为例，其与 VEGF165/164
的 Kd 值达到 50 pmol/L。
1.1.5 特异性强 核酸适体的二级结构能够区分结
构相近的相关靶分子，识别靶标上一个甲基或羟基
的细微差别以及高度同源蛋白质和多肽的个别氨基
酸的变化。例如，特异性识别纤维二糖的核酸适体，
却不识别结构极其相似的乳糖、麦芽糖和龙胆二糖。
用茶碱筛得的核酸适体与茶碱的亲合力是其与咖啡
因的 10 000 倍，尽管两者的结构只在嘌呤环 N7 位
置上相差一个甲基。
1.1.6 稳定性好 核酸适体的化学本质是核酸，它
能够耐受非生理状态的温度、酸碱度和离子强度，
变性与复性可逆，冻成干粉后可室温保存数年，而
抗体本质是蛋白质，容易变性失活。
1.1.7 分子量小 同抗体相比（M.W.>100 kD），核
酸适体的分子量小（M.W=8-15 kD），在体内具有很
好的渗透能力，同时结合靶分子的空间位阻小，更
适用于高通量筛选。
1.2 核酸适体存在的不足与问题
尽管核酸适体具有诸多优点，但也存在某些不
足和问题，如核酸适体的筛选过程需要借助精密的
仪器，且所用试剂昂贵，目前的制备成本还很高 ；
当前仍缺乏针对任意靶标的通用性的 SELEX 筛选方
法，大多数核酸适体的筛选周期仍相对较长 ；虽然
原则上能够筛选制备任何靶标的核酸适体，但目前
只有少数蛋白质和小分子的核酸适体得到研究，某
些分子如具有重要生物学意义的癌细胞标志蛋白、
功能蛋白和药物等靶标的核酸适体数量有限［12］；核
酸适体的分子量相对较小，容易经肾脏过滤作用被
清除，造成核酸适体药物在体内的利用率偏低［13］；
研究表明，核酸适体对核酸酶缺乏抵御性，易被胞
内核酸酶降解，特别是在分析生物溶液时尤其明
显［14］。另外，实际应用中，基于核酸适体的各种传
感器的检测灵敏度、选择性、稳定性和线性响应等
指标还不太不理想，需要进一步研究优化。最后，
核酸适体的毒性和对人体的安全性问题还需要进一
步研究证明。
2 核酸适体的体外筛选
2.1 SELEX的基本原理和过程
SELEX 技术是体外筛选核酸适体的基本方法，
2013年第4期 41刘腾飞等 ：核酸适体的筛选制备及分析应用
它起始于人工化学合成的大容量（约 1015-1018 个
nt）随机寡核苷酸文库。这些文库主要包括 ssDNA
文库和 RNA 文库，其特点是 ：寡核苷酸分子的中间
部分是随机序列，两端为固定序列。固定序列内含
有 PCR 及其他酶学反应相关引物的结合位点。随机
序列一般含有 25-30 个核苷酸，它赋予了每个核酸
分子不同的空间结构，决定了随机寡核苷酸库的容
量及多样性。由于寡核苷酸随机序列的每个核苷酸
都有 A、C、G 和 T 四种可能性，若随机序列由 n 个
碱基组成，则库容量为 4n。一般库容量越大的文库
筛选到特异性结合靶分子的核酸适体的机率就会越
高，通常首轮筛选的库容量达到 1013-1015 即可满足
实际筛选需要［15］。
典型的 SELEX 筛选过程，如图 1 所示［16］，主
要包括以下几个步骤［17］：（1）运用分子生物学技术，
人工设计并合成一个库容量为 1015-1018 的随机寡核
苷酸文库，在特定的缓冲液体系和适宜的温度下（一
般为 20-35℃）与靶分子混合孵育，形成靶标 - 核
酸适体复合物 ；（2）通过滤膜过滤、亲和层析、磁
珠分离、毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等特定
方法分离结合与未结合靶标的核酸序列 ；（3）由于
此时的文库中可能含有与分离介质结合的核酸序列，
它们的存在将会增加筛选的轮次，甚至导致筛选失
败，因此需要反筛选与靶分子结合的核酸序列，以
排除掉非特异性结合的核酸序列 ；（4）对获得的特
异性结合靶标的核酸序列进行 PCR 扩增生成次级文
库，与原靶标分子进入下一轮筛选。由于 PCR 的扩
增产物是双链 DNA（dsDNA），而筛选过程只需要
其中的 1 条链即有义链，因此需要从 dsDNA 中拆分
出有义链才能进入下一轮的筛选。目前常用的拆分
dsDNA 的方法主要有［18］：不对称 PCR 法、核酸外
切酶法、磁珠捕获法和变性高效液相色谱法。随着
每一轮的温度、pH 值、靶标浓度、孵育时间等筛选
条件的不断优化，低亲合力的核酸序列被逐步淘汰，
与靶分子结合的核酸序列呈指数增长。在每一轮筛
选的同时，设立平行的亲和力检测试验，当获得核
酸文库对靶分子的亲和力不再增高，筛选过程即可
停止 ；（5）对筛选得到的核酸适体进行克隆和测序，
并进行生物活性、识别位点与分子结构（一级结构
和二级结构）分析，与靶分子特异性强、亲和力高
的核酸适体即可用于各种研究工作。
SELEX 筛选的成功率与靶标的结构性质、文库
的设计（如随机区域寡核苷酸的类型、长度及引物
区域核苷酸长度等）、筛选缓冲液类型以及离子种类
等众多因素有关［19］。对获得的核酸适体可根据不同
目的进行化学修饰以增强其稳定性，在实际应用中
还可以通过一定的剪裁去掉对靶标结合不起作用或
次要作用的核苷酸片段，如引物结合区段和一些不
影响识别功能的碱基序列，从而得到能发挥功能作
用的最小核心序列［20］。
2.2 结合与未结合核酸序列的分离
SELEX 技术中结合靶分子的寡核苷酸与未结合
寡核苷酸间的分离非常重要，该过程对筛选核酸适
体的结合特性影响很大，良好的分离方法、合适的
分离介质可以大大减少筛选的轮次，提高筛选核酸
适体的特异性和亲和性。
通常蛋白质等大分子可以采用硝酸纤维膜过滤、
超滤膜离心或预先用生物素修饰靶蛋白分子，再用
表面包被有链亲和霉素的磁珠捕获核苷酸 - 蛋白复
合物来实现分离。谢琳等［21］采用硝酸纤维膜作为
分离介质，将寡核苷酸文库与靶分子充分反应后通
过预先润湿的硝酸纤维膜，然后将膜置于真空抽滤
网上，用负压抽滤冲洗膜片，由于纤维膜可以选择
性地截留核苷酸 - 蛋白复合物而使未结合的寡苷酸
通过，基于此完成了结合与未结合靶标寡核苷酸的
分离。硝酸纤维膜过滤法对 RNA 文库的筛选分离
尤其是从混合物中分离核酸适体 - 靶分子复合物的
Enriched Pool
Aptamers
cloning & sequencing
Random ssDNA/RNA
Library
Target
Incubation
Equilibriam mixtures
Separation
Unbound
ssDNA/RNA
Collected complexes
PCR amplification
Strands
separation
Target
图 1 核酸适体筛选过程示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期42
效果很好，在小分子物质核酸适体的筛选分离中应
用较少。基于超滤离心膜的离心分离技术不仅可以
满足分离要求，而且简便易行。张焜和等［22］以随
机 ssDNA 为起始文库、肝细胞癌特异性 AFP 异质体
AFP-L3 为靶蛋白，选用超滤离心膜为分离介质分离
ssDNA-AFP-L3 复合物，洗脱与 AFP-L3 结合的寡核
苷酸，成功分离出了 AFP-L3 核酸适体。另外，聚丙
烯酰胺凝胶电泳也是一种很有效的分离方法，Smith
等［23］利用这一方法成功地将 RNA-hNE 复合物从混
合物（RNA∶DNA∶valP∶hNE）分离出来。
对于多肽、农药等小分子，可通过将其修饰后
引入活性基团，然后固定在凝胶［24］、磁珠［25］等固
相载体上，再用寡核苷酸文库去竞争洗脱载体上的
靶分子以达到分离的目的。尽管这种基于固相介质
的分离方法具有容易洗脱、不易损失等特点，但对
于固定到固相上的靶分子，洗脱与之结合的寡核苷
酸序列是一个慢速动力学过程，且需要多轮往复才
能富集到强结合的核酸序列［26］。毛细管电泳（CE）
的应用对消除动力学方面的缺陷，提高 SELEX 的筛
选效率起到了积极作用。该方法基于结合靶分子的
寡核苷酸与游离寡核苷酸间的大小存在差别，根据
二者在毛细管柱中迁移速率的差异实现分离。由于
毛细管电泳的分离在溶液中进行，无需洗脱，分离
过程不引入分离介质，有效地降低了由基质引起的
非特异性作用［27］，能快速、高效地从未结合的核酸
文库中分离出核酸适体 - 靶分子复合物，因此利用
CE-SELEX 方法仅需 2-4 轮筛选就能获得目标核酸
适体［28-30］。但是，CE-SELEX 技术由于注射进样体
积小（nL），严重限制了初始文库 DNA 的数量，与
传统的 SELEX 相比只有 1013 个 DNA 分子数量的文
库可用于筛选。
此外，表面离子共振（SPR）［31］，流式细胞技
术（FC）［32］，电泳迁移率漂移分析（EMSA）［33］等
技术近年来在核酸适体的筛选分离中也有应用。这
些方法在高效分离结合核酸序列的同时还可以测定
核酸适体与靶分子的结合能力，大大简化了 SELEX
操作步骤，对核酸适体的筛选具有非常重要的意义。
从以上的叙述中可以看出，核酸适体筛选步
骤多，重复性高，费时费力。一个典型的 SELEX
筛选过程必须进行多轮反复筛选（8-15 轮），耗
时（4-6 周）耗力。随着分离技术的多样化和高效
性，近年来发展了基于不同筛选目的新型 SELEX 技
术［19］，如以提高核酸适体选择性为目的的反向筛
选（counter SELEX）、负筛选（negative SELEX）、消
减筛选（subtractive SELEX）和光交联筛选（photo
SELEX）；以提高核酸适体普适性为目标的筛选方法，
如复合靶筛选（complex targets SELEX）、切换筛选
（toggling SELEX）、混合筛选（blended SELEX）和表
达盒筛选（expression cassette SELEX）；以缩短筛选
周期的高效筛选方法，如不放大筛选（non-SELEX）、
自动化筛选（automated SELEX）和荧光磁珠筛选
（FluMag SELEX）［5］；不同组合库相结合以增加目标
核酸适体筛选机率的方法，如基因组筛选（genomic
SELEX），加尾筛选（tailored SELEX）等。这些筛选
方法的出现，大大缩短了核酸适体的筛选周期，为
实现核酸适体筛选流程的自动化和快速化、筛选形
式的多样化以及多目标同时筛选创造了条件。
3 核酸适体的分析检测应用
3.1 在农药分析中的应用
农药是一类小分子化合物，其检测分析方法
很多，包括色谱法、光谱法等仪器方法，酶抑制
法、免疫分析法等快速检测方法。核酸适体的出现
为农药及其残留检测开辟了一条新的途径，目前已
有多篇文章报道了农药核酸适体的筛选和相关的应
用，涉及的靶标农药主要有啶虫脒、毒死蜱、甲拌
磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果以及氨基甲酸酯
类农药等。He 等［34］利用非固相化核酸适体筛选方
法，以 ssDNA 为起始文库、啶虫脒为靶分子，经
过 18 轮重复筛选，获得了针对啶虫脒的 14 条不同
核酸适体。采用荧光法鉴定，5 条适体（S10、S11、
S13、S15 和 S18）的活性相对最大，超滤法进一步
鉴定发现适体 S18 的活性最高，对啶虫脒的亲和力
和特异性最好，其 Kd 值为 4.98 μmol/L。建立了基于
适体 S18 的啶虫脒快速检测方法，对啶虫脒的最低
检测出浓度为 0.05 mmol/L。Wang［35］小组对 4 种有
机磷农药甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果的
核酸适体进行了 SELEX 筛选。经过 12 轮循环筛选，
获得了 5 条具有广谱活性的 DNA 适体，其中 2 条
适体 SS2-55 和 SS4-54 的亲和力和特异性相对较高。
2013年第4期 43刘腾飞等 ：核酸适体的筛选制备及分析应用
设计了长度为 20 nt 的分子信标，基于信标的荧光检
测方法对 4 种农药均有较好的检测活性，其 Kd 值在
0.83-2.50 μmol/L 之间。雷兆静等［20］体外合成了全
长为 91 nt 的 ssDNA 文库，以链亲和素修饰凝胶为
载体、毒死蜱为靶分子进行 SELEX 筛选，经过 15
轮筛选后，DNA 文库的筛选效率达到 44.0%，最终
获得了 9 条 ssDNA 适体，荧光法鉴定适体 N23 对毒
死蜱的亲和力最高。对 N23 的二级结构和结合位点
进行预测和分析发现，茎环结构可能是毒死蜱与其
适体相互作用的结构基础。此项研究对利用核酸适
体检测环境及食品中的毒死蜱残留具有一定的参考
价值。
以农药为靶分子进行 SELEX 筛选时，通常需
要对其进行分子改造，引入活性基团以实现与固相
载体的结合。在此过程中，一方面要保证农药的杀
虫活性结构不被破坏 ；另一方面又不能掩盖其与核
酸的结合位点，这就给农药核酸适体的筛选带来很
大的难度。利用自由态靶分子与固定态寡核苷酸结
合的方式分离出特异性核酸适体的方法避免了对小
分子靶标进行改造的过程，且筛得的核酸适体不
需要标记即可直接应用［36］。根据这一原理，王耘
等［37］以氨基甲酸酯类农药的混合药剂（西维因、 异
丙威、克百威和仲丁威）为靶分子，建立了一种非
改造型农药适体筛选新方法。经过 9 轮筛选，随机
ssDNA 文库与 4 种农药混合物的结合率从 0.70% 上
升到 13.32%，成功获得了对上述混合农药具特异性
的 DNA 适体，该研究为筛选农药的特异性核酸适体
提供了新的思路。
3.2 抗生素检测
抗生素的发现和使用为人类抵抗和治愈疾病
提供了一种有力的武器，然而大量使用及滥用抗生
素对人体健康也造成了诸多的危害。目前抗生素
的分析检测研究日新月异，除了微生物法、色谱
法、免疫法等传统分析方法外，核酸适体在抗生素
的检测中也得到了广泛应用，尤其是作为分子识别
物质在各种传感器中的应用。Kim 等［38］以土霉素
（Oxytetracycline，OTC）DNA 适体作为分子识别元
件，将 ssDNA 固定在金交叉阵列（IDA）电极芯片
上，以 Fe（CN）6
-3 为转能器，构建了基于该适体
的电化学传感器，利用土霉素含量的变化引起传感
器对应电流发生改变这一原理定量检测土霉素。对
土霉素的线性检测范围为 5-100 nmol/L，检测限为 1
nmol/L。de-los-Santos-Álvarez 等［39］利用 SPR 技术设
计了检测新霉素 B 的传感器。其原理是，通过化学
反应将新霉素 B 固定到金传感器表面，当新霉素 B
适体溶液流过传感器表面时，电阻光谱会发生变化，
样品中新霉素 B 的含量越高，与固定新霉素 B 结合
的适体就越少，所检测到的光信号就越低，反之则
越高。该传感器对动物样本中新霉素 B 的检测范围
为 10 nmol/L-100 μmol/L，检出限为 5 nmol/L。吴艳
等［40］将四环素核酸适体作为识别分子，共价固定
于玻碳电极（ECE）表面，制备了一种能快速检测
牛奶中四环素、青霉素、土霉素 3 种四环素类抗生
素的核酸适体生物传感器。利用循环伏安法给出的
电化学信号定量检测样本中的靶标四环素，检测时
间仅需 5 min，最小检出量为 0.001 mg/L，线性检测
范围为 0.001-0.1 mg /L。
此外，托普霉素［41］、氯霉素［42］、卡拉霉素 A［43］
和 B［44］、妥布拉霉素［45］、链霉素［46］和青霉素［47］
等抗生素的适体法检测也有报道，这些抗生素适体
大多为 RNA 型适体，检出限可达 2-3 nmol/L。
3.3 金属离子检测
高淑丽等［48］报道了一种基于核酸适体构象效
应和荧光探针噻唑橙（TO）为荧光分子开关检测 K+
的光学方法。室温下 K+ 可与核酸适体结合形成 G-
四聚体结构，使双链解链变为四聚体结构和单链，
从而导致 TO 荧光强度降低。选择 TO 最终浓度 100
nmol/L、反应温度 25℃、反应时间 3 min 为最佳试
验条件。在此条件下，K+ 浓度在 1.0×10-6-2.0×10-4
mol/L 范围内与荧光强度降低呈良好的线性关系，方
法检出限为 0.33 μmol/L。应用该方法对青霉素 V 钾
片剂中 K+ 的含量进行测定，检测结果与原子吸收法
一致，表明该方法可用于实际样品的检测。适体酶
是一种人工合成的酶，由适体（含有受体位点）和
核酶或脱氧核酶（含有催化活性位点）组成，它既
具有适体与靶分子结合的高特异性和高亲和力的特
性，又具有核酶或脱氧核酶的催化活性［49］，目前应
用适体酶检测金属离子已有相关的报道。Xiao 等［50］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期44
将特异性结合 Pb2+ 的 DNA 酶的一端固定在电极表
面，一端修饰亚甲基蓝（methylene blue，MB），制
备了一种检测 Pb2+ 的电化学核酸酶传感器，检测限
可达 0.3 μmol/L，能够用来检测土壤中的痕量 Pb2+。
Lee 等［51］报道了基于适体酶 -AuNP（纳米金）比色
传感检测 UO2
2+（铀酰根离子，放射性元素铀 U 在
水溶液中主要存在形式）的标记法和非标记法，检
出限分别为 50 nmol/L 和 1 nmol/L，均低于 EPA 规定
的 UO2
2+ 在污染物中含量上限值 130 nmol/L。Hg2+ 是
毒性较强的金属离子之一，其分析和检测备受科研
人员的关注。蒋治良等［52］利用核酸适体修饰金硒
（AuSe）纳米合金共振散射光谱探针检测水样中的痕
量 Hg2+，线性范围为 1.3-1 466 nmol/L，检出限可达
0.74 nmol/L。与纳米金检测方法相比［53］，该方法的
灵敏度提高了约 15 倍。
研究发现［54］，以金属离子为靶标筛得的核酸适
体的特异性与靶标的结构密切相关，一般靶标的结
构越简单，核酸适体的特异性可能越差。应用核酸
适体检测的其他金属离子还有 Cu2+［55］、Zn2+［56］和
Ni2+［57］等。
3.4 生物毒素检测
黄 曲 霉 素（aflatoxin，AFT） 是 由 真 菌 产 生 的
一类毒性极强的致癌物质，常见于各种农产品中，
Carlson 等［58］开发了一种用于定量检测 AFT 的手持
式全自动荧光免疫生物传感器。该传感装置快速、
灵敏，可以连续测量 100 次，1 mL 体积的样品在 2
min 内即可完成检测，对 AFT 的检测浓度在 0.1-50
ng/mL 之间。
段诺等［59］ 建立了赭曲霉素 A（Ochratoxin A，
OTA）的核酸适体识别 - 荧光检测方法。将 OTA 核
酸适体及 FAM 标记的核酸适体互补链预先在微孔
板上组装好，测定时只需将样品简单处理直接加样
反应即可。通过与核酸适体互补杂交的荧光标记
DNA 短链的解离引起的荧光信号变化定量检测靶
分子，检测 OTA 的线性范围为 2.0 ×10-8-1.0×10-5
g/L，检出限为 1.0×10-8 g/L。玉米粉中 OTA 的加标
回收率为 91.0%-100.6%，检测结果与 ELISA 法一致。
Cruz-Aguado 等［60］利用构建的 DNA 适体亲和柱检测
小麦样品中的 OTA，通过荧光光谱测定，小麦样品
中 OTA 的含量为 0.47 μg/kg。
微囊藻毒素（Microcystin，MC）是由引起蓝藻水
华的蓝细菌产生的一种肝毒素，误食将导致动物肝
脏的中毒和坏死。Nakamura 等［61］筛选获得了对 MC
具特异性的 DNA 适体。利用该核酸适体，研制了一
种表面固定细胞质粒基因组的生物传感器，用于测
量水中 MC 的含量，检测范围为 50-1 000 μg/mL。
3.5 微生物检测
关于核酸适体在微生物检测中的应用，国内外
已有相关的研究及评述，如 Torres-Chavolla 和 Aloci-
ljac［62］、国内的文晓棠等［63］和王一娴等［64］先后对核
酸适体传感器在微生物检测中的应用、存在问题及
未来的发展作了较为详细的综述。Vivekananda 等［65］
以灭活的土拉热弗朗西丝菌为靶标筛得了 25 条不同
的核酸序列，采用斑点印迹法证明它们具有很好的
特异性。基于这些核酸适体，建立了检测土拉热弗
朗西丝菌的适体连接固定吸收方法，最低可以检测
1.7 ×103/mL 的土拉热弗朗西丝菌，已经达到了临床
检测细菌感染的水平。
量子点（QDs）是一种半导体纳米荧光颗粒，
由于稳定时间长并可以进行多信号的同时检测，被
广泛用作靶向性荧光探针。Bruno 等［66］将空肠弯
曲杆菌 DNA 适体用于磁珠和 QDs 的夹心系统中检
测空肠弯曲杆菌。该系统检测速度快，可在 15-20
min 内完成空肠弯曲杆菌的检测，在缓冲液中的检
测下限为 2.5 CFU/mL，在不同食品基质中为 10-250
CFU/mL。
Zelada-Guillén 等［67］以单壁碳纳米管作为电子
离子转换器，设计了用于检测大肠杆菌 CECT675 的
适体生物传感器。利用无需标记的适体探针，十几
分钟内即可完成对实际样品中 CECT675 的检测，在
牛奶和苹果汁中的检测限分别为 6 CFU/mL 和 26
CFU/mL，检测范围宽度为 104 CFU/mL。此前，他们
曾用此方法检测伤寒沙门氏杆菌，检测浓度范围为
0.2-103 CFU/mL［68］。
吴文鹤等［69］对核酸适体序列进行截短，然后
通过酰胺化反应将该核酸适体修饰到丁二炔（PDA）
纳米囊泡的表面，构建了可以快速比色检测肠致病
性大肠埃希菌的适体生物传感器。利用核酸适体与
2013年第4期 45刘腾飞等 ：核酸适体的筛选制备及分析应用
脂多糖（LPS）特异性结合后引起 PDA 纳米囊泡的
颜色变化和比色响应值改变来定量检测溶液中的大
肠埃希菌。该传感器操作简便，整个检测过程仅需
30 min，对大肠杆菌 O111 的检测特异性为 100%，
线性范围为 105-108 CFU/mL，检出限为 105 CFU/mL，
比使用共轭骨架材料构建的传感器的灵敏度提高了
3 个数量级［70］。
在食品微生物检测方面，Ohk 等［71］使用抗体
和核酸适体功能化的光纤生物传感器检测人为污染
的牛肉片、鸡肉及火鸡等食品中的致病性李斯特菌
（初始接种量为 102 CFU/25 g），在光波导表面固定抗
体，以捕获食品中的李斯特菌，再以荧光标记的核
酸适体作为标记物，根据传感器的荧光强度来测定
李斯特菌的数量，检出限为 103 CFU/mL。Joshi 等［72］
利用反向 SELEX 技术筛选到了 5 株针对沙门氏菌的
特异性 DNA 适体，为食品和环境样品中沙门氏菌的
检测奠定了基础。
3.6 蛋白质检测
蛋白质分子是核酸适体技术的主要靶标之一，
该技术 1990 年初首次被报道时，所采用的靶标 T4
DNA 聚合酶就是典型的蛋白质分子［1］。至今，运
用 SELEX 技术已经筛选出了数百种蛋白质的核酸适
体，其中大部分为细胞因子、抗体、酶等，同时还
发展了多种基于核酸适体的蛋白检测方法，如比色
法、混合夹心法、电化学法和荧光检测法。Wu 等［73］
基于分子间 G 四股螺旋结构，结合 S1 核酸酶和靶
标核酸适体，提出了一种信号增强的末端单芘标记
的寡核酸荧光探针用于蛋白质的超灵敏检测方法。
在一定条件下，G 四股螺旋结构具有优良的稳定性，
能够抵抗 S1 核酸酶的酶切和强酸强碱的破坏，有
效地回避了报告基团特异性位点优化和芘单体荧光
易被核酸碱基猝灭的问题。该法对均相中 IgE 的检
测限达到 0.094 5 pmol/L，IgE 的浓度在 4.72×10-12-
7.56×10-9 mol/L 范围内能被准确定量，比文献报道
的分子发光［74］、场效应晶体管［75］等方法的检测限
低了 3 个数量级，线性范围宽度提高了 5-200 倍。
McCauley 等［76］研制了同时检测与肿瘤相关的多个
靶蛋白（anti-thrombin，anti-bFGF，anti-VEGF 和 anti-
IMPDH Ⅱ）的荧光适体传感器。将荧光素标记的
DNA 和 RNA 适体固定在玻片上，根据结合靶分子
后荧光偏振信号的变化，对 4 种蛋白同时进行定量
检测。该传感器可用于复杂生物体系如血样和细胞
提取液中蛋白的检测。
通过借鉴双抗体夹心法检测抗体的模式，Ahn
等［77］将针对 SARSN 蛋白的核酸适体作为捕获抗原
试剂，建立了检测 SARSN 蛋白的适体 - 抗体免疫测
定方法，最低可检测 2 pg/mL 的 SARSN 蛋白，有望
发展成为特异性检测 SARS 的高灵敏度方法之一。
4 结语
20 世纪 90 年代初，科研工作者们以 T4 DNA 聚
合酶为靶标筛选获得了第 1 个核酸适体，它的出现
使人们认识到作为遗传信息存储和转运载体的核酸
也可以作为各种功能分子。核酸适体具有对靶标高
度的识别结合能力，以及不易变性、易体外合成和
修饰等特性，在疾病检测、临床治疗、分析化学以
及药物研发等领域已经成为重要的研究工具。历经
20 余年的发展，核酸适体技术在筛选方法上不断改
进和完善，发展了许多快速、准确、高效、普适的
分离筛选技术，出现了反向筛选（counter SELEX）、
混合筛选（blended SELEX）、自动化筛选（automated
SELEX）等多种筛选技术 ；靶标范围不断拓展，从
最初的蛋白质分子到常见的重要离子、药物、抗生
素、糖类及脂类分子、生物毒素、病原微生物，甚
至完整的细胞、病毒等现在都可以经 SELEX 筛选获
得相应的特异性核酸适体。基于上述特性，核酸适
体还可以作为一种理想的分子识别元件用于各种传
感器中。实际上，目前核酸适体在分析检测方面的
应用主要在传感器领域。另外，将核酸适体与荧光法、
比色法、电化学法、纳米技术、表面增强拉曼散射、
表面等离子共振等技术和方法相结合，大大地拓宽、
提高了核酸适体的检测范围和分析效率。
尽管目前核酸适体技术仍存在一定的问题和局
限，但随着高效、通用、普适的分离筛选方法的开
发，新型核酸适体的研究和制备，核酸适体与新型
纳米材料、微流控技术的结合，以及检测过程的快
速化、自动化、微型化和集约化，相信在不久的将
来基于核酸适体的分析技术会像传统抗体一样成为
农药、抗生素以及其他小分子、大分子检测的不可
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期46
或缺的手段之一。
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（责任编辑 狄艳红）