全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月 生"物"加"工"过"程 *4;?BDBW>HF?=G>EY;>9F>CBDDX?J;?BBF;?J d>G7! />7# a=O$%&%
@>;&&%7#.).0V7;DD?7&)-$8#)-!7$%&%7%#7%&%
收稿日期&$%%. 8&& 8&$
基金项目&科技部资助项目 $$%%.PW(&%%,-%)天津市科委资助项目$%-KL^ L/*%,%%"%.K*KUS\%,$%%% 作者简介&吴"艳$&.!#%"女"山西大同人"硕士研究生"研究方向&生物传感器)张娟琨$联系人%"教授"XN<=;G& 34=?JVAe:HD:7B@H7C? 核酸适体生物传感器快速检测牛奶中抗生素 吴"艳"张娟琨"范"婷"李"敏"张彬彬"孙"坤"吴"萍 $天津科技大学 生物工程学院 天津市工业微生物重点实验室 教育部工业微生物重点实验室"天津 #%%,-% 摘"要&为了现场快速检测牛奶溶液中四环素类抗生素的含量"对电极进行阳极氧化(氨基化(活化等一系列处理" 将四环素核酸适体作为识别分子"共价固定于玻碳电极表面"构建出新型核酸适体生物传感器 传感器可以特异 性结合标本中四环素类抗生素"并产生电化学信号"强度与抗生素浓度相关 其最低检测量是& ! J0T"检测时间 为 <;? 关键词&核酸适体生物传感器)四环素)检测 中图分类号&Z#.$f&&""""文献标志码&(""""文章编号&&)-$ 8#)-!$$ %&%%%# 8%%,! 8%
Q51GJ0G0:G.2/275/G.M.2G.:1./H.6KMB 59G5H04M.210/124
MRQ=?"KL(/PWH=?NAH?"\(/_;?J"T[a;?"KL(/PY;?N2;?"SR/cH?"MR5;?J
$a;?;D:FO>EX@HC=:;>? cBOT=2>F=:>FO>E[?@HD:F;=Ga;CF>2;>G>JO"_;=?V;? cBOT=2>F=:>FO>E[?@HD:F;=Ga;CF>2;>G>JO"
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*M1G45:G&(?B` =9:=DB?D>FE>FE=D:@B:BC:;>? >E:B:F=COCG;?B` =DBD:=2G;D4B@7PG=DDOC=F2>? BGBCN
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:4B:B:F=COCG;?B;? D=<9GB7XGBC:F>C4B<;C=GD;J?DEF><=9:=DB?D>FD4>`B@ :B:F=COCG;?BC>?CB?:F=:;>?
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""核酸适体是一种独特的单链核苷酸"它可以广
泛地与非核苷酸靶目标物质进行高亲和力(高特异
性结合,&- "通过指数富集配基的系统进化技术"体
外筛选(扩增和富集获得,$8#- 在医学诊断和探测 实验中"核酸适体以它高效(灵敏等优点取代了抗 体"并得到广泛认可 四环素类药物以其优良的抗 菌性(稳定性以及低廉的价格"广泛用于动物疾病 的预防和治疗,, 8)- 但是"四环素类药物的滥用"导 致细菌耐药性增强"并直接危害消费者身体健康 因此为了保障公共健康安全"对四环素类药物的检 测至关重要 目前关于四环素类抗生素的检测方 法有酶联免疫法(薄层色谱法(毛细管电泳法等"但 这些方法都需要大型仪器且价格昂贵,-- 核酸适 体生物传感器与传统生物传感器相比有以下优 点,! 8.- &&%高亲和力"高特异性)$%体外筛选"易人
工合成)#%电极制作简便(使用寿命长),%核酸适体
结构简单"容易复性)%易修饰(灵敏度高))%成本
低(易微型化(无污染
Q>D4;@=等,&% 8&&-构建了 & 种酶分子核酸适体传
感器$(XS%"此外也有报道 & 种称作T=2BGNEFBB的传 感器,&$- "这 $种传感器的缺点是干扰信号多 本文 介绍的方法是对电极进行氨基化修饰"将核酸适体 共价固定于玻碳电极$X*X%表面"通过循环伏安法
给出的电化学信号检测标本中的四环素类抗生素
浓度
E?材料与方法
EPE?材料
&f&f&"试剂
牛血清白蛋白$YS(%"北京鼎国生物技术有限 公司)碳二亚胺盐酸盐$XU*%(羟基丁二酰亚胺
$/LS%"分析纯"上海 S=?G=?@ 国际化学品有限公 司)%f%& <>G0T9L)f%(-f% 的 5YS 缓冲液"自配) %f& <<>G0Tc # \B$*/%
)
溶液"自配)四环素(青霉
素(土霉素"北京鼎国生物技术有限公司)# 氨丙基
三乙氧基硅烷"大连奥利凯化工有限公司)其他试
剂均为国产分析纯
&f&f$"仪器 Tc$%%(型电化学工作站"天津兰力科化学电
子高技术有限公司)三电极系统&玻碳电极$P*X% 为工作电极"(J0(G电极为参比电极"铂电极为对电 极)高速冷冻离心机"日本日立公司)UT&%$ 真空干
燥箱"天津市三水科学仪器厂)LL S 水浴锅"国胜
仪器实验厂)超声波清洗器"宁波新芝生物科技股
份有限公司
EPC?方法
&f$f&"工作电极的修饰 电极洗净后在室温下置于 # 氨丙基三乙氧基 硅烷盐酸溶液$A$# 氨丙基三乙氧基硅烷%h A$L*G%hA$水% i&h&h&%%中" # l水浴# 4进行 硅烷化"即在玻碳电极表面导入#/L$
最后将电
极浸入&%%
!
T含有%f% <>G0TXU*和%f%# <>G0T
/LS溶液中"% l水浴活化.% <;?
&f$f$"核酸适体的固定
先将$! J0 ! T核酸适体&% ! T滴至电极表面" 在红外灯照射下"交联& 4"再于!% l烘箱中烘烤 #% <;?进行固定"然后用二次蒸馏水清洗电极 次" 每次使用二次蒸馏水% ! T"除去未共价固定的核 酸适体"洗液进行琼脂糖电泳 用氮气吹干电极表 面 最后用质量分数为 &kYS(封闭电极表面未结 合位点$ 4"蒸馏水清洗除去游离的YS(
&f$f#"试样测定 配不同浓度的四环素类抗生素溶液"间隔 <;?"在 8%f& gm%f) d电势区间做循环伏安测 试"扫描速率是%f% d0D 对5YS及牛奶中四环素( 土霉素(青霉素的浓度进行检测"并做了非特异性 对照实验 为了检测构建的核酸适体传感器的精 确度"配制 , 个浓度的四环素 5YS 溶液"做循环伏 安扫描的峰电流值 浓度标准曲线 C?结果与讨论 CPE?核酸适体最大固载量的确定 用玻碳电极P*X分别固定&% ! T不同质量浓度 的核酸适体$,%(#(#%($! J0 ! T%"然后将清洗电 极游离核酸适体的洗液进行琼脂糖电泳"结果如图 & 所示 图 & 中"=为<=FABF"2为核酸适体模板 "C( @(B(E分别是固定核酸适体的洗液$质量浓度 ,%(
#(#% 和 $! J0 ! T% 图 E?琼脂糖电泳图 Q.;=E?*;54210;06060:G429-2401.19.:G340 ""由图 & 可以看出"直到核酸适体固定质量浓度 为$
!
J0
!
T时"电泳无明显条带"证明$! J0 ! T为 最大固定质量浓度 最后将清洗后的电极进行循 环伏安法扫描"结果如图$ 所示
图 C?%,#固定核酸适体前后的循环伏安曲线
Q.;=C?,B:6.:R26G5HH2;45H:34R0127%,#
M072405/J57G04H2J.7.:5G.2/
.,"第 # 期 吴"艳等&核酸适体生物传感器快速检测牛奶中抗生素
由图 $可以看出"固定核酸适体的P*X循环伏 安曲线明显降低 证明核酸适体修饰成功 从电 化学信号可以看出核酸适体已被固定于玻碳电极 表面 CPC?核酸适体对四环素(土霉素及青霉素检测的响 应范围 ""在选定的优化条件下"用共价结合了四环素核 酸适体的玻碳电极分别与含有不同浓度四环素( 土霉素( 青霉素的 c # \B$*/%
)
5YS 溶液和
c
#
\B$*/% ) 牛奶溶液反应$%(%f%%&(%f%%(%f%&(
%f%&(%f%$(%f%#(%f%(%f%!(%f& 量浓度 电流曲线图如图 # g) 所示 图 # 中&=为
核酸适体生物传感器对四环素在 c
#
\B$*/% ) 5YS 溶液中的检测)2 为核酸适体生物传感器对四环素 在c # \B$*/%
)
牛奶溶液中的检测)C为核酸适体生
物传感器对土霉素在c
#
\B$*/% ) 5YS 溶液中的检 测) @ 为 核 酸 适 体 生 物 传 感 器 对 青 霉 素 在 c # \B$*/%
)
5YS溶液中的检测)B为核酸适体生物
传感器对土霉素在c
#
\B$*/% ) 牛奶溶液中的检测)E 为 P*X固定 @@U/(对四环素在c # \B$*/%
)
5YS
溶液中的检测)J为玻碳电极无修饰对四环素在
c
#
\B$*/% ) 5YS溶液中的检测 图 @?核酸适体生物传感器在不同浓度四环素(土霉素( 青霉素的N @ Q0$,$% W X8!溶液(N @ Q0$,$% W 牛奶溶液中的对照浓度 电流曲线 Q.;=@?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127 59G5H04M.210/12457G045JJ.G.2/27 J.7040/G5/G.M.2G.:1:2/:0/G45G.2/127 N @ Q0$,$% W X8!1263G.2/" N @ Q0$,$% W H.6K1263G.2/5/J:2H954.12/ ""由图 # 可以看出&固定核酸适体的玻碳电极$构建的核酸适体生物传感器%对四环素(土霉素的
浓度 电流曲线变化很明显"说明四环素核酸适体对
四环素(土霉素有很好的特异性 对照实验 @ 曲线
变化不明显"说明核酸适体生物传感器对青霉素无
特异性 对照实验 E(J曲线变化也不明显"说明固
定 @@U/(的P*X和空白 P*X不能捕获四环素"对
四环素无特异性 接下来研究核酸适体在
c
#
\B$*/% ) 5YS 溶液和 c # \B$*/%
)
牛奶溶液中分
别对四环素和土霉素检测的响应范围
CP@?核酸适体分别对四环素(土霉素检测的响应范围
从图 ,可以看出"电流 浓度曲线变化很明显"证
明四环素核酸适体在c
#
\B$*/% ) 5YS 溶液中对四 环素类抗生素有很好的特异性 四环素和土霉素的 响应方程分别为 3 = i8-f$# ,$m$f,!) #"I
$= i %f.% )3 2 i8,f#-) -$m&f.&- "I
$2 i%f.$ $图 T?核酸适体生物传感器对不同浓度四环素( 土霉素的N @ Q0$,$% W X8!溶液浓度 电流曲线 Q.;=T?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127 59G5H04M.210/12457G045JJ.G.2/27 J.7040/G5/G.M.2G.:1:2/:0/G45G.2/127 N @ Q0$,$% W X8!1263G.2/ ""从图 可以看出浓度 电流曲线变化明显"证明 四环素核酸适体在 c # \B$*/%
)
牛奶溶液对四环素
类抗生素也有很好的特异性 四环素和土霉素的
响应方程分别为 3
C
i8&$f#&,$m$f-)- "I$
C
i
%f.- ,)3
@
i8-f#&. )$m$f$,! ,"I$
@
i%f.. ,
图 ) 中& B为空白玻碳电极对四环素在
c
#
\B$*/% ) 5YS溶液中的检测)E为核酸适体生物 传感器对青霉素在 c # \B$*/%
)
5YS 溶液中的检
测)J为 核 酸 适 体 生 物 传 感 器 对 四 环 素 在
c
#
\B$*/% ) 5YS溶液中的检测) 4 为 P*X固定 @@U/(对四环素在c # \B$*/%
)
5YS溶液中的检测
$质量浓度范围&%f%%& g%f& 3
B
i8&f$.&$$m$f)" I
$B i%f.)# ,) 3 E i8%f$,) #$m$f&)"I
$E i%f.,! #)3 J i8-f$# ,$m$f,!"I
$J i%f.% ) 3 4 i8%f#% !$m&f-)"I
$4 i%f.,, ! % 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" 图 U?核酸适体生物传感器对不同浓度四环素( 土霉素的N @ Q0$,$% W 牛奶溶液浓度 电流曲线 Q.;=U?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127 59G5H04M.210/12457G045JJ.G.2/27 J.7040/G5/G.M.2G.:1:2/:0/G45G.2/127 N @ Q0$,$% W H.6K1263G.2/ 由图 ) 可以看出" E曲线变化缓慢"说明构建 的核酸适体生物传感器对青霉素无特异性 对 照实验 B和 4曲线无变化" 说明空白 P*X和固定 图 W?核酸适体生物传感器对照实验的浓度 电流曲线 Q.;=W?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127 59G5H04M.210/124:2/G4260L904.H0/G @@U/(的 P*X不能捕获四环素"对四环素无特异 性 为了证实传感器的精确度"配制了 , 个质量 浓度的四环素 5YS 溶液"循环伏安扫描的峰值和 浓度 电流标准曲线图比对产生对应的浓度"与实 际配制的浓度相比计算离散系数 *d值"结果见 表 & 表 E?四环素含量在X8!溶液中的测定 F5M60E?Y0G0:G.2/:2/:0/G45G.2/27G0G45:B:6./0742HX8!15H960 编号 "标准0$8&
%
"测定0
$8&
%
"平均0
$8&
%
标准偏差 *d0k
& %f%$%f%$) %f%$- %f%%& %)% ))% ,f&$
$%f%, %f%,- % %f%,) %% %f%%& ,&,$&, #f%-
# %f%) %f%)& % %f%)# %% %f%%$!$! ,$- ,f,. , %f%! %f%!$ % %f%!# % %f%%$&$& #$%$f,
@?结?论
通过对玻碳电极固定四环素核酸适体"制备
了可快速现场检测牛奶中四环素类抗生素的新型
核酸适体生物传感器 用循环伏安扫描检测"得
到四环素类抗生素浓度与峰电流的工作曲线"检
测限为 %f%%& %f& 器对四环素类抗生素能表现出很好的特异性 新
型核酸适体生物传感器可以广泛应用在临床医学
检验(基因工程(环境监测和食品工程等领域"随
着研究的不断深入和技术的更加完善"这种新型
核酸适体生物传感器一定会在诊断(治疗(检测中
发挥重要作用
参考文献&
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CF>2;=G=?@ ];F=G9=:4>JB?D,W-7Y;>DB?D>FD=?@ Y;>BGBC:F>?;CD"
$%%."$,$&&%&#&-N#&!$7
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B?F;C42=C:BF;>94=JB_, U/(9>GO,W-7SC;B?CB"&..%"$,.&%N&%7 ,,-"中国兽药典委员会7中华人民共和国兽药典,a-7北京&中国 农业出版社"$%%)&&,N&)7
,-"SB?:HFA S"_B<;3BGa7*G;?;C=GBE;C=CO>EF;E=<2;?B@
;`:4 >IO:B:F=COCG;?B;? :4B:FB=:EC=DB>HDGO<94=@B?;:;D;?
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2;>DB?D;?J2=DB@ >? B?3O<=:;C=C:;];:OC=G*4B<;D:FO"$%%)"-!&#$.)N##%#7
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D;?JB?3OC4B94ODZBD
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>G>JO"$%%."&#$&%&
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&N&%7
最新专利文摘
*/&%&)-)#.."生物转化玉米芯生产木糖醇的工艺方法
本发明提供了一种生物转化玉米芯生产木糖醇的工艺方法"属于功能糖生产技术领域 其工艺方法包
括如下步骤&玉米芯的预处理(玉米芯的酶解(液体菌种的制备(木糖醇的发酵生产(发酵液的分离与提纯
采用生物转化玉米芯的工艺生产木糖醇"工序简单(无环境污染"符合环保要求)工艺过程条件温和"常压下
操作"易于安全生产)生产收率高"降低了运行成本"提高了产品的市场竞争力"促进了行业的可持续发展
""*/&%&).&$#"一种利用植物油废脚料油生产生物柴油的方法 本发明提供了一种利用植物油废脚料油生产生物柴油的方法"其步骤如下&首先向反应容器中加入植 物油废脚料油(甲醇和 %fk g$k的碘"于 % g&%% l回流反应 %f g# 4 后"冷却分液得上层溶液"然后将
上层溶液减压蒸馏得油脂产品"再将油脂产品(&f g$f 倍油脂产品质量的甲醇和碘加入反应釜中回流反 应"冷却分液取上层油相并用 % g)% l热水洗涤至中性"除水干燥即得到生物柴油产品 本发明生产生物 柴油的工艺简单"设备投入低"避免使用大量的强酸强碱"环境污染小"反应中使用的甲醇还可以进一步回 收利用"适合工业化生产 ""*/&%&)-&-&)"生物酶不对称转化生产H 苯丙氨酸的方法 本发明属于生物工程领域中的酶工程技术"所要解决的技术问题是提供一种生产过程简单(能够降低 生产成本的H 苯丙氨酸生物酶不对称转化的制造方法 其技术要点&以H7 苯丙氨酸为生产原料"在酶催 化反应中作为底物参加反应)以 7 苯丙氨酸解氨酶作为催化剂"催化转化底物 H7 苯丙氨酸中的 7 苯丙 氨酸生成反式肉桂酸和氨"而H 苯丙氨酸完全不参加反应"作为目标产物被提取出来)通过不断流加底物" 目标产物H 苯丙氨酸的浓度增高"在酶反应液中形成结晶"直接分离)调节 9L至 & g"利用肉桂酸酸性环 境不溶于水的性质分离除去肉桂酸"然后浓缩结晶得到溶解于酶反应液中的 H 苯丙氨酸)H 苯丙氨酸粗 品经过膜过滤脱色和重结晶就可以精制提纯 产品化学纯度和光学纯度高"制造成本低$文伟河%
$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"