全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
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收稿日期&$%%. 8&& 8&$
基金项目&科技部资助项目$$%%.PW(&%%,-%)天津市科委资助项目$%-KL^ L/*%,%%"%.K*KUS\%,$%%%
作者简介&吴"艳$&.!#%"女"山西大同人"硕士研究生"研究方向&生物传感器)张娟琨$联系人%"教授"XN<=;G& 34=?JVAe:HD:7B@H7C?
核酸适体生物传感器快速检测牛奶中抗生素
吴"艳"张娟琨"范"婷"李"敏"张彬彬"孙"坤"吴"萍
$天津科技大学 生物工程学院 天津市工业微生物重点实验室 教育部工业微生物重点实验室"天津 #%%,-%
摘"要&为了现场快速检测牛奶溶液中四环素类抗生素的含量"对电极进行阳极氧化(氨基化(活化等一系列处理"
将四环素核酸适体作为识别分子"共价固定于玻碳电极表面"构建出新型核酸适体生物传感器 传感器可以特异
性结合标本中四环素类抗生素"并产生电化学信号"强度与抗生素浓度相关 其最低检测量是&
!
J0T"检测时间
为 <;?
关键词&核酸适体生物传感器)四环素)检测
中图分类号&Z#.$f&&""""文献标志码&(""""文章编号&&)-$ 8#)-!$$%&%%%# 8%%,! 8%
Q51GJ0G0:G.2/275/G.M.2G.:1./H.6KMB 59G5H04M.210/124
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J0T=?@ :4B@B:BC:;>? :;N0B O24J1&=9:=DB?D>F) :B:F=COCG;?B) @B:BC:;>?
""核酸适体是一种独特的单链核苷酸"它可以广
泛地与非核苷酸靶目标物质进行高亲和力(高特异
性结合,&- "通过指数富集配基的系统进化技术"体
外筛选(扩增和富集获得,$ 8#- 在医学诊断和探测
实验中"核酸适体以它高效(灵敏等优点取代了抗
体"并得到广泛认可 四环素类药物以其优良的抗
菌性(稳定性以及低廉的价格"广泛用于动物疾病
的预防和治疗,, 8)- 但是"四环素类药物的滥用"导
致细菌耐药性增强"并直接危害消费者身体健康
因此为了保障公共健康安全"对四环素类药物的检
测至关重要 目前关于四环素类抗生素的检测方
法有酶联免疫法(薄层色谱法(毛细管电泳法等"但
这些方法都需要大型仪器且价格昂贵,-- 核酸适
体生物传感器与传统生物传感器相比有以下优
点,! 8.- &&%高亲和力"高特异性)$%体外筛选"易人
工合成)#%电极制作简便(使用寿命长),%核酸适体
结构简单"容易复性)%易修饰(灵敏度高))%成本
低(易微型化(无污染
Q>D4;@=等,&% 8&&-构建了 & 种酶分子核酸适体传
感器$(XS%"此外也有报道 & 种称作T=2BGNEFBB的传
感器,&$- "这 $ 种传感器的缺点是干扰信号多 本文
介绍的方法是对电极进行氨基化修饰"将核酸适体
共价固定于玻碳电极$X*X%表面"通过循环伏安法
给出的电化学信号检测标本中的四环素类抗生素
浓度
E?材料与方法
EPE?材料
&f&f&"试剂
牛血清白蛋白$YS(%"北京鼎国生物技术有限
公司)碳二亚胺盐酸盐 $XU*%(羟基丁二酰亚胺
$/LS%"分析纯"上海 S=?G=?@ 国际化学品有限公
司)%f%& <>G0T9L)f%(-f% 的 5YS 缓冲液"自配)
%f& <<>G0Tc
#
\B$*/%
)
溶液"自配)四环素(青霉
素(土霉素"北京鼎国生物技术有限公司)# 氨丙基
三乙氧基硅烷"大连奥利凯化工有限公司)其他试
剂均为国产分析纯
&f&f$"仪器
Tc$%%(型电化学工作站"天津兰力科化学电
子高技术有限公司)三电极系统&玻碳电极$P*X%
为工作电极"(J0(G电极为参比电极"铂电极为对电
极)高速冷冻离心机"日本日立公司)UT&%$ 真空干
燥箱"天津市三水科学仪器厂)LL S 水浴锅"国胜
仪器实验厂)超声波清洗器"宁波新芝生物科技股
份有限公司
EPC?方法
&f$f&"工作电极的修饰
电极洗净后在室温下置于 # 氨丙基三乙氧基
硅烷盐酸溶液 $A$# 氨丙基三乙氧基硅烷%h
A$L*G%hA$水% i&h&h&%%中" # l水浴# 4进行
硅烷化"即在玻碳电极表面导入#/L
$
最后将电
极浸入&%%
!
T含有%f% <>G0TXU*和%f%# <>G0T
/LS溶液中"% l水浴活化.% <;?
&f$f$"核酸适体的固定
先将$
!
J0
!
T核酸适体&%
!
T滴至电极表面"
在红外灯照射下"交联& 4"再于!% l烘箱中烘烤
#% <;?进行固定"然后用二次蒸馏水清洗电极 次"
每次使用二次蒸馏水%
!
T"除去未共价固定的核
酸适体"洗液进行琼脂糖电泳 用氮气吹干电极表
面 最后用质量分数为 &kYS(封闭电极表面未结
合位点$ 4"蒸馏水清洗除去游离的YS(
&f$f#"试样测定
配不同浓度的四环素类抗生素溶液"间隔
<;?"在 8%f& gm%f) d电势区间做循环伏安测
试"扫描速率是%f% d0D 对5YS及牛奶中四环素(
土霉素(青霉素的浓度进行检测"并做了非特异性
对照实验 为了检测构建的核酸适体传感器的精
确度"配制 , 个浓度的四环素 5YS 溶液"做循环伏
安扫描的峰电流值 浓度标准曲线
C?结果与讨论
CPE?核酸适体最大固载量的确定
用玻碳电极P*X分别固定&%
!
T不同质量浓度
的核酸适体$,%(#(#%($
!
J0
!
T%"然后将清洗电
极游离核酸适体的洗液进行琼脂糖电泳"结果如图
& 所示 图 & 中"=为<=FABF"2为核酸适体模板 "C(
@(B(E分别是固定核酸适体的洗液$质量浓度 ,%(
#(#% 和 $
!
J0
!
T%
图 E?琼脂糖电泳图
Q.;=E?*;54210;06060:G429-2401.19.:G340
""由图 & 可以看出"直到核酸适体固定质量浓度
为$
!
J0
!
T时"电泳无明显条带"证明$
!
J0
!
T为
最大固定质量浓度 最后将清洗后的电极进行循
环伏安法扫描"结果如图 $ 所示
图 C?%,#固定核酸适体前后的循环伏安曲线
Q.;=C?,B:6.:R26G5HH2;45H:34R0127%,#
M072405/J57G04H2J.7.:5G.2/
.,"第 # 期 吴"艳等&核酸适体生物传感器快速检测牛奶中抗生素
由图 $ 可以看出"固定核酸适体的P*X循环伏
安曲线明显降低 证明核酸适体修饰成功 从电
化学信号可以看出核酸适体已被固定于玻碳电极
表面
CPC?核酸适体对四环素(土霉素及青霉素检测的响
应范围
""在选定的优化条件下"用共价结合了四环素核
酸适体的玻碳电极分别与含有不同浓度四环素(
土霉素( 青霉素的 c
#
\B$*/%
)
5YS 溶液和
c
#
\B$*/%
)
牛奶溶液反应 $%(%f%%&(%f%%(%f%&(
%f%&(%f%$(%f%#(%f%(%f%!(%f& 量浓度 电流曲线图如图 # g) 所示 图 # 中&=为
核酸适体生物传感器对四环素在 c
#
\B$*/%
)
5YS
溶液中的检测)2 为核酸适体生物传感器对四环素
在c
#
\B$*/%
)
牛奶溶液中的检测)C为核酸适体生
物传感器对土霉素在c
#
\B$*/%
)
5YS 溶液中的检
测) @ 为 核 酸 适 体 生 物 传 感 器 对 青 霉 素 在
c
#
\B$*/%
)
5YS溶液中的检测)B为核酸适体生物
传感器对土霉素在c
#
\B$*/%
)
牛奶溶液中的检测)E
为 P*X固定 @@U/(对四环素在c
#
\B$*/%
)
5YS
溶液中的检测)J为玻碳电极无修饰对四环素在
c
#
\B$*/%
)
5YS溶液中的检测
图 @?核酸适体生物传感器在不同浓度四环素(土霉素(
青霉素的N
@
Q0$,$%
W
X8!溶液(N
@
Q0$,$%
W
牛奶溶液中的对照浓度 电流曲线
Q.;=@?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127
59G5H04M.210/12457G045JJ.G.2/27
J.7040/G5/G.M.2G.:1:2/:0/G45G.2/127
N
@
Q0$,$%
W
X8!1263G.2/" N
@
Q0$,$%
W
H.6K1263G.2/5/J:2H954.12/
""由图 # 可以看出&固定核酸适体的玻碳电极
$构建的核酸适体生物传感器%对四环素(土霉素的
浓度 电流曲线变化很明显"说明四环素核酸适体对
四环素(土霉素有很好的特异性 对照实验 @ 曲线
变化不明显"说明核酸适体生物传感器对青霉素无
特异性 对照实验 E(J曲线变化也不明显"说明固
定 @@U/(的P*X和空白 P*X不能捕获四环素"对
四环素无特异性 接下来研究核酸适体在
c
#
\B$*/%
)
5YS 溶液和 c
#
\B$*/%
)
牛奶溶液中分
别对四环素和土霉素检测的响应范围
CP@?核酸适体分别对四环素(土霉素检测的响应范围
从图 ,可以看出"电流 浓度曲线变化很明显"证
明四环素核酸适体在c
#
\B$*/%
)
5YS 溶液中对四
环素类抗生素有很好的特异性 四环素和土霉素的
响应方程分别为 3
=
i8-f$# ,$m$f,!) #"I
$
=
i
%f.% )3
2
i8,f#-) -$m&f.&- "I
$
2
i%f.$ $
图 T?核酸适体生物传感器对不同浓度四环素(
土霉素的N
@
Q0$,$%
W
X8!溶液浓度
电流曲线
Q.;=T?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127
59G5H04M.210/12457G045JJ.G.2/27
J.7040/G5/G.M.2G.:1:2/:0/G45G.2/127
N
@
Q0$,$%
W
X8!1263G.2/
""从图 可以看出浓度 电流曲线变化明显"证明
四环素核酸适体在 c
#
\B$*/%
)
牛奶溶液对四环素
类抗生素也有很好的特异性 四环素和土霉素的
响应方程分别为 3
C
i8&$f#&,$m$f-)- "I
$
C
i
%f.- ,)3
@
i8-f#&. )$m$f$,! ,"I
$
@
i%f.. ,
图 ) 中& B为空白玻碳电极对四环素在
c
#
\B$*/%
)
5YS溶液中的检测)E为核酸适体生物
传感器对青霉素在 c
#
\B$*/%
)
5YS 溶液中的检
测)J为 核 酸 适 体 生 物 传 感 器 对 四 环 素 在
c
#
\B$*/%
)
5YS溶液中的检测) 4 为 P*X固定
@@U/(对四环素在c
#
\B$*/%
)
5YS溶液中的检测
$质量浓度范围&%f%%& g%f& 3
B
i8&f$.& $$m$f)" I
$
B
i%f.)# ,) 3
E
i8%f$,) #$m
$f&)"I
$
E
i%f.,! #)3
J
i8-f$# ,$m$f,!"I
$
J
i%f.% )
3
4
i8%f#% !$m&f-)"I
$
4
i%f.,, !
% 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 U?核酸适体生物传感器对不同浓度四环素(
土霉素的N
@
Q0$,$%
W
牛奶溶液浓度
电流曲线
Q.;=U?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127
59G5H04M.210/12457G045JJ.G.2/27
J.7040/G5/G.M.2G.:1:2/:0/G45G.2/127
N
@
Q0$,$%
W
H.6K1263G.2/
由图 ) 可以看出" E曲线变化缓慢"说明构建
的核酸适体生物传感器对青霉素无特异性 对
照实验 B和 4曲线无变化" 说明空白 P*X和固定
图 W?核酸适体生物传感器对照实验的浓度
电流曲线
Q.;=W?,2/:0/G45G.2/R04131:3440/G962G127
59G5H04M.210/124:2/G4260L904.H0/G
@@U/(的 P*X不能捕获四环素"对四环素无特异
性 为了证实传感器的精确度"配制了 , 个质量
浓度的四环素 5YS 溶液"循环伏安扫描的峰值和
浓度 电流标准曲线图比对产生对应的浓度"与实
际配制的浓度相比计算离散系数 *d值"结果见
表 &
表 E?四环素含量在X8!溶液中的测定
F5M60E?Y0G0:G.2/:2/:0/G45G.2/27G0G45:B:6./0742HX8!15H960
编号
"标准0
$8&
%
"测定0
$8&
%
"平均0
$8&
%
标准偏差 *d0k
& %f%$ %f%$) %f%$ - %f%%& %)% ))% ,f&$
$ %f%, %f%,- % %f%,) %% %f%%& ,&, $&, #f%-
# %f%) %f%)& % %f%)# %% %f%%$ !$! ,$- ,f,.
, %f%! %f%!$ % %f%!# % %f%%$ &$& #$% $f,
@?结?论
通过对玻碳电极固定四环素核酸适体"制备
了可快速现场检测牛奶中四环素类抗生素的新型
核酸适体生物传感器 用循环伏安扫描检测"得
到四环素类抗生素浓度与峰电流的工作曲线"检
测限为 %f%%& %f& 器对四环素类抗生素能表现出很好的特异性 新
型核酸适体生物传感器可以广泛应用在临床医学
检验(基因工程(环境监测和食品工程等领域"随
着研究的不断深入和技术的更加完善"这种新型
核酸适体生物传感器一定会在诊断(治疗(检测中
发挥重要作用
参考文献&
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CF>2;=G=?@ ];F=G9=:4>JB?D,W-7Y;>DB?D>FD=?@ Y;>BGBC:F>?;CD"
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:4=:2;?@ D9BC;E;CG;J=?@D,W-7/=:HFB"&..%"#,)&!&!N!$$7
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B?F;C42=C:BF;>94=JB_, U/(9>GO,W-7SC;B?CB"&..%"$,.&%N&%7
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;`:4 >IO:B:F=COCG;?B;? :4B:FB=:EC=DB>HDGO<94=@B?;:;D;?
D4BB9,W-7dB:BF;?=FOZBC>F@"$%%)"&.$-%&$&)N$&-7
,)-"a>G;?=("a>G;?=a5"(G:4=HDZT"B:=G7ZBD;@HB9BFD;D:B?CB;?
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&"第 # 期 吴"艳等&核酸适体生物传感器快速检测牛奶中抗生素
,--"+A=L"[:>Q"a=:DH<>:>L7*4F><=:>JF=94;C=?=GOD;D>E:B:F=CON
CG;?B=?:;2;>:;CD;? E>>@D,W-7W>HF?=G>E*4F><=:>JF=94O("
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W"B:=G7(9:=J?;:;>? BGBFG=2BGNEFBB=?=GO:;C=G
@B];CBD,W-7_FB?@D;? (?=GO:;C=G*4B<;D:FO"$%%!"$-&,#-N,,)7
,&%- Q>D4;@=M"S>@Bc"[AB2HAHF>c7(9:=F
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,&&- Q>D4;@=M"S>@Bc"[@B2HAHF>c7L><>JB?B>HDU/(DB?D;?JHN
D;?JB?3OC4B94ODZBD
*><<"$%%)"#,!&$,N$$7
,&$- dBG=DC>NP=FC;=a/"a;DD=;G;@;DS7/B` :FB?@D;? =9:=BGBC:F>C4B<;C=GY;>DB?D>FD,W-7PB?B_4BF=9O=?@ a>GBCHG=FY;N
>G>JO"$%%."&#$&%&
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&N&%7
最新专利文摘
*/&%&)-)#.."生物转化玉米芯生产木糖醇的工艺方法
本发明提供了一种生物转化玉米芯生产木糖醇的工艺方法"属于功能糖生产技术领域 其工艺方法包
括如下步骤&玉米芯的预处理(玉米芯的酶解(液体菌种的制备(木糖醇的发酵生产(发酵液的分离与提纯
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""*/&%&)-&-&)"生物酶不对称转化生产H 苯丙氨酸的方法
本发明属于生物工程领域中的酶工程技术"所要解决的技术问题是提供一种生产过程简单(能够降低
生产成本的H 苯丙氨酸生物酶不对称转化的制造方法 其技术要点&以H7 苯丙氨酸为生产原料"在酶催
化反应中作为底物参加反应)以 7 苯丙氨酸解氨酶作为催化剂"催化转化底物 H7 苯丙氨酸中的 7 苯丙
氨酸生成反式肉桂酸和氨"而H 苯丙氨酸完全不参加反应"作为目标产物被提取出来)通过不断流加底物"
目标产物H 苯丙氨酸的浓度增高"在酶反应液中形成结晶"直接分离)调节 9L至 & g"利用肉桂酸酸性环
境不溶于水的性质分离除去肉桂酸"然后浓缩结晶得到溶解于酶反应液中的 H 苯丙氨酸)H 苯丙氨酸粗
品经过膜过滤脱色和重结晶就可以精制提纯 产品化学纯度和光学纯度高"制造成本低
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$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"