全 文 ：生物技术通报
·综述与专论· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
VD3 羟基化酶的定向研究进展
刘苗  汪永辉  陆群
（西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031）
摘 要： 维生素 D3 羟基化酶（Vdh） 作为细胞色素酶 P450s（CYP） 蛋白家族成员，催化 VD3 形成有生物活性的 1α，25（OH）
2VD3。但是，由于 VD3 并不是 Vdh 的天然底物，Vdh 羟基化活性较低。采用定向构建 Vdh 重组质粒的方法对 Vdh 催化活性位点给
予优化，从而提高其羟基化能力。就目前对 Vdh 的结构特性和定向研究进行综述。
关键词 ： Vdh 异源表达 氧化还原蛋白 定向突变 25（OH）VD3 1α，25（OH）2VD3
Advances in Directed Research of VD3 Hydroxylase
Liu Miao Wang Yonghui Lu Qun
（School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong Uiversity，Chengdu 610031）
Abstract: Vitamin D3 hydroxylase is a cytochrome P450（CYP）responsible for the biocatalytic conversion of vitamin D3 to 1α, 25-
dihydroxyvitamin D3（1α, 25（OH）2VD3）。Since VD3 is not a natural substrate for Vdh, the hydroxylase of Vdh is quite low. Researchers
construct a novel of recombination Vdh plasmid by directed evolution to optimize the active sites of catalytic structure, thereby improving the
hydroxylase ability. This article reviewed Vdh structure properties and development of directed evolution.
Key words:  Vdh Heterologous expression Redox partner protein Directed evolution 25-hydroxyvitaminD3 1α 25-dihyroxyvitamin D3
VD3 是一种脂溶性的激素原， 它主要是经紫外
线照射从皮肤内的 7-脱氢胆固醇转化而来， 或是从
食物当中获取［1，2］。在哺乳动物中，VD3 没有生物
活性， 因此必须利用细胞色素酶 P450s（CYPs） 对
VD3 进行羟基化， 转化成有生物活性形式的 VD3，
即 25-OHVD3，1α，25-（OH）2VD3。在人体内， 首
先是由肝脏中的 CYP27A1 催化形成 25-OHVD3， 然
后再由肾脏中的 CYP2R1 催化形成 1α，25-（OH）
2VD3， 通 过 这 两 步 反 应 完 成 了 VD3 -1α，25（OH）
2VD3 的转化过程。活性 1α，25（OH）2VD3 在体内
与维生素 D 受体结合（VDH） 可以调节钙磷代谢，
以及调控多种细胞应答， 如细胞分化和细胞增殖等。
1α，25（OH）2VD3 及其衍生物在临床上已经被用
于治疗慢性肾功能衰竭、甲状旁腺功能亢进、骨质
疏松以及银屑病等疾病［3，4］。虽然从胆固醇到 1α，
25-（OH）2VD3 的化学合成路线已经成熟， 但是其
收稿日期 ：2013-08-09
总产率却不到 1% 。工业上， 一般采用生物合成的
方法， 只需要一步就能实现 VD3 的转化过程， 且成
本低， 对环境的污染小。而实现这种生物催化反应，
关键在于反应所使用的微生物菌株以及 VD3 羟基化
酶（Vdh） 的手性和特异性结构域［2］。
大多数的细菌、真菌及放线菌如假诺卡氏菌
属自养菌株， 链霉菌属等微生物都能将无生物活性
VD3 转化成有生物活性的 1α，25（OH）2VD3
［2］。在
工业上一般采用环糊精作为底物载体， 但是运用这
种方法酶的转化能力较弱， 且副反应多， 转化菌株
的生长速度低。因此为了提高 Vdh 的反应活性， 有
必要对 VD3 羟基化酶的特性以及定向研究进行概述
和分析。
Vdh 属于 CYP107 蛋白家族成员。CYP107 酶是
一个超家族， 其共同特点是含有一非共价键结合的
血红素， 是一个内膜蛋白， 牢固地结合在细胞内膜
作者简介 ： 刘苗， 女， 硕士研究生， 研究方向 ： 生物转化 ；E-mail ：920946828@qq.com
通讯作者 ： 陆群， 男， 副教授， 硕士生导师， 研究方向 ： 微生物药学、生物催化与降解、反应器与生化工艺学原理 ；
E-mail ：luqun1125@126.com
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
上，需要 NADPH 的还原等价物和氧分子来氧化底物，
NADPH 提供的电子需要氧化还原伴侣蛋白将其传递
到细胞色素酶 P450 酶上。天然的 P450s 大多为脂溶
性的， 其在细胞内的表达水平比较低， 不利于工业
化生产。为了扩大 P450s 的应用以及增加其利用度，
因此有必要提高 P450s 包括底物作用域、区域选择
和立体选择性、催化活性、抑制作用及联合表达等
在内的催化活性。
vdh 异源细胞表达
由于游离的 Vdh 活性不高， 结构不稳定， 体外
反应常表现出广谱底物活性。所以研究者一般采用
异源表达系统即宿主-载体系统表达 Vdh 基因（vdh）。
大肠杆菌、酵母等作为宿主系统具有生长快， 容易
操作等优点。放线菌基因组中含有许多 P450 酶的
基因， 具有稳定的氧化还原反应环境。因此放线菌
如链霉菌、假诺卡氏菌、红平红球菌等均可作为良
好的 Vdh 宿主菌株。Sakaki 等［5］成功利用大肠杆
菌（E.coli） 表 达 小 鼠 25（OH）VD3 1α-羟 基 化 酶。
Kawauchi 等［6］ 从自养无枝酸菌杆菌 FEM BP-1573
中分离出 P450VD25（CYP105A2）， 成功地在变铅
链霉菌（S.lividans） 中表达。Fujii 等［2］以放线菌属
红平红球菌（Rhodococcus erythropolis） 为宿主细胞
建立了 CYP107（Vdh） 的表达系统， 使 CYP107 的
羟基化能力特异性增强。酵母细胞表达系统能识别
线粒体和微粒体 P450 酶的靶向信号序列。由此相
关学者从人类细胞组织中分离出 CYP2R1 基因， 转
入大肠杆菌或酿酒酵母菌（S.cerevisiae） 中表达， 其
CYP2R1 的表达水平显著增加。该研究发现重组的
酵母细胞具有单氧合酶的活性， 能在细胞溶质和细
胞膜上形成电子传递链［7］。删除人 CYP2R1（ 维生
素 D325-羟基化酶） 与老鼠 CYP2J3（ 维生素 D325-羟
基化酶） 疏水性区域的氨基酸残基后， 导入大肠杆
菌中表达，25（OH）VD3 1α 羟基化活性特异性增加。
重组的酵母细胞功能性地表达人 CYP2R1， 加入底
物后， 能将 VD3 催化形成 25（OH）VD3
［8，9］。不同
的 Vdh 在不同的异源表达系统表达水平不同。因此
表达不同的 vdh 时应选择合适的宿主细菌。合适的
异源细胞表达系统不仅能实现维生素 D3 的羟基化过
程， 还能合成新的代谢产物， 并且在野生型和突变
型羟基化酶的对比研究中发挥中至关重要的作用［9］。
图 1 和图 2 分别为各种细菌和哺乳动物中 VD3 25-和
25（OH）VD31α-羟基化酶以及它们的异源表达系统。
表 1 VD3 25-羟基化酶及其异源表达系统［1-9］
种类 CYP 表达
浅灰链霉菌 105A1 大肠杆菌 / 变铅链霉菌
假诺卡氏菌
（P seudonocardia.autotrophica）
107 大肠杆菌 / 酵母菌
老鼠， 人类 27A1 大肠杆菌 / 红平红球菌
老鼠 27B1 大肠杆菌
人类 2R1 大肠杆菌 / 酵母菌）
老鼠 2J3 大肠杆菌
猪 2D25 酿酒酵母菌）
表 2 25（OH）VD3 1α-羟基化酶及其异源表达系统［6-9］
种类 CYP 表达
假诺卡氏菌 107 大肠杆菌 / 红平红球菌
浅灰链霉菌 105A1 大肠杆菌 / 变铅链霉菌
老鼠， 人类 27A1/27B1 大肠杆菌
猪 2D25 酿酒酵母菌
2 Vdh 与氧化还原伴侣蛋白协同表达
大多数天然的 Vdh 如果单一的在宿主细胞中
表达， 那么它的羟基化能力较弱。因此，Vdh 在宿
主细胞表达的同时需要氧化还原蛋白作为分子伴侣
协同表达， 提高酶表达量。常用的分子伴侣为铁氧
还原蛋白， 如 ThcD 、AciC 、Fdx 、Fdr 和 AciB 等［2，
10］。Vdh 是一类微粒体 P450 酶， 能够接受 NADPH-
细胞色素 P450s 还原酶提供的电子。铁氧还原蛋白
酶将 NADH 供体提供的电子转移到 Vdh 的血红素结
构域。Fujii 等［2］发现 Vdh 基因若单独在宿主细胞当
中表达，VD3 的 C-25 位羟基化活性较低（20.2 mmol/
，min/mol） 然而氧化还原伴侣蛋白 ThcC/ThcD-VDh 重
组基因在宿主细胞当中联合表达后，Vdh 的 C-25 的
羟基化活性增加了近 6 倍（119.2 mmol/min/mol）。这
些数据说明尽管内源性的氧化还原分子同时在宿主
细胞当中表达，Vdh-氧化还原伴侣蛋白的联合表达
也能增强该酶的羟基化活性。Sawada 等［11］成功地
构建了人的 CYP27B1 和牛的 ADX，ADR 的表达质粒，
然后导入大肠杆菌细胞中表达。CYP27B1 羟基化活
性特异性增加。这就说明了电子通过 ADX 和 ADR
29 2014年第1期 刘苗等 ：VD3 羟基化酶的定向研究进展
从 NADPH 成功地转移到了 CYP27B1， 形成电子传
递链。Strushkevish 等［12］发现人类 CYP2R1 与分子
伴侣蛋白 GroEL/ES 在大肠杆菌中协同表达， 发酵培
养物中 25（OH）VD3，1α，25-（OH）2VD3 的产量
显 著 增 加［12］。CYP27B1 是 25（OH）VD3 的 1α 羟
基化酶，催化 1α， （OH）25- 2VD3 的形成。Uchidaa 等
［13］
将小鼠体内的 CYP271-GroEL/ES 重组基因导入到大
肠杆菌中过量表达，CYP27B1 的表达水平远高于野
生型。而缺少 GroEL/ES 分子伴侣蛋白时，CYP27B1
酶的结构发生折叠导致表达水平降低。放线菌类菌
株含有稳定的 Vdh， 并且具有电子转移蛋白酶， 提
供了氧化还原反应的环境。因此， 放线菌常用来作
为工业上进行羟基化反应的宿主菌株。目前将氧化
还原蛋白融合到 Vdh 的表达质粒中协同表达是提
高 Vdh 的 25-和1α-羟基化活性一种有效的基因重组
方法。
3 诱导表达重组质粒
构建 Vdh 表达质粒的试验中， 研究者发现构建
/的重组质粒在大肠杆菌（E.coli）链霉菌（Streptomyces）
中的表达水平较低， 因此他们在试验过程中加入诱
导剂诱导重组质粒的表达， 提高 Vdh 的表达水平。
常用的诱导剂为丙酮、硫链丝菌素等。Fujii 等［14］
构 建 了 PTAOR3-VDh-boxAB 重 组 质 粒， 导 入 到 P.
autotrophica 中表达， 细胞提取物利用 SDS-PAGE 和
CO 差谱分析法（CDSA） 测定其 Vdh 的活性。分析
发现在加入丙酮的细胞提取物中，CDSA 在 P450 nm
处有显著的吸收峰， 而没有加入丙酮的细胞提取物
中，CDSA 在 P450 nm 处没有明显的吸收峰。SDS-
PAGE 数据也显示丙酮能诱导 PTAOR3-VDh-boxAB
的表达。分析结果表明丙酮能作为诱导剂诱导分子
伴侣蛋白 boxAB 和 VDh 活性的表达。同样地， 相关
学者在构建 VDh-Fdx-Fdr 的表达基因的同时， 采用
硫链丝菌素作为诱导剂诱导重组质粒在红平红球菌
中表达。结果在红平红球菌的培养中检测到大量的
VD3 的活性形式
［15］。这些数据说明宿主细胞在表达
Vdh 和氧化还原伴侣蛋白的重组基因时， 都需要加
入诱导剂诱导其表达。
4 定向构建 Vdh 的突变体
由于 VD3 并不是 Vdh 的天然底物， 所以研究者
们采用定向诱变 Vdh 基因， 改变底物识别域的结合
位点来获得更高酶活性的 Vdh［16］。Fujii 等［2］先从
假诺卡氏属自养无枝酸菌 NPRC12473 分离得到 Vdh
基因， 经随机突变， 将其突变基因克隆到载体 PET-
aciBC 上， 然后转入大肠杆菌中表达， 从 1 000 个转
化物中分离得到 8 个高活性突变体， 得到 4 个最佳
氨基酸置换， 构建出 Vdh-K1 的突变体。同样地， 定
点突变也检测到了这个 8 个活性位点。在这 8 个活
性位点中，Fujii 分析出 4 个最佳氨基酸置换点（T70R，
V156S，E216A，E384R）。相对于野生型基因表达
活性而言， 其中每一个突变体在大肠杆菌中 Vdh 表
达活性都提高了 2-3 倍。这 4 个突变基因同时在大
肠杆菌中表达，Vdh 的羟基化的活性会提高 7.9 倍。
Fujii 将这 4 个最佳的基因置换组合整合到前面所得
到的 Vdh-K1 的突变菌株中表达， 得到光谱数据显
示 Vdh 25-羟基化的活性提高 12 倍，25（OH）VD3
的 1α-羟基化活性提高近 22 倍（ 相对于野生型 Vdh-
WT）［1，2，16］。文献报道在 Vdh-K1 的培养物中， 科学
家 们 不 仅 发 现 25（OH）VD3，1α，25（OH）2VD3
的含量明显增加， 还检测到少量的 26（OH）VD3，
但并没有检测到 1α（OH）VD3 分子
［1，17，18］。晶体
结构分析［1］表明 Vdh-K1 的 4 个氨基酸替换不是位
于酶的底物结合位点上， 而是在酶结构呈分散排列。
不管有无底物的结合， 突变型 Vdh-K1 呈封闭的分子
构象， 末端的血红素囊状结构暴露在溶剂中 ； 野生
型 Vdh-WT 却呈现开放式的分子构象。这些结果表
明通过 4 个氨基酸替换（T70R 、V156S 、E216A 和
E384R） 使得 Vdh 分子构象平衡从开放式向封闭式
构象移动［1］。Hayashi 等［19］通过对细胞色素酶 P450
（CYP）105A1 基因定向诱变， 获得 R73V/R84V 双
突变体， 该突变体能实现 VD3 -1α，25（OH）2VD3
过程的高转化。突变点 R73V/R84V 位于 CYP105A1
基因中底物识别域上， 具有 25（OH）VD31α-高羟基
化能力［16］。他们在变铅青链霉菌 TK23 进行重组表
达， 并且在该链霉菌的培养物当检测到大量的 1α，
25（OH）2VD3， 除此之外， 还检测到新的代谢产物
，26（OH）3D3 和 1α，25（S）1α，25（R） ，26（OH）
3D3
［16，20］。这两种新的代谢产物同样也具有抗增殖
活性和低血钙活性， 但二者的转化率不高。通过
晶体结构分析和 Docking 软件模拟底物结合方法，
30
5
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
Hayashi 等［19］ 证 实 了 R73V/R84A 突 变 体 具 有 VD3
C25，C1 和 C26（C27） 的羟基化的能力。从浅灰链
霉菌中提取出的 P450 酶系 CYP105A1 具有 VD2 和
VD3 的羟基化能力。Omer 等
［20］通过在 CYP105A1
（P450SU-1）N 端添加靶向信号序列， 成功地将其导
入到高等植物中的叶绿体中表达。Sawada 等［21］成
功地将浅灰链霉菌的 CUP105A1 重组基因导入到大
肠杆菌中表达， 提高了 VD3 25-和25（OH）VD3 1α-
羟基化活性。Seifert 等［22，23］ 针对 CYP102A1 催化
位点上 F87 和 A328 两个氨基酸残基进行定点突变，
获得 24 种新的突变体。这些系列突变体能识别多
种底物， 产生广泛而有效的环化和非环化的羟基化
合物。
经过定向诱变， 获得高活性 Vdh 突变体， 突变
体不仅具有更高酶的活性， 并且对反应活性位点具
有高度选择性。新的稳定构象通常具有不同的功能
特异性， 因而产生不同的区域选择和立体选择性，
识别不同的 VD3 底物分子， 得到新的具有抗增殖，
低血钙等生物学功能的 VD3 活性药物。为临床上治
疗维生素 D 类疾病提供有效的途径。
展望
为了提高 Vdh 羟基化能力， 研究人员采取异源
表达系统表达 vdh， 协同表达氧化还原分子伴侣蛋白
提高 Vdh 重组质粒的表达水平， 加入诱导剂或启动
子启动重组质粒的表达， 定点突变 Vdh 活性位点提
高酶的羟基化能力。除此之外， 在表达 Vdh 基因同
时， 有相关学者［10，19］采用添加抗生素例如乳链球
菌素（nisin） 等方法形成乳链球菌素-脂质微孔复合
物， 形成 VD3 -PMCD 复合物的离子通道， 提高 Vdh
的羟基化活性。除了上述方法外，VD3 -PMCD 复合
物进入细胞机制的研究， 以及 Vdh-底物晶体结构分
析， 相应靶向信号蛋白序列的添加或抑制酶活性的
氨基酸残基的删除，Vdh 的区域和立体选择性和有
序羟基化反应的分子机制的研究等蛋白工程方面都
是未来获取更高酶活性 Vdh 的研究重点， 为 Vdh 的
定向研究提供新的方向和前景。相信随着生物技术
的快速发展， 活性维生素 D3 药物的生物制备将会得
到新的突破。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）