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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):66-70
猪肉品质已经被列入猪的品种选育的重要技术
指标，劣质猪肉表现为 PSE（Pale，soft，exudative）
肉 和 DFD（Dark，firm，dry） 肉 猪。 自 1953 年
Ludvigsen 首次提出 PSE 猪肉概念以来，在世界各地
均有类似报道［1］。美国 PSE 猪肉发生率为 5%-20%，
日本为 8.5%-11.5%［2］，丹麦为 10%-15%［3］。我国
各地 PSE 猪肉发生率在 10%-30% 之间，个别地区
高达 60%-70%。猪骨骼肌兰尼定受体（Ryanodine
receptor 1，RYR1）基因的有害突变型为氟烷基因
（halothane，Haln），是导致猪应激综合征（Porcine
stress syndrome，PSS）、 发 生 恶 性 高 温 综 合 症 状
（malignant hyperthermia syndrome，MHS）、产生 PSE
肉或 DFD 肉的遗传基础［4］，由于兰尼定受体 cDNA
的 C1843 → T1843 突变使兰尼定受体蛋白结构和功能的
收稿日期 ：2014-09-22
基金项目 ：贵州省农业动植物育种专项项目［黔农育专字（2011）019 号］，贵州省农业攻关项目［黔科合 NY（2013）3071 号］，贵州省工
程中心建设项目［黔科合农 C 字（2011）4022 号］
作者简介 ：冯文武，男，硕士研究生，研究方向 ：动物繁殖与动物生物技术 ；E-mail ：15285116946@139.com
通讯作者 ：陈祥，博士，教授，硕士生导师，研究方向 ：动物繁殖技术与动物生物技术 ；E-mail ：as.xchen@ gzu.edu.cn
贵州地方猪种及三元商品猪氟烷基因的检测
冯文武1  龙威海1  丁玫3  陈祥1，2  陈村年2
（1. 贵州大学动物科学学院 高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025 ；2. 贵州省生猪健康养殖工程技术研究
中心，贵阳 550025 ；3. 贵州省畜牧兽医学校，贵阳 550018）
摘 要： 旨在对贵州地方猪种“抗应激敏感基因专门化品系”的培育提供技术支撑，运用 PCR-RFLP 技术对白洗猪、黔北黑
猪、宗地花猪、糯谷猪和从江香猪 5 个地方猪种及三元商品猪共 151 份样本进行了氟烷基因检测，筛选出猪群中应激敏感基因隐
性携带型 HalNn、抗应激敏感基因型 HalNN 和应激敏感基因型 Halnn。结果表明，贵州 5 个地方猪种全为 HalNN 型 ；三元商品猪群无
Halnn 型，HalNn 型检出率为 52.63%，Haln 型等位基因频率为 26.32%。
关键词 ： 氟烷基因 ；RYR1 基因检测 ；繁殖力 ；PSE 肉 ；肉质
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.010
Detection of the RYR1 Gene in Guizhou Indigenous Pigs and
Three-crossbred Pigs
Feng Wenwu1 Long Weihai1 Ding Mei3 Chen Xiang1，2 Chen Cunnian2
（1. Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，College of
Animal Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025 ；2. Guizhou Engineering Technology Research Center for Healthy Pig Breeding，
Guiyang 550025 ；3. Guizhou Husbandry Animal Science Vocational School，Guiyang 550018）
Abstract ： To provide the technical support for the cultivation of "strain of specialization with anti-stress and sensitive gene" of Guizhou
local pig genes, the RYR1 gene in 151 samples from 5 local pig species of Baixi, Qianbei Black, Zongdi Hua, Nuogu, Congjiang Xiang and three-
crossbred commercial pig were detected by PCR-RFLP technique. The pigs with HalNn of recessive anti-stress and sensitive genotype, HalNN
of anti-stress and sensitive genotype and Halnn of stress and sensitive genotype were screened out. The results showed that all of 5 Guizhou
indigenous pigs belonged to HalNN , there was no Halnn gene in the three-crossbred pigs, HalNn accounted for 52.63 % of the samples, and
Haln allele frequency was 26.32%.
Key words ： halothane gene ；detection of RYR1 gene ； fertility ；PSE pork ； meat quality
2015,31(8) 67冯文武等：贵州地方猪种及三元商品猪氟烷基因的检测
改变，导致了劣质猪肉的产生［5］。现大量研究表明，
氟烷有害基因还对猪的繁殖力有影响，Haln 型相对
于 HalN 型在繁殖性能上表现为一定的劣势［6］。在
我国大多数地方猪种未见报道有 Haln 基因［7-9］，仅
少数品种有 Haln 基因存在，如民猪 Haln 基因频率为
15.62%［9］。随着人们生活水平的不断提高，消费者
对肉质提出了更高的要求，猪肉不仅要卫生，而且
还要瘦肉率高、口感好，生产优质猪肉已迫在目睫。
因此，对猪进行基因诊断，对 PSE 猪肉和 DFD 猪肉
的形成机理进行探讨，找出有效的防控措施，建立“抗
应激敏感基因专门化品系”，具有重要的经济价值和
实际意义。本研究针对贵州省 5 个地方猪种及较为
普及的三元商品猪生产基地进行氟烷基因检测研究，
旨为贵州地方猪种“抗应激敏感基因专门化品系”
的培育提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
白洗猪 36 份血样采集于贵州省施秉县，地方猪
种 DNA 样黔北黑猪 14 份、糯谷猪 22 份、宗地花猪
31 份、从江香猪 29 份皆为本实验室保存样，三元
商品猪 19 份血样采集于贵阳市某种猪场。
血液基因组柱式小量提取试剂盒与 2×Es Taq
MasterMix 购于康为世纪生物科技公司，限制性内
切酶 Hha I 购于宝生生物工程（大连）有限公司，
DNA Marker 购于生工生物工程（上海）有限公司，
引物合成由生工生物工程（上海）有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩增 按血液基因组柱式小量提取试剂
说明书提取 DNA 后，扩增 RYR1 基因的 DNA 片段。
引物设计［5］，上游引物 ：5-TCCAGTTTGCCACAGG-
TCCTACCA-3 ；下游引物 ：5-ATTCACCGGAGTGG-
AGTCTCTGAG-3。欲扩增产物是含 RYR1 基因 cDNA
第 1 843 位点长度为 660 bp 的片段。PCR 反应体系
20 μL：2×Es Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物各 0.8
μL（10 μmol/L），基因组 DNA 模板 2 μL，加灭菌水
至终体积 20 μL。PCR 扩增条件 ：95℃预变性 5 min，
95℃变性 30 s，55-65℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，
35 个循环 ；72℃延伸 7 min，4℃保存。扩增产物经
1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 酶切反应 酶切反应体系 50 μL ：10×Quick
Cut Green Buffer 3 μL，10 μL PCR 产物，限制性内切
酶 Hha I 1 μL，加灭菌水至终体积 30 μL。混匀试剂
后瞬时离心，37℃水浴酶切 10 min。酶切产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果
2.1 PCR反应条件优化
通 过 DNA 池 技 术 摸 索 最 佳 PCR 反 应 条 件，
RYR1 基因 cDNA 含第 1 843 位点长度为 660 bp（全
序列 17 721 bp-18 381 bp 片段）的片段在 20 μL PCR
反应体系中，退火温度 63℃反应条件下扩增良好。
对各样分别进行 PCR 扩增，扩增出 660 bp 的目的条
带（图 1）。
660
2000
bp
1000
750
500
250
100
bp
1 2 3 4 5 6 M
M ：Marker ；1-6 ：分别依次代表宗地花猪、糯谷猪、从江香猪、黔北黑猪、
白洗猪及三元商品猪 PCR 扩增产物
图 1 各猪种 RYR1 基因 PCR 产物
2.2 RYR1基因RFLP分析
Hha I 内切酶的识别位点为 5-GCG↓C-3。PCR
扩增产物是含 RYR1 基因 cDNA 第 1 843 位点长度为
660 bp 的片段，根据电泳图谱中的带型判断氟烷基
因型。如果猪的基因型为 HalNN，由于胞嘧啶未突变
成胸腺嘧啶，扩增产物被酶切为 494 bp 和 166 bp，
因此电泳形成两条带 ；如果基因型为 Halnn 时，发生
基因突变的酶切位点消失，Hha I 内切酶不能识别，
对 PCR 产物不能酶切，所以只能看到 660 bp 1 条带；
如果猪的基因型为 HalNn 杂合子，扩增产物则可以电
泳形成 660 bp、494 bp 和 166 bp 3 条带［11］。酶切产
物经 1% 琼脂糖凝胶电泳，可以观察到 RYR1 基因
的 DNA 酶切片段（图 2）。经检验，三元商品猪 19
份样品中检测出 10 份样品 RYR1 基因型为 HalNn、9
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.868
份样品为 HalNN、无 Halnn。
2.3 RYR1基因C1843→T1843突变的基因型频率和基
因频率
对白洗猪、黔北黑猪、宗地花猪、糯谷猪及从
江香猪 5 个贵州省地方猪种 132 份样品进行了检测，
全为 RYR1 基因抗应激敏感 HalNN 型，三元商品猪
19 份样品中检测到两种基因型，应激敏感基因隐性
携带型 HalNn 与抗应激敏感 HalNN 型，未检测出应激
敏感基因型 Halnn，RYR1 基因 cDNA C1843 → T1843 突
变的基因型频率和基因频率，如表 1 所示。
表 1 三元商品猪 RYR1 基因 C1843 → T1843 突变的基因型频
率和基因频率
等位基因频率 /% 基因型频率 /%
N n NN Nn nn
73.68 26.32 47.37 52.63 0
3 讨论
3.1 氟烷基因检测在生产中的引物设计
氟烷基因检测技术在指导生产过程中引物设计
至关重要，引物设计可根据 GenBank 中的猪 RYR1
基因序列进行设计，亦可参考已发表研究报告中提
供的参考序列。常见的氟烷基因 3 个引物设计序列
见表 2，本研究采用 Fujii 等［5］设计的引物，引物在
PCR 扩增体系中最适温度条件为 63℃。
3.2 RYR1基因型频率和基因频率对比
在近年的研究报道中，国外引进猪种 n 型等位
基因频率较高，皮特兰猪、英国大白猪、台湾杜洛
克猪、丹麦杜洛克、迪卡猪 C 系、迪卡猪 F 系的
Haln 型等位基因频率分别为 100%、12.5%、5.3%、
4.6%、8.3% 及 4.2%［13］。本实验对 5 个贵州省地方
猪种及三元商品猪共 151 份样本的 RYR1 基因限制
性内切酶片段长度多态性进行了检测。结果表明，5
个贵州省地方猪种中全为抗应激敏感基因 HalNN 型，
三元商品猪群中检测到 10 例应激敏感基因隐性携
带型 HalNn，占猪群体的 52.63%（n=19），Haln 型等
位基因频率为 26.32%。结果中三元商品猪 Haln 型
等位基因与国外猪种相比，国外种猪 Haln 型等位基
因频率保持较高水平 ；与朱锋钊［14］报道的外三元
猪群 RYR1 基因 HalNn 型比例为 11.11%、Haln 型等
位基因频率为 5.56% 相比，HalNn 型基因比例上升了
41.52%，Haln 型等位基因频率上升了 27.62%，HalNn
型基因在试验三元商品猪群中的比例呈明显上升趋
势 ；本实验 5 个贵州本地猪种检测全为抗应激敏感
基因 HalNN 型，与朱锋钊［14］报道相同，且首次对贵
州省优良地方猪种白洗猪、黔北黑猪进行了 RYR1
基因检测，二者皆为抗应激敏感基因 HalNN 型。
3.3 RYR1基因对肉质的影响
近来的研究表明，Haln 等位基因的出现与欧洲
猪种的高瘦肉率选育直接相关［15］，RYR1 基因 HalNn
型猪与 HalNN 型比较，HalNn 型猪骨骼肌应激敏感性
高，应激易使肌细胞肌浆网终池中的钙离子大量快
速地释于肌浆，引起肌细胞快速收缩，随着 ATP 降
解供能，钙离子又被泵回肌浆网终池，肌浆内钙离
子浓度下降，肌细胞转入静息期。含 Haln 型等位基
因猪遇到应激时，如此反复刺激肌细胞并促使其生
长，肌肉生长的需求增加致使 Haln 型猪对饲料转化
成瘦肉的需求增加，瘦肉比重亦随之增大，故 Haln
型猪比正常猪肌肉更为发达。RYR1 基因的 n 型等
位基因与高瘦肉率正相关，但也具高的 PSE 发生率。
660
2000
bp
1000
750
500
250
100
bp
1 2 3 4 5 6 M
494
166
M ：DNA Marker ；1，4，5，6 ：酶切结果为 HalNn 型 ；
2，3 ：酶切结果为 HalNN
图 2 三元商品猪 PCR 产物酶切结果
表 2 常见的 3 对引物设计序列
设计者 引物序列（5-3）
孙敬礼等［10］ Primer F ：TCCAGTTTGCCACAGGCCA
Primer R ：ATTCACCGGATGGAGTCTCTGAG
刘桂琼等［12］ Primer F ：TGACCCCTAGGTGCTGGAT
Primer R ：GGAGGGTTCTAAGCTCTGGG
Fujii 等［5］ Primer F ：TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA
Primer R ：ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG
2015,31(8) 69冯文武等：贵州地方猪种及三元商品猪氟烷基因的检测
据研究，RYR1 基因 Halnn 型猪即使采用最优处理，
其产生 PSE 肉的比率也高达 80% 以上，RYR1 基因
HalNn 型猪产生各种劣质肉的比率达到 36.8%，显著
高于 HalNN 型猪 22.5% 的水平［16］。
3.4 RYR1基因对繁殖力的影响及效益分析
杜立新等［17］报道，HalNn 型母猪的产活子数比
Halnn 型多 1.74 头。Stalder 等［18］对某应激敏感合成
系研究表明，HalNN 型的 21 日龄成活率则比 HalNn
型高出 9.33%（P<0.05）。蒋思文等［19］报道，HalNN
型和 HalNn 型猪的窝总产仔数、窝产活仔数、初生
窝重及育成数、断奶窝重均极显著高于 Halnn 型猪
（P<0.01）， 断 奶 头 数 HalNN 显 著 高 于 Halnn 型（P<
0.05）。刘月环［20］报道，HalN 基因对总产仔数、20
日龄仔猪成活率、断奶前后仔猪的生长效应显著
（P<0.05）。总的来说，Halnn 型相对于 HalNN 和 HalNn
型在繁殖性能上表现出一定的劣势。刘桂琼等［12］
研究表明，Haln 基因对产仔数的遗传效应影响较大，
凡带有 RYR1 基因 Haln 型的母猪，其产仔数、产
活仔数比纯合 HalNN 母猪少，从头 3 胎总平均数看，
Halnn 母猪比 HalNN 母猪窝产仔数、产活仔数、断奶
仔 数 少 1.92、1.72 和 1.57 头，HalNn 母 猪 比 HalNN
母 猪 少 0.80、0.84 和 0.72 头。 本 研 究 商 品 群 体 中
HalNn、HalNN、Halnn 型比例为 52.63%、47.37% 和 0。
根据孟德尔遗传定律可测算出该商品猪群父母代猪
群基因型为 HalNN、HalNn、Halnn，基因型比例阈值为
0-47.37%、0-94.74%、5.26%-52.6%，按试验场 300
头基础母猪，利用年限 8 胎次，可计算出该场仅因
RYR1 基因对繁殖性能的影响，至少损失 808.55 头
猪仔。若对该场 300 头基础母猪及公猪进行 RYR1
基因检测，约花费检测成本 0.5 万元，对该场进行
氟烷基因筛选投资回报可观。
3.5 猪场氟烷基因型的净化
氟烷有害基因 Haln 型等位基因属氟烷敏感基因，
Fujii 等［5］对氟烷基因的克隆分析和比较正常猪与应
激猪兰尼定受体 cDNA 序列发现，兰尼定受体 cDNA
的 C1843 → T1843 突变使兰尼定受体蛋白结构和功能的
改变。这种改变导致劣质猪肉的产生［4］。氟烷基因
一方面导致肌细胞肥大，提高胴体瘦肉率，另一方
面易诱导发生恶性高热综合征产生 PSE 肉，降低肌
肉品质，随氟烷基因 n 型频率的增加，猪的肉质性
状、生长发育性状和繁殖性状都逐渐变劣［21］，已给
世界养猪生产造成了巨大损失。在常规育种过程中，
只是淘汰掉有应激综合征表现的隐性纯合个体，而
让杂合体自由繁殖，那么隐性基因频率在选育前几
年降低很快，以后则越来越缓慢，难以完全消除，
而氟烷基因杂合子猪在生产性能和体型外貌上具有
杂合优势，通过常规选种技术更易被选作种用［10］。
本研究对三元商品猪 19 份样本的 RYR1 基因多态
性检测结果说明，在猪群的父母代种猪中一定含有
RYR1 基因 HalNn 型猪、HalNN 型和 Halnn 型。从整个
养猪生产综合来看，Haln 等位基因具降低产出的效
应，因此有必要应用目前各种检测手段指导实际生
产，消除氟烷隐性及杂合有害基因，在种猪群中淘
汰这一基因，建立“抗应激敏感基因专门化品系”，
达到猪场氟烷应激敏感基因型的净化，最终生产出
优质的猪肉。
4 结论
本实验利用 PCR-RFLP 法对白洗猪、黔北黑猪、
宗地花猪、糯谷猪、从江香猪 5 个地方猪种及三元
商品猪共 151 份样本进行了 RYR1 基因检测，首次
对黔北黑猪和白洗猪 RYR1 基因检测进行报道，5
个地方猪种均不含氟烷敏感 Haln 型等位基因。本实
验三元商品猪群中 HalNn 基因型占猪群体的 52.63%
（n=19），Haln 型等位基因频率为 26.32%，HalNn 基
因 型 在 实 验 猪 群 中 的 比 例 较 大。 建 议 运 用 PCR-
RFLP 法对基础母猪 RYR1 基因型净化，在种猪群淘
汰 RYR1 基因 Haln 型等位基因，最终建立“抗应激
敏感基因专门化品系”。
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（责任编辑 狄艳红）