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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
收稿日期 : 2012-03-03
基金项目 :四川省教育厅重点项目（11ZA091）, 农业部行业专项（201003029）
作者简介 :杨辉 ,女 ,博士 ,讲师 ,研究方向 :分子植物病毒学 ; E-mail: yanghuixs98@sohu.com
通讯作者 : 黄云 ,男 ,博士 ,教授 ,研究方向 :植物病害及生物防治 ; E-mail: huangyun5787@sohu.com
BRI1-ASSOCIATED RECEPTORKINASE1
（BAK1）是位于细胞膜上的跨膜蛋白，能与一些识
别受体 （pattern-recognition receptors，PRRs）共同作
用［1， 2］激活植物的第一道免疫防线［3］。植物体中存
在很多与防御有关的受体类激酶 PRRs，可识别多种
病菌相关分子 （microbe-associated molecular patterns，
MAMPs），如 FLS2 和 EFR，分别识别细菌鞭毛蛋
白和延伸因子 Tu（EF-Tu），诱导植物防御反应
（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）激发
的免疫（PTI），这类似于动物的内源免疫防御［3， 4］。
虽然各种 MAMPs 或者病菌能被不同的 PRRs 识别，
但在细胞内的反应却有较大相似性。因此，推测存
在一些共同的分子联系这些信号，迄今发现的 BAK1
就可能参与这些免疫反应的中心调控作用［5］。近几
年的研究确定了 BAK1 对部分细菌和真菌的免疫调
节作用［6］，鉴于 BAK1 在植物体中的重要调节地位，
那么它是否也参与宿主对病毒的抗性呢？
植物常利用多种防御机制抵抗病菌侵染，一种
高效的防御反应是由植物抗性（resistance，R）基因
产物识别病菌相应的无毒子（avirulence，Avr）后介
导，它能迅速激发植物产生超敏反应（HR），将病
菌尽量限制在感染位点，并进一步诱导整株植物获
得抗性［7］。这种病菌和植物间的相互作用称为非亲
和互作，植株表现为抗病。但如果植物体缺乏相应
的抗性基因或病菌缺乏相对于抗性基因的 Avr 分子，
植株则会表现为感病，病菌和植物间的相互作用称
为亲和互作。本研究选用 TCV-Col-0 这个亲和互作
系统，排除抗性基因的干扰作用，以不同 BAK1 表
拟南芥 BAK1基因转化及防御作用
杨辉 闵东波 黄吉 唐亮 黄云
（四川农业大学农学院，成都 611130）
摘 要： 将拟南芥 BAK1基因采用 Gateway方法连接到植物表达载体，通过侵花粉管进行转化，从基因和蛋白表达水平检测
转化是否成功。以不同 BAK1表达水平植株作为试验材料，分析 BAK1在芜菁缩叶病毒（Turnip crinkle virus， TCV）-拟南芥（Col-0）
亲和互作系统中对植株防御的影响。结果显示，在接种 TCV后，BAK1缺陷型植株对 TCV较为感病，衰老相关基因表达水平增加，
表明 BAK1能够增强宿主对病毒的防御作用。
关键词： 芜菁缩叶病毒 BAK1 防御
Transformation and the Defense Role of BAK1 in Arabidopsis thaliana
Yang Hui Min Dongbo Huang Ji Tang Liang Huang Yun
（Agricultural College，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130）
Abstract: The PCR products of BAK1 were cloned into expression vector, which were transformed into Col-0 wild type by the floral
dipping method. We tested the BAK1 transcription levels and protein levels in transformed plants. We analyzed the defense role of BAK1 in
plants with different BAK1 expression level in the Turnip crinkle virus （TCV）-Arabidopsis thaliana （Col-0） interaction system. As a result,
loss of BAK1 function resulted in enhanced susceptibility to infection by TCV. The senescence-related transcript level was only increased in
bak1-4 mutants. These results indicated that BAK1 enhanced the resistance of the host to virus.
Key words: Turnip crinkle virus（TCV） BAK1 Defense
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期72
2012年第8期 73杨辉等 ：拟南芥 BAK1 基因转化及防御作用
2.2 Gateway方法构建植物表达载体
将获得的 PCR 产物与 pDONR 载体进行 BP 重
组反应，带 attB 接头的序列交换到 pDONR 载体上
置换出相应片段，该序列含有菌体致死基因，因
此，置换成功的载体转入大肠杆菌 DH5α 后，能够
在含 Zeocin 抗生素平板上生长，挑取长势较好的
菌落，摇菌，提取质粒。通过 PCR 及 BrsG Ⅰ酶切
鉴定，酶切结果及 PCR 产物见图 1-B、图 1-C，将
符合目的片段大小的质粒送至测序。以测序正确的
pENTR 质粒与 Destination 载体进行 LR 重组反应，
Destination 载体上的菌体致死基因被置换，转入大
肠杆菌 DH5α 后，涂布在含 Kanamycin 抗生素平板
图 2 Gateway重组反应过程［9］
2.3 植物表达载体电击转化农杆菌及浸润法转
基因
鉴定正确的植物表达载体，通过电击转入农杆
菌 GV3101，将获得的菌体置备为转化液，以开花盛
期的 Col-0 生态型为材料，通过花粉管将表达载体
转入繁殖器官。基因和蛋白表达水平结果（图 3-A）
显示，转基因植株中 BAK1 表达量明显高于野生型。
由于 BAK1 与其后的 FLAG 相融合，因此，以 FLAG
特异性蛋白抗体（Western blot）检测 BAK1 蛋白表
达，结果见图 3-B。
2.4 不同BAK1表达水平植株接种TCV后的症状
为了验证 BAK1 所起的作用，以不同 BAK1 表
达水平植株作为试验材料，包括 BAK1 完全不表达
的 bak1-4突变体，BAK1 转基因植株及介于二者之
间的野生型作为试验材料。接种 TCV 后第 6 天，接
种叶均显轻微褪绿，叶面略不平展 ；第 9 天，症状
表现在整株植物，植株生长减慢，叶片较对照小，
bak1-4接种叶褪绿现象最为明显 ；12 d 后，bak1-4
突变体接种叶逐渐枯萎坏死，而野生型 Col-0 和转
BAK1植株仅略显褪绿变黄，整株植物虽受病毒感染，
但叶片症状相对较轻（图 4），表明 BAK1 的缺失使
植株更容易感病。
2.5 衰老相关基因的表达
鉴于不同 BAK1 表达水平植株表现的症状差异，
通过 RT-PCR 分析了衰老相关基因 ACS8 的转录水
平，以 EF1α 作为对照（图 5）。发现接种 TCV 后第 6
天，bak1-4突变体的 ACS8 表达量增加，而 Col-0、
BAK1 过量表达植株在这一时期没有明显变化，与图 3 转 BAK1植株基因（A）及Western blot（B）检测
M. DNA 分子量标准 ；1，3. Col-O ；2. 35S ∷ AtBAK1 ；4. AtBAK1-FLAG
图 1 BAK1基因克隆（A）酶切鉴定（B）及
PCR扩增（C）
上，筛选并挑取长势较好的菌落，提取质粒，再次
以PCR及 BrsGⅠ酶切鉴定，将正确的菌落继续扩繁，
重组反应过程，见图 2 所示。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期74
图 4 不同 BAK1表达水平对 TCV感染植株的影响
bak1-4突变体接种叶严重的枯萎现象一致。 疫病菌（Phytophthora infestans）的抗性［10］。此外，
也有研究表明，在烟草中 BAK1/SERK3 可介导对食
草性昆虫的免疫反应［11］。由此可见，BAK1 参与宿
主对多种病菌及草食性昆虫的抗性。
在植物与病菌的相互作用中，病菌会诱导植物
发生程序化细胞死亡（PCD），PCD 既与植物的抗病
性有关，也与植物的感病性有关，这取决于不同的
互作系统。BAK1 在 PCD 过程中起到负调控作用，
bak1-4突变体虽不会使植物发生自发的细胞死亡，
但感染某些有毒的病菌后，能够导致系统性坏死［12］。
bak1-4突变体在接种 TCV 后，植株很容易褪绿枯萎，
与衰老相关基因的转录水平也会提高。正如 He 等［8］
报道，BAK1 和它最近的类似物 BKK1 功能完全缺失
的 bak1-4 bkk1-1双突变体会自发的发生细胞死亡和
幼苗致死现象。
4 结论
本试验以 At4g33430 序列设计特异性引物，通
过第一次 PCR 扩增获得目的基因，再以该产物为模
板进行第二次 PCR，获得具 Gateway 接头的序列，
两次扩增所用循环数比一般 PCR 低，极大地降低了
碱基错配率。通过 BP 及 LP 两步反应将 BAK1 基因
连接到植物表达载体，该操作过程简单且成功率较
高。由于设计引物时，将终止子突变，使得 BAK1
基因与 FLAG 标签相融合。因此，除进行 BAK1 基
因的转录水鉴定，还可通过 FLAG 抗体检测 BAK1
的蛋白表达水平，获得 BAK1 基因转化成功的植株。
以各 BAK1 表达水平植株为材料接种 TCV 病毒发
现，BAK1 能够增强宿主对病毒的防御作用，扩展
了 BAK1 对病菌的免疫调节范围，为提高作物的抗
病性提供了参考依据。
参 考 文 献
［1］ Morris ER, Walkery JC. Receptor-like protein kinases ：the keys to
response. Curr Opin Plant Biol, 2003, 6（4）：339-342.
［2］ Shan L, He P, Li J, et al. Bacterial effectors target the common
signaling partner BAK1 to disrupt multiple MAMP receptor-signaling
complexes and impede plant immunity. Cell Host Microbe, 2008, 4
（1）：17-27.
［3］ Chisholm ST, Coaker G, Day B, et al. Host-microbe interactions ：
shaping the evolution of the plant immune response. Cell, 2006, 124
图 5 RT-PCR分析衰老相关基因的转录水平
3 讨论
本试验通过两次 PCR 扩增目的基因，所用循环
数比一般 PCR 低，极大地降低了碱基错配率。通过
Gatway 方法将 BAK1 基因连接到植物表达载体，操
作过程简单，且成功率高。
以前的研究发现，bak1-4突变体对一些病菌包
括细菌和真菌会呈现不同于野生型的感病性［4］，接
种丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）后，bak1-4
突变体叶片褪绿，坏死斑扩大 ；感染灰葡萄孢菌
（Botrytis cinerea）后，bak1-4突变体整株植物会很快
腐烂，细胞死亡程度高，这表明 bak1-4突变体对某
些细菌和真菌更加感病。本研究发现以 Col-0 为遗传
背景的 bak1-4突变体对 TCV 也同样更为敏感，叶片
易褪绿枯萎，说明 BAK1 对病菌的抗性具有广谱性，
是一个重要的免疫调节分子。近些年的研究也证实
了 BAK1 的多种作用，BAK1 除与 BRI1 形成异源二
聚体介导 BR 信号，调节植物的生长发育，还能与
多种细胞表面受体 fls2，EFR 等结合，识别鞭毛蛋
白，EF-Tu，细菌冷激蛋白，INF1 等病菌相关分子 ［4］，
然后通过 MAPK 信号级联放大，激活植物的第一道
免疫防线。例如，烟草中的 BAK1，即 NbSerk3 能够
识别真菌 INF1，介导 MAMP 反应，激活对马铃薯晚
2012年第8期 75杨辉等 ：拟南芥 BAK1 基因转化及防御作用
（4）：803-814.
［4］ Chinchilla D, Zipfel C, Robatzek S, et al. A flagellininduced complex
of the receptor FLS2 and BAK1 initiates plant defence. Nature,
2007, 448（7152）：497-500.
［5］ Heese A, Hann DR, Gimenez-Ibanez S, et al. The receptor-like
kinase SERK3/BAK1 is a central regulator of innate immunity in
plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104（29）：12217-12222.
［6］ Kemmerling B, Schwedt A, Rodriguez P, et al. The BRI1-associated
kinase 1, BAK1, has a brassinolide-independent role in plant cell-
death control. Current Biology, 2007, 17 ：1116-1122.
［7］ Soosaar JLM, Burch-Smith TM, Dinesh-Kumar SP. Mechanisms
of plant resistance to viruses. Nature Review Biology, 2005, 3 ：
788-798.
［8］ He K, Gou X, Yuan T, et al. BAK1 and BKK1 regulate brassinoste-
roiddependent growth and brassinosteroidindependent cell-death
pathways. Curr Biol, 2007, 17（13）：1109-1115.
［9］ Gou X, He K, Yang H, et al. Genome-wide cloning and sequence
analysis of leucine-rich repeat receptor-like protein kinase genes in
Arabidopsis thaliana. BMC Genomics, 2010, 1（11）：19.
［10］ Chaparro-Garcia A, Wilkinson RC, Gimenez-Ibanez S, et al. The
receptor-like kinase SERK3/BAK1 is required for basal resistance
against the late blight pathogen phytophthora infestans in Nicotiana
benthamiana. PLoS One, 2011, 6（1）：e16608.
［11］ Yang DH, Hettenhausen C, Baldwin IT, et al. The multifaceted
function of BAK1/SERK3 ：Plant immunity to pathogens and
responses 1 to insect herbivores. Plant Signal Behav, 2011, 6（9）：
1322-1324.
［12］ Heese A, Hann DR, Gimenez-Ibanez S, et al. The receptor-like
kinase SERK3/BAK1 is a central regulator of innate immunity in
plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104（29）：12217-12222.
（责任编辑 李楠）