全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):156-162
三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）作为我国特有的
淡水珍珠蚌，孕育出世界上近 80% 的淡水珍珠［1］。
我国三角帆蚌种质资源丰富，尤以五大湖区的野
生种群分布广泛，其中鄱阳湖和洞庭湖种群生长和
育珠性能最为优良［2］。自从 20 世纪 70 年代三角
帆蚌的人工繁殖实验成功之后，珍珠蚌养殖和生产
出现大幅增长，但是育苗场人工育苗往往以利益为
先，使得养殖品种质量退化，近交严重，所产珍珠
品质低下。加之环境污染和过度捕捞野生资源遭到
破坏，部分地区甚至出现灭绝。为了解决这些问题，
收稿日期 ： 2015-05-22
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31272657），国家科技支撑计划课题（2012BAD26B04），水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心
（ZF1206）
作者简介 ：殷浩，男，硕士，研究方向 ：种质资源与遗传育种 ；E-mail ：yinhao0222@163.com
通讯作者 ：白志毅，男，博士，副教授，研究方向 ：种质资源与遗传育种 ；E-mail ：zybai@shou.edu.cn
三角帆蚌微卫星多重 PCR 体系的建立及其应用
殷浩1，2  白志毅1，2  韩学凯1，2 李家乐1，2
（1. 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306 ；2. 上海市水产养殖工程技术研究中心，上海 201306）
摘 要 ： 为了提高三角帆蚌微卫星分析效率，从已开发的微卫星标记中构建了三组四重 PCR，并将稳定的多重 PCR 体系用
于 56 个三角帆蚌紫色选育系的遗传多样性研究。结果表明该群体的平均等位基因数 18.75，平均有效等位基因数为 9.010，平均多
态信息含量为 0.857，平均观测杂合度和期望杂合度分别为 0.809 和 0.876，香农多样性指数为 2.422。运用 Cervus v3.0 软件对 3 个
三角帆蚌全同胞家系共 114 个个体进行亲子鉴定，结果显示，使用该 3 组微卫星多重 PCR 体系进行亲子鉴定准确率为 100%。该
三角帆蚌微卫星多重 PCR 应用于三角帆蚌群体遗传多样性分析、亲子鉴定和家系管理等，可提高工作效率，降低实验成本。
关键词 ： 三角帆蚌 ；微卫星 ；多重 PCR ；遗传多样性 ；亲子鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.026
The Development and Application of Multiplex PCR Panels of
Microsatellites in Hyriopsis cumingii
YIN Hao1，2 BAI Zhi-yi1，2 HAN Xue-kai1，2 LI Jia-le1，2
（1. Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources of Ministry of Agriculture Shanghai Ocean University，Shanghai 201306 ；2.
Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture，Shanghai 201306）
Abstract: In order to increase the analysis efficiency of microsatellite in Hyriopsis cumingii, 3 groups of 4 multiplex PCRs panels were
established from the developed microsatellite labels. The stable multiplex PCR panels were used to analyze the genetic diversities of 56 purple
breeding lines of H. cumingii. The results showed that the average number of alleles（A）was 18.75, the effective number of alleles（An）was 9.010,
the average of polymorphism information content（PIC）was 0.857, the average observed heterozygosity（Ho）and expected heterozygosity
（He）were 0.809 and 0.876, respectively, and Shannon information index（I）was 2.422. The Cervus v3.0 software was used to have parentage
assignment for 114 individuals in 3 full-sib families, and the results revealed that accuracy of parentage assignment by this 3 groups of multiplex
PCR panels was 100%. Therefore, this multiplex panels can be applied in genetic diversity studies of H. cumingii population, parentage
assignment and family management with increased detection efficiency and reduced test cost.
Key words: Hyriopsis cumingii ；microsatellites ；multiplex PCR ；genetic diversity ；parentage assignment
2016,32(1) 157殷浩等：三角帆蚌微卫星多重 PCR体系的建立及其应用
展开了大量关于三角帆蚌种质开发和保护的研究，
包括五大湖区野生资源调查［3，4］、不同种质生长性
状比较［2，5］、遗传参数估计［6-8］，以及遗传图谱的
绘制［9］。
微卫星标记具有高度多态性，在基因组广泛分
布，共显性遗传，以及符合孟德尔遗传定律等优点，
是育种中理想的分子标记。在三角帆蚌研究中，从
第一批微卫星标记开发以来，研究人员已经陆续开
发了 500 多对微卫星标记［9-11］。最初微卫星标记主
要运用在五大湖区三角帆蚌野生资源的调查工作，
逐步明晰了我国三角帆蚌资源的分布与亲缘关系
等［4］。但是，相比野生群体，养殖群体总存在哈迪—
温伯格平衡偏离和变异性下降的问题。三角帆蚌人
工繁殖实验成功以后，许多苗种供应商只依靠少量
野生亲本进行多代的连续繁殖，并且不控制亲本数
量，这就导致了亲本变异性的下降和近交退化。
现阶段改变三角帆蚌养殖场选育策略应该注意
群体选育后代的遗传变化情况，适时地引进优异亲
本 ；同时开展有效的家系选育项目，在操作过程中
要记录好家系信息，以防止遗传侵蚀和基因流失。
利用高效稳定、经济节约的多重 PCR 技术，监测
选育项目进展已成为必要环节。微卫星多重 PCR 技
术已广泛应用于水产动物的遗传分析和亲子鉴定。
如 斑 节 对 虾（Penaeus monodon）［12］、 三 疣 梭 子 蟹
（Portunus trituberculatus）［13］、中国明对虾（Fenner-
openaeus chinensis）［14］、 长 牡 蛎（Crassostrea gig-
as）［15］、皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）［16］。目前
还未见有关三角帆蚌微卫星多重 PCR 体系建立和应
用的报道。本研究拟通过建立一套微卫星多重 PCR
体系，结合基因扫描技术达到位点的自动化分析和
检测，给三角帆蚌群体选育和家系管理提供了一种
稳定而廉价的标记工具。
1 材料与方法
1.1 材料
实验蚌采集自 3 个养殖群体，首先是开发适用
于三角帆蚌的微卫星多重 PCR 的实验样品来自实验
室 2014 年 4 月份采集的浙江武义伟民水产养殖公司
的三角帆蚌 15 只 ；将构建好的微卫星多重 PCR 体
系运用于太湖群体紫色选育系 F1 代（50 雄性，36
雌性）遗传多样性研究 ；最后，利用本实验室经过
多年选育得到的三角帆蚌 F5 代家系进行亲子鉴定，
随机挑选其中 3 个家系（编号 P1、D1、K2），每个
家系取样 36 个个体，以及各家系对应的亲本。所有
样品剪取斧足，将其固定在无水乙醇中备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取和检测 用苯酚 / 氯仿
法抽提三角帆蚌基因组 DNA，100 μL 双蒸水溶解。
DNA 浓度和纯度通过 NanoDrop 2000C 分光光度计测
量，完整性用 1% 琼脂糖凝胶检测，随后对应稀释
成 40-50 ng/μL 的实验浓度，-20℃保存备用。
1.2.2 微卫星多重 PCR 的设计和优化 首先根据实
验室绘制遗传图谱提供的微卫星位点信息，主要包
括所在连锁群的位置、位点多态性和片段大小等特
性，选取 40 个微卫星候选位点，所选微卫星位点的
最适退火温度均为 55℃。之后，对所有 40 个位点
进行单一引物扩增，以扩增效率，条带清晰程度以
及亮度为条件，挑选出最好的 24 个微卫星标记用于
多重 PCR 的开发。用荧光基团 FAM 或 HEX 修饰其
上游引物 5 端，荧光基团的修饰引物由上海迈浦生
物科技有限公司合成。初始 20 μL 的 PCR 反应体系：
10 μL 2 x Taq PCR Mastermix（0.1 U Taq Polymerase /
μL、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl pH 8.3、
100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2），10 mmol / L 引
物对各 0.25 μL，基因组 DNA 2 μL，无菌水补充到
20 μL，其中 2×Taq PCR Mastermix 购自天根生化科
技（北京）有限公司。PCR 扩增程序 ：94℃ 预变
性 3 min ；94℃ 变性 1 min，退火 1 min，72℃ 延伸
1 min，扩增 35 个循环 ；再 72℃ 延伸 10 min，最后
10℃ 保存。PCR 扩增反应在 Eppendorf Mastercycler
pro 384 梯度 PCR 仪（Eppendorf，德国）上进行。荧
光标记的 PCR 产物由上海迈浦生物科技有限公司进
行 STR 测序分析（毛细管电泳检测 ABI 3730XL 全
自动 DNA 测序仪）。
微卫星多重 PCR 反应体系的组合。根据单个微
卫星位点的 PCR 扩增结果，挑选没有非特异性条带
的 24 对引物。将最适的退火温度、目的片段大小范
围以及引物序列等信息输入到 Multiplex Manager1.0
软件［17］，设置相应的参数，所用的荧光标记设置为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1158
2 种、单个循环体系中能够容纳的最大引物数为 4、
引物序列互补的临界值以及相同染料颜色等位基因
最小差距等。将相应的参数设置完成后，输出软件
计算结果，对于相应结果挑选目的片段长度差异大
于 50 bp 的微卫星组合进行实验。首先进行 3 个位
点的组合实验，获得清晰的目的条带后再添加一条
引物进行四重 PCR 扩增，反复实验直到能够扩增得
到条带均一且清晰组合为止。
微卫星多重 PCR 反应体系的调整优化。对于实
验结果要严格区别多重 PCR 反应产物中 4 组峰值是
否为对应引物产物，避免出现高度相似的引物间错
配 ；根据分型后峰值的相对高低调整引物的相对浓
度，每次调整单个引物浓度的增减量为 0.05 μL ；为
保证添加值极小的引物能够精确点样，可以增加总
点样管数，先将多对引物组充分混匀，再平均点样，
有效保证极低浓度引物的按量添加，最终使扩增效
率达到基本一致。
1.3 数据统计分析
所有的 STR 基因型分析，使用 GeneMapper v4.0
软件读取微卫星等位基因数据，利用 Cervus v3.0 软
件分析 12 个微卫星位点的等位基因数（A）、观测
杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和多态信息含量
（PIC），而有效等位基因数（An）、香农多样性指数（I）
通过 Popgene v1.32 计算。亲子鉴定根据两种方法计
算得来 ：（1）采用 x2 检验检测在子代中等位基因的
分离比是否符合孟德尔遗传规律，显著性水平设为
P>0.01 ；（2）利用 Cervus v3.0 的 Paternity 功能进行
模拟分析完成。
2 结果
2.1 微卫星多重PCR的建立
利用 Multiplex Manager1.0 软件将 24 对高度多
态性的微卫星位点成功的组合出 6 组的微卫星多重
表 1 三角帆蚌 3 组微卫星多重 PCR 的特性
多重 PCR 组合 位点 登录号 引物序列（5-3） 连锁群 引物浓度 /（μmol·L-1） 片段大小 /bp
Multiplex 19fg KJ829709 F-TTTTAAACATACGGTGGAAGTGGFAM 2 0.175 173-180
set 1 R-AGCTGCATAAAGACGCCTACAT
111GF KJ830091 F-GGCCATGGATTGTTTTTGAAFAM 17 0.125 228-238
R-AACAGCCAGCCTCCTACCAT
225GF KJ829864 F-CGGCCATGCAAGTGTTTFAM 8 0.150 278-280
R-GAGACGGTATATTTCCTGGTT
182GF KJ829988 F-CGTGGCAGTTCTCTTTTCTTTGACFAM 12 0.125 374-380
R-CGTGGCAGTTCTCTTTTCTTTGAC
Multiplex 783GH KJ829728 F-ACCAATCCCCAACACCACAHEX 3 0.125 155-167
set 2 R-GGCAAGAAATGAACTCCACAAC
4GF KJ830042 F-CATGATGCCCCACTGCTFAM 15 0.125 203-220
R-TATAAATCATGCGTAGAACAACCT
117GH KJ830020 F-CTGGCAAAAGCTCTAACTACAHEX 14 0.175 317-323
R-AAACGTCACATTCACATCAA
87GF KR262887 F-ACGTCGCGCAAAGGTGTTFAM -- 0.100 388-404
R-AGCTGCAAGAAATCCAAAAGTAAA
Multiplex 908GH KJ829878 F-TTCAACAGCTACCGTAAGTCAAAAHEX 8 0.175 153-161
set 3 R-GCCAAATATGCGAGAGTCACAA
45GH KJ829766 F-ACTATAAGCCGCCTACCTCAGACHEX 4 0.150 194-216
R-GGCGCCAATTTGCTTTACTAT
250GF KJ829934 F-TTGCCCCTGGTTCCTGTAGTFAM 10 0.100 302-330
R-AAACGCATCCTGGCATAGC
91GF KJ829955 F-AGACTGGCCGGAATTGGGTGTATFAM 11 0.100 362-390
R-GCATGGTTGGCAGGAGAGTAT
2016,32(1) 159殷浩等：三角帆蚌微卫星多重 PCR体系的建立及其应用
PCR 体系。将得到引物组合依次实验，除去没有扩
增出来的引物组合、能够得到 4 条的组合调整引物
浓度使得每对引物的扩增效率相似，最后成功组合
出 3 组 4 重微卫星多重 PCR 体系（表 1）。
2.2 应用微卫星多重PCR分析三角帆蚌紫色选育
系遗传多样性
微卫星多重 PCR 工具对太湖群体紫色选育系 F1
代 56 个个体进行分析，12 个位点在群体中表现出
较高的多态性，平均等位基因数到达了 18.75，每个
位点的等位基因数（A）12-25；有效等位基因数（An）
3.959-15.525，平均有效等位基因数 9.010 ；观测杂
合度（Ho）0.518-1.000，平均观测杂合度 0.809 ；期
望杂合度（He）0.754-0.944，平均期望杂合度 0.876；
多态信息含量（PIC）0.728-0.932，平均多态性信息
含 0.857 ；香农多样性指数（I）1.907-2.935，平均
香农多样性指数 2.422（表 2）。从 STR 分型部分峰
值图（图 1）可以看到，使用的微卫星多重 PCR 具
有稳定和均一的扩增效果，能够适用于三角帆蚌的
遗传多样性研究。总体而言，紫壳色三角帆蚌养殖
群体的遗传多样性较高，具有较高的改良潜力。
2.3 微卫星多重PCR在家系鉴定中的应用
在 3 个家系中 12 个微卫星位点的等位基因数
（A）从 7 到 15，平均等位基因数为 10.50。多态信
息含量（PIC）为 0.682-0.912，平均多态信息含量
为 0.8176，反映了这个多重 PCR 工具在家系鉴定中
具有较高的排除能力。其观测杂合度（Ho）范围为
0.265-0.980，平均观测杂合度为 0.724，期望杂合度
（He）范围为 0.720-0.921，平均期望杂合度为 0.839。
利用 Cervus v3.0 软件进行家系鉴定显示（表
3），所有微卫星位点均能匹配，12 个微卫星位点亲
本基因型未知的累积排除率为 99.92%，已知一个亲
本基因型时的累积排除率为 99.99% ；并且子代个体
的分离比符合孟德尔遗传定律，在子代中等位基因
分别来自父母本。分析 3 个家系的分离模式发现，
如果考虑无效等位基因的存在，所有子代的基因型
都符合孟德尔遗传定律。
3 讨论
微卫星多重 PCR 要求在一个反应体系中能够稳
定、均一地扩增出多条引物，要求所有引物的退火
温度相近、片段大小不能重叠、不能有非特异性扩增，
因而构建稳定多重 PCR 体系在技术难度较大，需要
全面的分析和反复优化［18］。微卫星多重 PCR 体系
的构建能够极大地减少基因分型成本和时间，尤其
是在分析大量实验样本时，多重 PCR 技术的优势更
为明显。结合荧光微卫星的基因扫描技术能够提高
分析的效率。多重 PCR 扫描得到的信息并不是简单
地把几对微卫星信息累加，其扫描得到的信息比单
纯单对微卫星要得到更多的遗传信息［13］。同时，与
传统的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电
泳检测能够得到更丰富等位基因以及更高的判读准
24000
22000
20000
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
30000
27000
24000
21000
18000
15000
12000
9000
6000
3000
0
30000
27000
24000
21000
18000
15000
12000
9000
6000
3000
0
80 160 240 320 400 480
120 180 240㦗ݹؑਧጠ٬㦗ݹؑਧጠ٬ Set 2
Set 3
Set 1
㦗ݹؑਧጠ٬300 360 420120⡷⇥བྷሿ
⡷⇥བྷሿ⡷⇥བྷሿ
180 240 300 360 420
图 1 部分三角帆蚌个体三组多重 PCR 基因扫描图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1160
确性。郝晨阳等［19］对 SSR 荧光标记和银染技术的
比较发现，荧光技术较银染方法在每个位点上多检
测到 3 个等位变异，检测效率显著高于银染法 7.8 倍。
利用相同的 RSO0683 位点，刘萍等［20］通过传统的
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在 20 个明对虾个体中检
测到 12 个等位基因，而孔杰等［14］采用毛细管电泳
检测的等位基因数是上述结果的 2 倍。
微卫星用于三角帆蚌群体的遗传结构的研究较
多，最初主要运用于我国五大湖区野生三角帆蚌的
亲缘关系分析［4］，在野生资源与诸暨和金华的养殖
群体比较中发现养殖群体出现了轻微的遗传多样性
下降［21］。同样，在很多水产动物的养殖群体和野
生群体的比较研究中都发现了遗传多样性下降的现
象［22，23］。本研究的结果显示，三角帆蚌群体观察
杂合度平均值和期望杂合度平均值分别是 0.809 和
0.876，平均多态性信息含量为 0.857，最小值为 0.728，
具有较高的遗传多样性（PIC ＞ 0.5）。这主要是用
于繁殖的亲本来自太湖水域的野生三角帆蚌并且大
规模养殖在外荡中，在人工选择时没有经过高强度
淘汰，这可能是导致该群体遗传多样性较高的主要
原因。利用微卫星进行遗传多样性监测有利于在早
期淘汰遗传多样性低的群体，减少养殖和管理的
成本。
在水产动物的家系选育中通常要了解混养条件
下子代的亲子关系，才能在最大程度地避免近交，
微卫星标记可以有效地区分混养群体的家系信息。
在家系鉴定中所用标记的识别能力和位点的稳定性
是家系鉴定成功的主要原因，理论上所选微卫星标
记的遗传多样性越丰富，其非亲排除率就越高，越
容易通过特异性条带确定亲缘关系。本研究的亲子
代具有高的遗传多样性 0.818，利用 Cervus 3.0 软件
分析双亲未知时的排除率为 99.92%，已知一个亲本
时的排除率为 99.99%，表明本研究建立的由 12 个
微卫星位点组成的 3 个多重 PCR 体系可以实现比
普通 PCR 方法具有更高效的亲子鉴定率。在长牡
蛎的亲子鉴定研究中利用具有较高的多态信息含量
multiplex set 4 和其余任意一组就可达到 100% 的实
际鉴定结果［15］。傅建军等［24］使用 12 个多态微卫
星位点对草鱼进行亲权分析发现使用其中 8 个位点
即能达到 100% 的亲权鉴定成功率。在 3 个家系统
计分析了亲本和子代的基因型分离情况，12 个微卫
星标记在考虑无效等位基因的前提下，x2 检验没有
发现偏离孟德尔遗传比例的情况。但在双壳贝类中
也存在偏离孟德尔遗传的现象［15，16］，其主要原因普
遍认为是存在大量无效等位基因，可能会对家系鉴
定结果有一定影响［25，26］。但也和取样家系的数量、
DNA 的突变、致死基因的存在等因素有关。本研究
也检测到两个位点存在无效等位基因，并将其看做
表 2 三角帆蚌紫壳色选育群体和 3 个家系的遗传参数
位点
紫壳色选育群体 家系子代及亲本
A An Ho He PIC I A An Ho He PIC I
19fg 19 6.285 0.821 0.849 0.827 2.256 8 5.239 0.870 0.813 0.782 1.752
111GF 19 13.459 0.679 0.934 0.921 2.746 5 2.351 0.351 0.577 0.527 1.107
225GF 12 5.196 0.821 0.815 0.785 1.939 8 3.772 0.539 0.738 0.738 1.507
182GF 21 10.431 0.618 0.912 0.897 2.602 7 4.643 0.648 0.788 0.788 1.722
783GH 17 6.877 0.911 0.862 0.841 2.241 10 4.796 0.876 0.795 0.795 1.803
4GF 13 4.799 0.839 0.799 0.799 2.072 11 5.867 0.745 0.833 0.833 1.907
117GH 23 12.444 0.893 0.928 0.914 2.775 14 9.528 1.000 0.899 0.899 2.355
87GF 19 8.748 0.839 0.894 0.876 2.454 9 4.528 0.870 0.783 0.783 1.759
908GH 17 9.012 0.821 0.897 0.879 2.410 10 6.684 0.991 0.854 0.854 2.027
45GH 24 11.383 1.000 0.920 0.906 2.729 8 5.125 0.690 0.809 0.808 1.745
250GF 16 3.959 0.518 0.754 0.728 1.907 8 3.494 0.339 0.717 0.717 1.445
91GF 25 15.525 0.946 0.944 0.932 2.935 13 8.154 0.991 0.881 0.881 2.262
均值 18.75 9.010 0.809 0.876 0.857 2.422 9.25 5.348 0.743 0.791 0.761 1.783
Excel（1） 0.999 0.999
Excel（2） 0.999 0.999
2016,32(1) 161殷浩等：三角帆蚌微卫星多重 PCR体系的建立及其应用
隐性基因处理则子代的分离比符合孟德尔遗传规律。
4 结论
本研究构建的 3 组微卫星多重 PCR 体系，具有
相比普通 PCR 方法高 3-4 倍的分析效率 ；这套微卫
星多重 PCR 体系不仅能够应用于三角帆蚌群体多样
性研究和资源管理，而且在家系重建和亲子鉴定上
也有较高识别力。
参 考 文 献
［1］Li JL, Li YS. Aquaculture in China—Freshwater pearl culture［J］.
World Aquaculture, 2009, 40（1）：60-62.
［2］钱荣华 , 李家乐 , 董志国 . 中国五大湖三角帆蚌形态差异分
析［J］. 海洋与湖沼 , 2003, 34（4）：436-443.
［3］Li JL, Wang GL, Bai ZY. Genetic diversity of freshwater pearl
mussel（Hyriosis cumigii）in populations from five largest lakes
表 3 多重 PCR 在 3 个三角帆蚌家系中的微卫星基因型分离比
家系 多重 PCR 位点 母本 父本 子代基因型 期望比 观测比 x2 P
D1 Multiplex set 1 19fg 163/180 174/174 163/174∶174/180/ 1∶1 23∶11 3.559 0.059
111GF 205/215 217/223 215/223∶205/223∶205/217∶215/217 1∶1∶1∶1 13∶9∶8∶6 2.889 0.410
225GF 278/278 278/278 278/278 1 36 -- --
182GF 373/373 373/373 373/373+ null/null 1 36 -- --
Multiplex set 2 783GH 155/167 169/173 155/169∶167/173∶167/169∶155/173 1∶1∶1∶1 9∶7∶5∶13 4.118 0.249
4GF 210/217 210/210 210/214∶210/210 1∶1 17∶17 0.000 1.000
117GH 281/289 313/322 289/322∶289/313∶281/313∶281/322 1∶1∶1∶1 9∶10∶8∶7 0.589 0.899
87GF 381/401 383/399 381/383∶383/401∶381/399∶399/401 1∶1∶1∶1 6∶11∶8∶8 1.546 0.672
Multiplex set 3 908GH 151/153 161/165 151/161∶151/165∶153/161∶153/165 1∶1∶1∶1 13∶13∶5∶5 7.111 0.068
45GH 185/200 185/200 200/200∶185/200∶185/185 1∶2∶1 8∶22∶6 2.000
250GF 301/301 301/301 301/301 1 36 -- --
91GF 354/411 387/389 354/389∶387/411∶354/387∶389/411 1∶1∶1∶1 12∶10∶6∶8 2.222 0.528
K2 Multiplex set 1 19fg 153/176 153/153 153/153∶153/176 1∶1 12∶24 3.361 0.067
111GF 223/223 223/223 223/223 1 36 -- --
225GF 274/280 278/280 274/280∶278/280∶274/278∶280/280 1∶1∶1∶1 11∶4∶12∶8 4.429 0.219
182GF 364/371 373/388 371/373∶364/373∶364/388∶371/388 1∶1∶1∶1 7∶12∶7∶9 1.914 0.590
Multiplex set 2 783GH 167/169 155/169 155/169∶169/169 1∶1 16∶16 0.000 1.000
4GF 209/222 209/231 209/222∶209/232∶209/209∶222/232 1∶1∶1∶1 10∶6∶8∶8 1.000 0.801
117GH 275/283 318/322 283/322∶307/318∶307/322∶283/318 1∶1∶1∶1 9∶13∶4∶5 6.549 0.088
87GF 383/387 395/399 383/395∶383/399∶387/399∶387/395 1∶1∶1∶1 6∶7∶13∶5 5.000 0.178
Multiplex set 3 908GH 149/155 163/163 155/163∶149/163 1∶1 20∶14 0.736 0.391
45GH 206/206 180/206 180/206∶206/206 1∶1 21∶13 1.441 0.230
250GF 336/336 336/336 336/336 1 34 -- --
91GF 366/366 384/405 366/384∶366/405 1∶1 17∶17 0.000 1.000
P1 Multiplex set 1 19fg 170/180 153/176 153/180∶153/170∶170/176∶176/180 1∶1∶1∶1 6∶5∶12∶12 4.886 0.180
111GF null/null 205/223 205/null∶223/null 1∶1 16∶19 0.114 0.735
225GF 280/284 284/286 280/284∶280/286∶284/284∶284/286 1∶1∶1∶1 10∶10∶7∶8 0.771 0.856
182GF 359/380 359/388 358/380∶358/388∶380/388∶358/358 1∶1∶1∶1 14∶6∶9∶6 4.886 0.180
Multiplex set 2 783GH 154/169 171/182 154/171∶169/171∶154/182∶169/182 1∶1∶1∶1 8∶4∶7∶10 2.586 0.459
4GF 213/222 220/220 213/220∶220/222 1∶1 13∶21 1.441 0.230
117GH 295/307 287/301 286/295∶286/307∶295/301∶301/307 1∶1∶1∶1 9∶9∶7∶9 0.353 0.950
87GF 383/383 383/393 383/383∶383/393 1∶1 13∶21 1.441 0.230
Multiplex set 3 908GH 149/167 153/163 149/153∶149/163∶153/167∶163/167 1∶1∶1∶1 5∶13∶7∶10 4.200 0.241
45GH 204/206 173/204 173/206∶173/204∶204/206∶204/204 1∶1∶1∶1 11∶9∶8∶7 1.000 0.801
250GF 268/304 317/336 268/317∶268/336∶204/336∶304/317 1∶1∶1∶1 11∶4∶9∶11 3.743 0.291
91GF 364/366 395/409 364/409∶364/395∶366/409∶366/395 1∶1∶1∶1 8∶8∶7∶12 1.686 0.640
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1162
in China revealed by inter-simple sequences repeat（ISSR）［J］.
Aquaculture International, 2009, 17 ：323-330.
［4］汪桂玲 , 袁一鸣 , 李家乐 . 中国五大湖三角帆蚌群体遗传多
样性及亲缘关系的 SSR 分析［J］. 水产学报 , 2007, 31（2）：
152-158.
［5］李家乐 , 白志毅 , 钱荣华 . 中国五大湖三角帆蚌群体与诸暨养
殖群体生长性能的比较研究［J］. 水产科技情报 , 2006, 33（6）：
243-246.
［6］ 王照旗 , 韩学凯 , 等 . 三角帆蚌紫色选育系 1 龄阶段内壳色及
生长性状的遗传参数估计［J］. 水产学报 , 2014, 38（5）：644-
650.
［7］Jin W, Bai ZY, Fu LL, et al. Genetic analysis of early growth traits
of the triangle shell mussel, Hyriopsis cumingii, as an insight for
potential genetic improvement to pearl quality and yield［J］.
Aquaculture International, 2012, 20 ：927-933.
［8］金武 , 李家乐 , 付龙龙 , 等 . 三角帆蚌早期阶段生长性状遗传参
数估计［J］. 水产学报 , 2012, 36（8）：1209-1214.
［9］Bai ZY, Han XK, Luo M et al. Constructing a microsatellite-based
linkage map and identifying QTL for pearl quality traits in triangle
pearl mussel（Hyriopsis cumingii）［J］. Aquaculture, 2015, 437, 1：
102-110.
［10］Wang GL, Wang JJ, Li JL. Preliminary study on applicability of
microsatellite primers developed from the Crassostrea gigas for
genomic analysis of Hyriopsis cumingii［J］. Journal of Fisheries
of China, 2006, 30（1）：15-20.
［11］Li JL, Wang GL, Bai ZY, et al. Ten polymorphic microsatellites
from freshwater pearl mussel, Hyriopsis cumingii［J］. Molecular
Ecology Notes, 2007, 7（6）：1114-1116.
［12］Li YT, Wongprasert K, Shekhar M, et al. Development of two
microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus
monodon and its application in genetic diversity study for two
populations［J］. Aquaculture, 2007, 266（1-4）：279-288.
［13］任宪云 , 刘萍 , 高保全 , 等 . 微卫星多重 PCR 基因扫描在三疣
梭子蟹个体识别中的应用［J］. 水生生物学报 , 2012, 36（4）：
770-778.
［14］孔杰 , 高焕 , 等 . 微卫星三重 PCR 基因扫描技术在中国明对
虾家系标识中的应用［J］. 中国水产科学 , 2007, 14（1）：59-
66.
［15］Li RH, Li Q, Cornette F, et al. Development of four EST-SSR
multiplex PCRs in the Pacific oyster（Crassostrea gigas）and their
validation in parentage assignment［J］. Aquaculture, 2010, 310
（1-2）：234-239.
［16］聂鸿涛 , 李琪 , 等 . 皱纹盘鲍微卫星多重 PCR 体系构建及其
在家系鉴定中的应用［J］. 水产学报 , 2013, 37（2）207-215.
［17］Holleley CE, Geerts PG. Multiplex Manager 1. 0 ：a cross-platform
computer program that plans and optimizes multiplex PCR［J］.
Biotechniques, 2009, 46 ：511-517.
［18］陈明洁 , 方倜 , 柯涛 , 等 . 多重 PCR—一种高效快速的分子生
物学技术［J］. 武汉理工大学学报 , 2005, 27（10）：33-36.
［19］郝晨阳 , 王兰芬 , 贾继增 , 等 . SSR 荧光标记和银染技术的比
较分析［J］. 作物学报 , 2005, 31（2）：144-149.
［20］ 刘 萍 , 孟 宪 红 , 何 玉 英 , 等 . 中 国 对 虾（Fenneropenaeus
chinensis）黄、渤海 3 个野生地理群遗传多样性的微卫星
DNA 分析［J］. 海洋与湖沼 , 2004, 35（3）：252-256.
［21］Li JL, Wang GL, Bai ZY. Genetic variability in four wild and two
farmed stock s of the Chinese freshwater pearl mussel（Hyriopsis
cumingii）estimated by microsatellite DNA markers［J］.
Aquaculture, 2008, 287 ：286-291.
［22］王庆志 , 李琪 , 孔令锋 . 长牡蛎 3 代人工选育群体的微卫星分
析［J］. 水产学报 , 2012, 36（10）：1529-1536.
［23］Lind CE, Evans BS, Knauer J, et al. Decreased genetic diversity
and a reduced effective population size in cultured silver-lipped
pearl oysters（Pinctada maxima）［J］. Aquaculture, 2009, 286
（1-2）：12-19.
［24］Fu JJ, Shen YB, et al. Multiplex microsatellite PCR sets for parent-
age assignment of grass carp（Ctenopharyngodon idella）［J］.
Aquaculture International, 2013, 21（6）：1195-1207.
［25］McGoldrick D, Hedgecock D, English LJ, et al. The transmission
of microsatellite alleles in Australian and North American stocks
of the Pacific oyster（Crassostrea gigas）：selection and null
alleles［J］. Journal of Shellfish Research, 2000, 19（2）：779-
788.
［26］Marshall TC, Slate J, Kruuk LEB, et al. Statistical confidence for
likelihood-based paternity inference in natural populations［J］.
Molecular Ecology, 1998, 7（5）：639-655.
（责任编辑 李楠）