全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-03
基金项目 ： 教育部中央高校基本科研业务费专项资金项目（SWJTU09ZT28，SWJTU09CX065），西南交通大学“希望之星”，西南交通大学
SRTP（101634）
作者简介 ：张亚光，男，研究方向 ：生物工程 ; E-mail: zhangyaguang20085155@126.com
通讯作者 ： 周嘉裕，女，副教授，博士，研究方向 ：植物资源及生物技术 ; E-mail: spinezhou@yahoo.cn
廖海，男，副教授，博士，研究方向 ：植物资源及生物技术 ; E-mail: ddliaohai@yahoo.com.cn
植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂的生物信息学分析
张亚光 黄勇 宋玉娇 陈访访 周嘉裕 廖海
（西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031）
摘 要: 运用生物信息学的方法，对已在 GenBank 数据库中注册的大豆、海红豆、凤凰木、象耳豆及洋紫荆等植物 Kunitz
蛋白酶抑制剂的氨基酸序列进行分析。结果显示，这些植物的 Kunitz 蛋白酶抑制剂中甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬氨
酸及缬氨酸含量较丰富 ；不同植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂的氨基酸序列具有较高的同源性，其中 P1 位点的氨基酸残基序度保守 ；
分子进化研究表明 Kunitz 蛋白酶抑制剂可作为植物遗传分化和分子进化研究的重要依据 ；部分序列中存在信号肽 ；分子中不存在
跨膜结构域，可能受蛋白激酶 C 的磷酸化 ；无规卷曲是多肽链中的主要结构元件 ；分子中包含典型的 STI 功能结构域。
关键词: Kunitz 蛋白酶抑制剂 植物 GenBank 生物信息学
Bioinformatics Analysis of Kunitz Protease Inhibitors in Plants
Zhang Yaguang Huang Yong Song Yujiao Chen Fangfang Zhou Jiayu Liao Hai
（College of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031）
Abstract: Bioinformatic methods were employed to analyze the amino acid sequences of Kunitz protease inhibitors from Genbank
database，such as Glycine max，Adenanthera pavonina，Delonix regia，Enterolobium contortisiliquum，Bauhinia variegata.The results were
as bellow，Leu，Gly，Glu，Val，Ser and Asp were abundant in those Kunitz protease inhibitors. Sequence alignment revealed that Kunitz
protease inhibitors were highly homologous in plants. The P1 site residue was highly conservative. Kunitz protease inhibitors could be used as
genetic differentiation and an important basis for the study of molecular evolution. There was a conserved signal peptide in segmental plants.
Kunitz protease inhibitor had no transmembrane structure and could be phosphorylated by protein kinase C，with the potential phosphorylated
site Ser148. Random coils were the major structural element of polypeptide chain. Meanwhile，Kunitz protease inhibitors contained typical
function domains of STI.
Key words: Kunitz Inhibitors Plants GenBank Bioinformatics
蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor）普遍存在于
动植物及微生物中，尤其是许多植物的贮藏器官 [1-3]，
如种子和块茎中，其主要参与生物体内蛋白酶活性
的调节，信号受体的相互作用，以及逆境情况（如
外界损伤）下的应答等生理过程 [4]，保护植物免受
真菌和昆虫的侵袭。同时，蛋白酶抑制剂还是一类
重要的抗虫物质，是当前植物抗虫基因工程的重要
目的基因来源 [5-7]。Kunitz 蛋白酶抑制剂是植物中存
在较为广泛，也是研究较为深入的一类蛋白酶抑制
剂，目前已经从大豆、台湾相思、凤凰木、决明、
银合欢、海芋、苦豆子、洋甘菊、波叶青牛胆、菠
菜及苦荞等 20 余种植物中分离到 Kunitz 蛋白酶抑制
剂 [8-13]。Kunitz 蛋白酶抑制剂由 1 条或 2 条肽链组成，
约含有 180-200 个氨基酸残基，分子量在 20 kD 左
右，能够特异地抑制胰蛋白酶和 或胰凝乳蛋白酶
的活性，抑制摩尔比为 1 1。由于鳞翅目等昆虫的
幼虫主要依赖胰蛋白酶来消化食物中的蛋白质，因
此 Kunitz 蛋白酶抑制剂能够抑制鳞翅目等昆虫幼虫
肠道的绝大部分胰蛋白酶的活性，导致幼虫的取食
量明显下降，营养不良，体重变轻，延缓幼虫的生
2011年第12期 103
长发育 [14,15]。通过转基因技术将大豆 Kunitz 蛋白酶
抑制剂基因导入烟草，使该基因过量表达，获得的
转基因烟草具有显著的抗棉铃虫能力，抑制率高达
95%[16]，为利用转基因技术培育抗虫转基因植物新
品种奠定了基础。
由于 Kunitz 在生物防治领域的应用价值，国内
外学者发表大量相关论文，主要集中在 Kunitz 蛋白
酶抑制剂的分离、基因的克隆与功能验证、基因表
达与抗虫应用等实验性研究。本研究利用生物信息
学方法，以大豆（Glycine max）为重点，对海红豆
（Adenanthera pavonina）、凤凰木（Delonix regia）、象
耳豆（Enterolobium contortisiliquum）与洋紫荆（Bauhi
nia variegata）等植物中 Kunitz 蛋白酶抑制剂的氨基
酸序列理论性质、序列比对分析、系统进化、蛋白
定位、跨膜区域及蛋白结构等进行系统的预测和分
析，为今后深入开展 Kunitz 蛋白酶抑制剂的相关研
究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源
数据资料来源于 NCBI 核酸及蛋白质数据库中
已登录的植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂的核苷酸序列
及其对应的氨基酸序列，包括大豆（Glycine max，
AAB23464）、 花 生（Arachis hypogaea，ACF74332）、
四 棱 豆（Psophocarpus tetragonolobus，BAA03085）、
豌豆（Pisum sativum，O82711）、海红豆（Adenanthera
pavonina，1208243A）、 牧 豆 树（Prosopis juliflora，
AAB21123）、台湾相思树（Acacia confusa，P24924）、
象耳豆（Enterolobium contortisiliquum，P86451）、银
合欢（Leucaena Leucocephala，P83036）、凤凰木（Delonix
regia，P83667）、巴西柴油树（Copaifera langsdorffii，
1R8O）、洋紫荆（Bauhinia variegata，P83595）和白
花羊蹄甲（Bauhinia bauhinioides，AAR01967）。
1.2 方法
运用 NCBI 的 BLAST 程序进行本研究序列的筛
选工作（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；氨基
酸序列物理化学性质使用 ProtParam（physico-chemical
parameters of a protein sequence，http://expasy.org/
tools/protparam.html） 软 件 检 索 其 参 数 ；氨 基 酸 序
列同源性比对使用 DNAman 软件分析 ; 分子系统发
生 树 使 用 DNAMAN 中 的 Fhylogenetic Tree 方 法 构
建 ; 亲疏水性的分析用在线工具 ProtScale（http://
www.expasy.ch/tools/protscale.html） 完 成 ；信 号 肽
分 析 使 用 SignalP 3.0 在 线 工 具（http://www.cbs.dtu.
dk/services/SignalP/）完成 ；氨基酸翻译后修饰采用
NetPhosK 2.0 Server 在线工具（http://www.cbs.dtu.dk/
services/NetPhos/）进行预测 ；跨膜结构域的分析用
在 线 工 具 TMHMM 2.0 Server 完 成（http://www.cbs.
dtu.dk/services/TMHMM/）；蛋白质二级结构预测使用
在线工具 SOPMA 完成 ；功能结构域是在 NCBI 上利
用 CDD 在线工具分析。
2 结果与分析
2.1 植物Kunitz蛋白酶抑制剂氨基酸序列理化性质
分析
以大豆、海红豆、象耳豆、凤凰木及洋紫荆
为对象进行氨基酸理化性质分析，使用在线分析软
件 ProtParam（physico-chemical parameters of a protein
sequence，http://expasy.org/tools/protparam.html）分析。
由 表 1 可 知， 除 了 象 耳 豆 的 pI 值 5.83 稍 大，
其余的大豆、海红豆、凤凰木与洋紫荆的 pI 值均
在 5.00 附近 ； 甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、亮氨
植物 氨基酸数目 分子量（kD） pI
带电氨基酸比例（%）
碱性氨基酸 酸性氨基酸 亲水氨基酸 疏水氨基酸 带电氨基酸
大豆 216 24.00 4.99 12.00 14.40 57.80 42.20 26.40
凤凰木 185 20.09 4.89 11.80 15.10 63.80 36.10 26.90
海红豆 176 19.90 5.01 13.60 16.40 63.60 36.30 30.00
象耳豆 174 19.46 5.83 17.20 17.20 61.90 37.30 34.40
洋紫荆 174 19.30 5.13 13.10 14.90 61.80 37.70 28.00
表 1 不同植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸组成及理化性质分析
张亚光等 ：植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂的生物信息学分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期104
酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、天冬氨酸（Asp）及缬氨
酸（Val）是这几种植物 Kunitz 氨基酸序列中含量最
为丰富的氨基酸（表 2），其平均含量分别为 9.02%、
8.60%、8.32%、8.18%、7% 和 6.80% ；在象耳豆的
氨基酸组成中，酸性和碱性氨基酸的比例最高，分
别为 17.20%、17.20% ；在凤凰木总氨基酸中，亲水
氨基酸比例最高，分别为 63.80% ；在大豆中，疏水
氨基酸的比例最高，为 42.20%。
2.2 植物Kunitz蛋白酶抑制剂氨基酸序列的比对
分析
选取大豆等 11 种植物的 Kunitz 蛋白酶抑制剂
氨基酸序列，用 DNAman 软件进行多重比对分析。
分析结果（图 1）显示，不同植物的 Kunitz 蛋白酶
抑制剂氨基酸序列具有较高的同源性，一致性达到
42.63%。大豆、海红豆与台湾相思树等 8 种植物的
Kunitz 蛋白酶抑制剂能够特异性地抑制胰蛋白酶的
活性，它们的 P1 位点氨基酸残基高度保守，通常是
碱性的 Arg 或 Lys（如大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂的
Arg87，银合欢 Kunitz 蛋白酶抑制剂 α- 链的 Arg64）。
较为特殊的是，凤凰木 Kunitz 蛋白酶抑制剂也能
够特异性地抑制胰蛋白酶的活性，但其 P1 位氨基
酸残基是 Glu63，Silvana 等 [3] 认为这是由于凤凰木
Kunitz 蛋白酶抑制剂中 Glu63 与 Ser69 残基能够形成
一个口袋并与胰蛋白酶的 Arg 和（或）Lys 结合，从
植物
含量最丰富的氨基酸（%）
Leu Gly Glu Val Ser Asp
大豆 8.80 7.90 6.50 6.50 7.40 7.90
凤凰木 5.40 11.40 9.70 8.10 14.10 5.40
海红豆 9.10 9.10 10.20 6.20 5.70 6.20
象耳豆 10.30 9.20 8.60 4.60 3.40 8.60
洋紫荆 8.00 7.50 8.00 8.60 10.30 6.90
表２ 不同植物中含量最丰富的氨基酸
图 1 不同植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂序列比对分析
大豆 (Glycine max)
海红豆 (Adenanthera pavonina)
台湾相思树 (Acacia confusa)
象耳豆 (Enterolobium contortisiliquum)
银合欢 (Leucaena leucocephala)
洋紫荆 (Bauhinia variegata)
牧豆树 (Prosopis juliflora)
四棱豆 (Psophocerpus tetragonolobus)
豌豆 (Pissum sativum)
凤凰木 (Delonix regia)
巴西柴油树 (Copaifera lengsdorffii)
一致性
而起到抑制胰蛋白酶活性的作用。而四棱豆、豌
豆等植物的 Kunitz 蛋白酶抑制剂能够特异性地抑
制胰凝乳蛋白酶的活性，它们 P1 位点的氨基酸残
基通常为非极性的异亮氨酸或亮氨酸（如四棱豆
Kunitz 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 P1 位 点 为 Leu89）。 植 物
Kunitz 蛋白酶抑制剂通常含有 4 个半胱氨酸残基
（如大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂的 Cys63、Cys110、
Cys160 和 Cys169），能够形成 2 个二硫键，这对
于维持蛋白酶抑制剂的空间结构起着重要的作用。
只有巴西柴油树的 Kunitz 蛋白酶抑制剂较为特殊，
只 含 有 2 个 半 胱 氨 酸（Cys40 和 Cys84）， 形 成 1
个二硫键。
2.3 植物Kunitz蛋白酶抑制剂氨基酸分子进化树
分析
利用 DNAman 软件中的 Phylogenetic Tree 方法
构建大豆等 13 种植物的系统进化树（图 2）。由图
2 可以看到包括银合欢（Leucaena leucocephala）等
5 种豆科含羞草亚科植物位于同一分支上，它们含
有的 Kunitz 蛋白酶抑制剂均由两条肽链构成 ；而
包括大豆（Glycine max）等豆科蝶形花亚科、凤凰
木（Delonix regia）等豆科云实亚科植物及巴西柴油
树（Copaifera langsdorffii）等非豆科植物位于另一分
支上，它们含有的 Kunitz 蛋白酶抑制剂均由 1 条肽
链构成 ；只有豆科云实亚科植物洋紫荆（Bauhinia
2011年第12期 105
variegata）位于一个单独的分支，它与豆科含羞草
亚科植物亲缘关系较近。表明 Kunitz 蛋白酶抑制剂
有较强的保守性，可作为植物遗传分化和分子进化
研究中的重要依据。
networks（NN）方法进行 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基
酸序列信号肽的分析，结果如图 4 所示。C 值最大
切割点在第 25 个氨基酸位置，分值为 0.604，综合
剪切点分值（Y 值）最高也在第 25 个氨基酸位置，
为 0.651，信号肽最大分值（Max S）在第 13 个氨基
酸位置，分值为 0.992。从第 1-24 个氨基酸，平均
S 值为 0.831，平均 D 值为 0.741。因此，推断大豆
Kunitz 蛋白酶抑制剂具有信号肽，信号肽的长度为
24 个氨基酸残基，在成熟过程中需要切除信号肽才
能转化成为其活性形式。同属于豆科蝶形花亚科的
四棱豆、豌豆和花生所含的 Kunitz 蛋白酶抑制剂也
含有一段相近长度的信号肽。
图 2 不同植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸
序列分子进化分析
图 3 大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂序列亲疏水性预测
图 4 大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂信号肽分析结果
张亚光等 ：植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂的生物信息学分析
2.4 植物Kunitz蛋白酶抑制剂亲疏水性分析
以大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸序列为对
象， 采 用 在 线 工 具 ProtScale（http://www.expasy.ch/
tools/protscale.html）分析，结果如图 3 所示。多肽链
中 Phe9 有最高分值 3.067，疏水性最强 ；Phe152 有
最低分值 -2.300，亲水性最强。就整条多肽链而言，
表现为亲水性，只有两个疏水区域，第一个疏水区
域位于 Ile5-Val27 之间，平均值为 1.367，第二个疏
水区位于 Lys100-Try117，平均值为 1.386。通过对
海红豆、凤凰木、象耳豆与洋紫荆等植物分析可得
到相近的结果。
2.5 植物Kunitz蛋白酶抑制剂信号肽分析
以 大 豆 为 研 究 对 象 通 过 SignalP 3.0 在 线 工
具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）neural
2.6 植物Kunitz蛋白酶抑制剂跨膜结构域的预测与
分析
以大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸序列为研究
对象，用在线工具 TMHMM 2.0 Server 进行预测分析。
分析结果（图 5）显示，大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂
Ile5-Val27 有最高分值为 0.8 0361，整条肽链的跨膜
结构域的可能性小于 1，所以预测大豆 Kunitz 蛋白
酶抑制剂不存在跨膜结构域。对海红豆、凤凰木、
象耳豆和洋紫荆等植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂跨膜结
构域分析的结果与大豆结果相近。
Bauhinia variegata
Leucaena leucocephala
Glycine max
Psophocarpus tetragonolobusAra chis hypogaea
Pisum sativum
Delonix regia
Copaifera langsdorffii
Acacia confusa
Enterolobium contortisiliquumProsopis juliflora
¶M6
ÏM6
0.05
Adenanthera pavonina
V] F
V] F
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期106
2.7 植物Kunitz蛋白酶抑制剂翻译后修饰的预测和
分析
以大豆为研究对象，采用 NetPhosK 2.0 Server
在 线 工 具 分 别 预 测 了 丝 氨 酸（Serine）、 苏 氨 酸
（Threonine）和酪氨酸（Tyrosine）3 种不同的磷酸化
位点。结果（图 6）显示，有 6 个丝氨酸磷酸化位点，
为 S70、S84、S98、S118、S148 和 S213，苏氨酸磷
酸化位点 3 个为分别 T16、T58 和 T182，以及 1 个
酪氨酸位点 Y18，在这 10 个磷酸化位点中，S148 预
测分值最高，为 0.994。由于磷酸化作用有利于蛋白
质可溶性构象的形成，据此推断，大豆 Kunitz 蛋白
酶抑制剂是水溶性的，这也与在亲疏水性分析中预
测的结果相一致。通过对海红豆、凤凰木、象耳豆
及洋紫荆等植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸序列的
分析，可得到同样的结果。
2.8 植物Kunitz蛋白酶抑制剂二级结构预测
以大豆为研究对象，用 SOPMA 在线工具预测
Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸序列的二级结构，结果
（图 7）显示，在多肽链中 α 螺旋占 10.65%，β 转角
占 8.80%，49.54% 的无规卷曲和 31.02% 的延伸链，
可见无规卷曲是大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂多肽链中
大量的结构元件，延伸链则散布于整个肽链中。在
海红豆、凤凰木、象耳豆及洋紫荆的 Kunitz 蛋白酶
抑制剂二级结构中也有类似的情况。
图 6 大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂翻译后修饰预测
图 7 大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸序列二级结构预测
线段由长及短分别表示 α 螺旋、延伸链、β 转角、无规则卷曲
2.9 植物Kunitz蛋白酶抑制剂功能结构域分析
在 NCBI 上利用 CDD 在线工具分析大豆 Kunitz
蛋白酶抑制剂氨基酸序列的功能结构域，结果（图 8）
显示，在植物中普遍存在着一类含有 STI 保守区域
的蛋白，N 端 27-199 肽段与白细胞介素（Interleukin）
和 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子（Fibroblast growth factors）
功能区段匹配，表明大豆 Kunitz 蛋白酶抑制剂属于
STI 超家族。
3 结论
本研究应用生物信息学方法对来源不同植物
Kunitz 蛋白酶抑制剂的氨基酸序列进行了系统分
析，为今后实现抗虫基因工程提供值得借鉴的理论
2011年第12期 107
依据。结论如下 ：氨基酸序列理化性质分析显示植
物 Kunitz 蛋白酶抑制剂蛋白富含甘氨酸 ；将来源不
同的 13 种植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂氨基酸序列进行
多重比对发现，发现保守性较强 ；具有不同抑制特
性的 Kunitz 蛋白酶抑制剂含有不同的 P1 位氨基酸
残基，若 P1 位残基是碱性的 Arg 或 Lys，其通常抑
制胰蛋白酶的活性，若 P1 残基是非极性的异亮氨酸
或亮氨酸，其通常抑制胰凝乳蛋白酶的活性 ；植物
Kunitz 蛋白酶抑制剂通常含有 4 个较为保守的半胱
氨酸残基，可形成两个二硫键 ；分子进化分析结果
显示同为豆科含羞草亚科的几种植物在分子进化树
上也归为一支，它们含有的 Kunitz 蛋白酶抑制剂均
由 2 条肽链构成 ；而蝶形花亚科和云实亚科的植物
位于另一分支上，它们含有的 Kunitz 蛋白酶抑制剂
均由 1 条肽链构成，预测结果与分类学在进化树的
高度一致性表明 Kunitz 蛋白酶抑制剂可作为植物遗
传分化和分子进化研究中的重要依据 ；运用 Signal
P 分析多种植物的 Kunitz 蛋白酶抑制剂的氨基酸序
列发现存在信号肽，推测 Kunitz 蛋白酶抑制剂的翻
译定位于内质网中 ；运用工具 TMHMM 预测大豆等
植物的 Kunitz 蛋白酶抑制剂分子不存在跨膜区域 ；
以大豆为研究重点分析 Kunitz 蛋白酶抑制剂的疏水
性，整个多肽链表现为亲水性，不含有跨膜结构域；
NetPhosK1.0 分析推测 Kunitz 蛋白酶抑制剂可能受蛋
白激酶 C 磷酸化，位点为 Ser148，预测结果为今后
基因表达调控、蛋白修饰提供了参考位点 ；二级结
构分析推测无规则卷曲是多肽链中的主要结构元件。
本研究结果可为深入开展 Kunitz 蛋白酶抑制剂抑制
特性的分子机理研究提供重要理论依据。
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（责任编辑 李楠）
张亚光等 ：植物 Kunitz 蛋白酶抑制剂的生物信息学分析