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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-09-02
基金项目 : 浙江省科技计划项目（2008C22081）, 浙江省自然科学基金项目（Y3090166）, 浙江省科技攻关重点项目（2005C22032） , 浙江省
生物医学重中之重学科开放基金项目（SWYX0908）
作者简介 : 董沁芳 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物病毒分子诊断 ;E-mail:dqfzjz@126.com
并列第一作者 : 郭瑶 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物病毒分子诊断 ;E-mail:gydh27@163.com
通讯作者 : 姜永厚 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 病毒分子诊断与动物病毒分子生物学 ;E-mail:yonghoujiang@zstu.edu.cn
猪细小病毒 LDR-PCR 检测方法的建立和应用
董沁芳1 郭瑶1 汪平1 程菊会1 徐辉2 丁先锋1 郭江峰1 姜永厚1
（1浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018 ；2浙江省动物疫病预防控制中心，杭州 310020）
摘 要 : 为准确特异灵敏地检测猪细小病毒（PPV），建立一种新的 LDR-PCR 方法。首先在病毒的保守区内设计一对 LDR
探针，LDR 探针两端各连有一段引物对应序列，以连接产物为模板进行 PCR，琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板，通
过对 LDR 反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化，确定了 LDR 最佳的反应体系，并建立了 LDR-PCR 方法。
结果表明，可以特异地检测 PPV，与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环
病毒（PCV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）无交叉反应 ；最低检测限为 102 个拷贝。利用建立的方
法对 41 例临床样本进行检测，14 份样品 PPV 阳性，与普通 PCR 检测结果符合率为 97.6%。
关键词 : LDR-PCR 猪细小病毒 条件优化 检测
A Diagnostic Method Based on Ligase Detection Reaction
LDR-PCR for Detection of Porcine Parvovirus
Dong Qinfang1 Guo Yao1 Wang Ping1 Cheng Juhui1 Xu Hui2 Ding Xianfeng1
Guo Jiangfeng1 Jiang Yonghou1
（1College of Life Sciences，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018 ；2Centre of Animal Disease Control of
Zhejiang Province，Hangzhou 310020）
Abstract: A new method based on LDR-PCR was developed to detect porcine parvovirus （PPV） that causes swine severe reproductive
failure in this study. According to alignment of the virus sequences, a pair of LDR probes for PPV was designed, which were flanked by universal
primer sequences on both sides of the probes. After LDR, the ligated product was PCR amplified and detected by agarose gel electrophoresis.
Following optimization of reaction system, the LDR-PCR for detection of PPV was successfully established. The method was highly specific,
without cross reacting with porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）, classical swine fever virus （CSFV）, pseudorabies
virus （PRV）, porcine circovirus type 1 （PCV1） and type 2 （PCV2）, transmissible gastroenteritis virus （TGEV）, porcine epidemic diarrhea
virus （PEDV）. As few as 102 copies target molecules can be detected by the assay. 41 clinical samples, 14 samples were detected positive by
the LDR-PCR. The results of the LDR-PCR and conventional PCR for PPV showed a concordant rate of 97.6%.
Key words: LDR-PCR PPV System optimization Detection
猪细小病毒（Porcine parvovirus, PPV）能引起
母猪的繁殖障碍，该病在 1967 年首先发现于英国，
目前世界各个国家均有发现［1］。PPV 感染导致的临
床症状为胚胎和胎儿死亡、母猪流产、死胎和木乃
伊胎等［2］。PPV 属于细小病毒科、细小病毒属，其
基因组是一条长约 5 000 bp 的单股负链 DNA，能自
我复制，包含两个主要的阅读框［3］。由于猪繁殖与
呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus，PRRSV） 和 猪 瘟 病 毒（Classical
swine fever virus，CSFV）等也能引起母猪繁殖障碍
疾病，这些传染病与 PPV 感染难以区别诊断，给
PPV 的防治带来了一定的困难［4］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期166
早期检测 PPV 的常规方法包括病毒分离鉴定、
免疫荧光技术、酶联免疫吸附方法等，但这些方法
费时、费力，试验条件要求较高，灵敏度和特异性
低［5,6］。近来，PCR、LAMP 等分子生物学方法被广
泛用于 PPV 检测，但这些方法亦存在假阳性问题［7,8］。
连接酶检测反应（LDR）的原理类似聚合酶链反应
（PCR），而特异性高于 PCR。当探针与目的 DNA 互
补配对后，连接酶能通过催化磷酸二酯键将相邻的
两条探针连接，当探针的接头处存在碱基错配时，
连接反应便不能进行［9］。LDR 技术具有特异性高、
通用性好、适用范围广等特点，通过整合入其他生
物技术，在生物分子检测中取得了更大的进展［10］。
本研究将 LDR 与 PCR 技术相结合建立了一种
新的特异灵敏的 PPV 检测方法。首先，从 NCBI 中
下载 PPV 全序列，通过软件比对 PPV 的保守区域进
行引物和探针的设计。探针由 5 段序列组成，从左
到右依次是上游通用引物对应序列、上游病毒特异
序列、下游病毒特异序列、Zip-code 序列、下游通
用引物对应序列。以病毒基因组 DNA 或构建的质粒
为模板进行 LDR、PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。
此方法的建立旨在为猪细小病毒的流行病学调查和
疫情控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株和临床样本 PPV 疫苗由北京中海保
健科技公司提供；阴性对照包括猪圆环病毒（Porcine
circovirus, PCV）1 型 PCV1 和 2 型 PCV2 参考株（浙
江大学周继勇教授馈赠），猪传染性胃肠炎病毒
（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）和猪流行性
腹 泻 病 毒（Porcine epidemic diarrhoea virus，PEDV）
二 联 冻 干 活 疫 苗（ 哈 尔 滨 维 科 生 物 技 术 公 司 ），
PRRSV、CSFV 和 Pseudorabies virus（PRV）疫苗由北
京中海保健科技公司提供 ；大肠杆菌（E. coli） DH5α
由本实验室保存 ；41 例本实验室保存的临床样本包
括淋巴结、脾、肺和扁桃体，采集于繁殖障碍或呼
吸障碍症状的仔猪和流产胎儿。
1.1.2 主要仪器和试剂 凝胶电泳图像分析系统
（SynGen，英国）；PCR 仪（Bio-Rad，美国）；超微量
核酸分光光度计（Thermo，美国），Taq DNA 聚合
酶、pUCm-T 载体购自上海生工生物工程有限公司；
Taq DNA 连接酶购自 NEB 公司 ；其他试剂为国产
分析纯。
1.1.3 探针及引物设计 根据 GenBank 中已发表的
序列，应用 Primer Premier 5.0 软件设计引物和 LDR
探针，设计好的引物和探针通过 NCBI 中的 BLAST
进行特异性鉴定（表 1，表 2）。根据文献报道选择
一组通用引物和 1 个 Zip-code 序列（表 1，表 2）［1］。
探针引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 模板质粒的构建 根据产品说明，用病毒
DNA 抽提试剂盒从细胞株、疫苗中提取 PPV 基因
组 DNA，PCR 扩增产物用纯化试剂盒纯化，然后克
隆至 pUCm-T 载体，抽提重组质粒，PCR 鉴定。用
Nanodrop-1000 测定重组质粒浓度。
引物 序列（5-3） Tm（℃） 产物大小（bp）
PPV F ：AAAGTTAGAATAGGATGCGAGGAA 59.1 711
R ：GCGGCGTCTGATGGATTA 67.3
通用引物 F ：AAGCATAAAGTGTAAAGCC 49.9 96
R ：TTCTGAGGTCATTACTGG 46.5
表 1 PPV 引物序列和通用引物序列
探针 序列（5-3）
上游探针 GTTCTGAGGTCATTACTGGTCGTGCCTTGTCATTCGGGA
GGTGAAAGTTGGTGTTGTTG
下游探针 GCTCGCTCCACGGCTCGGCTTTACACTTTATGCTTC
表 2 本试验所用的 LDR 探针
黑色字体标记的为辨别序列，斜体为通用序列，下划线标记为 Zip-code
1.2.2 LDR 反应 以构建的重组质粒为模板，进
行 LDR 连接反应，并对 LDR 反应体系和反应参数
进行优化，优化后的反应体系为 ：1 μmol/L 上下游
探针各 1.0 μL，2 U Taq DNA 连接酶（40 U/μL），约
20 ng/μL 重 组 质 粒 2.0 μL，10×LDR Buffer 1.0 μL，
2012年第2期 167董沁芳等 ：猪细小病毒 LDR-PCR 检测方法的建立和应用
ddH2O 补齐至 10 μL。反应程序 ：94℃预变性 3 min ；
94℃变性 30 s，59℃ 4 min，10 个循环。
1.2.3 PCR 反应体系 以连接产物为模板，总体积
25 μL 的 PCR 反 应 体 系 包 括 10×Buffer 2.5 μL，25
mmol/L MgCl2 2.0 μL，3 通用引物（10 μmol/L）和 5′
通用引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTP
2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，LDR 连
接产物 1.0 μL。反应程序 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，
50℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，35 个循环。反应
结束后，3% 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2 结果
通过改变 LDR 反应的参数和条件，对 LDR 进
行优化。具体的优化过程包括退火温度、酶量、探
针浓度、循环数，同时也确定了 LDR-PCR 方法的灵
敏度。LDR 后进行 PCR，琼脂糖凝胶电泳检测。
2.1 退火温度的优化
在 LDR 优化过程中，退火温度是主要参数之一，
不同退火温度对连接效率的影响很大，因此在检测
之前须确定最佳的退火温度。选择 55，57，59，61，
63 和 65℃ 6 个温度值进行 LDR，PCR，电泳。结果
（图 1）表明，随着退火温度的升高，条带亮度减弱，
在条带亮度一致情况下，较高的退火温度可减少非
特异性结果，因此选择 59℃进行其他条件优化。
2.2 酶量的优化
选 择 4，2，1，0.5，0.25，0.125，0 U 7 个 连
接酶量进行 LDR 酶量优化，0 U 为阴性对照，LDR-
PCR 后电泳。随着酶量的减少，条带亮度变弱，酶
量为 0.125 U 时电泳无条带，2 U 和 4 U 酶量的电
泳条带亮度相近，因此最佳酶浓度为 2 U（图 2）。
M.20 bp DNAMarker ；1-6. 退火温度依次为 55、57、59、
61、63 和 65℃ ；7. 阴性对照
图 1 LDR 退火温度优化
M.20 bp DNA Marker；1-6. 酶量依次为 4.0、2.0、1.0、
0.5、0.25 和 0.125 U ；7. 阴性对照
图 2 LDR 酶量优化
2.3 探针浓度的优化
选择探针浓度依次为 4、2、1、0.5、0.25、0.125、
0 μmol/L 进行，阴性对照探针浓度为 0 μmol/L，电泳
结果如图 3 所示，随着探针浓度的降低，条带亮度
减弱，探针浓度为 1 和 2 μmol/L 的条带亮度比较接近，
因此选择探针浓度为 1 μmol/L 进行以下优化。
M. 20 bp DNA Marker；1-6. 探针浓度依次为 4.0、2.0、
1.0、0.5、0.25 和 0.125 μmol/L ；7. 阴性对照
图 3 LDR 探针浓度优化
M. 20 bp DNA Marker ；1-9. 循环数依次为 45、40、35、30、25、
20、15、10、5 ；10. 阴性对照
图 4 LDR 循环数优化
2.4 循环数的优化
选择循环数 45、40、35、30、25、20、15、10、
5 共 9 个梯度进行优化，阴性对照循环数为 0。当循
环数为 10 个时电泳条带较亮，循环数增加条带反
而变淡，因此最佳循环数为 10 个（图 4）。
2.5 LDR-PCR检测灵敏度
选择模板浓度依次为 105、104、103、102、101、
100 个拷贝进行 LDR-PCR，阴性对照模板浓度为 0
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期168
2.6 LDR-PCR检测特异性
利用建立的 LDR-PCR 方法分别对 PPV、PCV1、
PCV2、TGEV、PEDV、PRRSV 和 CSFV 进 行 检 测，
结果表明仅 PPV 在 100 bp 左右产生目的条带，而其
他阴性对照均无目的条带产生，说明该方法可特异
地检测 PPV。
2.7 临床样本检测
使用优化后的 LDR 体系结合 PCR 方法对 41 例
临床样本进行检测（图 6），同时进行普通 PCR 方法
检测。PCR 方法检测出 PPV 阳性样本 13 例，LDR-
PCR 方法检测出 PPV 阳性样本 14 例，因此 LDR-
PCR 方法的灵敏度要高于普通 PCR 方法。与普通
PCR 检测结果符合率为 97.6%。
一方面可产生适宜长度的连接产物便于电泳检测，
另一方面此序列的引入可将 LDR-PCR 方法与基因芯
片杂交结合，利用 LDR 的特异性、多重性、PCR 的
灵敏性和基因芯片的高通量提高靶标检测效率。
LDR 方法是在连接酶链反应基础上发展起来，
其反应原理类似聚合酶链式扩增反应，但其特异性
远高于 PCR 方法［11］。当 LDR 探针与目的 DNA 互
补配对后，只有在探针接头处碱基完全匹配时，耐
高温的连接酶才能通过催化磷酸二酯键将相邻的两
条探针连接起来［12］。该技术在国内外得到了广泛
的应用，早期用于基因分型系统，如张世扬［13］对
AGTM235T 和 ACE I/D 基因多态性的检测并应用到心
血管疾病相关基因分型中。李灵敏［14］通过 LDR 方
法检测 L-1A、CGRP 的 SNP 位点，探讨了中国汉族
人重度慢性牙周炎病人与 L-1A、CGRP 基因多态性
的相关性。王刚［15］用该技术对 115 例正常中国人
群体样本的细胞色素 P450 的 6 个位点进行基因分型
检测。该方法近来也常用于病原微生物的检测，如
Rondini 等［16］利用 RT-PCR/LDR 方法对西尼罗病毒
进行检测，通过一步法和两步法测得检测限分别为
0.005 和 0.017 PFU。
目前对 PPV 的检测方法很多，刘业冰等［17］运用
LAMP 方法对猪细小病毒进行检测，PPV 病毒 DNA 得
到了高效率的特异扩增，检测限达到 0.23TCID50。李
明凤等［18］将猪细小病毒 VP2 保守区基因 194 bp 片段
做为诊断区，建立了猪细小病毒的荧光定量 PCR 检测
方法，该方法检测灵敏度可达 1.0×102 拷贝。本研
究将 LDR 和 PCR 方法结合起来，增强了方法的特
异性和灵敏度，灵敏度可达到 102 个拷贝，而高于
普通 PCR 的临床样本阳性检出率，也再次予以验证。
与传统的 PCR 检测手段相比，LDR 反应有多
项优势 ：特异性好，由于采用探针和引物双重控制，
假阳性大大降低，可较准确的检测靶核酸分子及其
多态性 ；通用性强，可适用于各种靶核酸分子的检
测 ；高通量，能够同时对上百个核酸多态性位点进
行检测，大大提高了检测效率［19］。由于 LDR 方法
是线性扩增，其扩增产物一般无法用琼脂糖电泳检
测，毛细管电泳（CE）虽能检测连接产物，但灵敏
度不高，且进样量少，制备能力差，也不是最佳的
检测方法［12］。多重 LDR 的应用通常需要在 LDR 之
M. 20 bp DNA Marker ；1-6. 模板浓度依次 105、104、103、102、
101、100 拷贝 ；7. 阴性对照
M. 20 bp DNA Marker ；1-14. 临床样本 LDR-PCR 检测
图 5 LDR-PCR 检测灵敏度
图 6 部分临床样本 LDR-PCR 电泳检测结果
个拷贝。随着模板浓度的降低电泳条带亮度减弱，
10 个拷贝时电泳无条带，阴性对照无条带，因此
LDR-PCR 方法的检测灵敏度为 102 个拷贝（图 5）。
3 讨论
通过对 LDR 条件的优化，获得了 LDR 的最佳
反应条件和体系。从电泳图可见除 100 bp 附近的目
的条带外，60 bp 附近也有条带，应为未消耗的探针
或探针二聚体。LDR 探针中含有一段 Zip-code 序列，
2012年第2期 169董沁芳等 ：猪细小病毒 LDR-PCR 检测方法的建立和应用
前 PCR 扩增来提高检测灵敏度，这种措施针对在核
酸序列上存在较高同源性的同属或同科的靶标生物。
本研究通过在 LDR 探针的两端分别连接一通用序
列，从而可将连接产物用一对通用引物进一步扩增，
进而通过琼脂糖凝胶电泳检测 LDR-PCR 产物，既增
加了 LDR 的灵敏度，又增强了方法的通用性，而且
还可进一步与基因芯片结合进行灵敏、特异、高通
量地检测多种靶标核酸分子，目前本实验室正在从
事这方面的研究，且已取得了较好的结果［20］。
4 结论
本研究通过反应体系和条件优化建立了一种新
的 LDR-PCR 方法，可准确、特异、灵敏地检测猪细
小病毒。此方法的建立为 PPV 基础研究和临床应用
提供了良好的技术平台，为进一步开发高通量的多
病原检测技术提供了技术基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）