全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2011, 27(3):556～ 560
韩卫丽 , 崔保安 ,张红英 , 等.留兰香提取物体外抗猪细小病毒的作用 [ J] .江苏农业学报 , 2011, 27(3):556-560.
留兰香提取物体外抗猪细小病毒的作用
韩卫丽 , 　崔保安 , 　张红英 , 　王学兵 , 　徐端红 , 　陈瑞亮
(河南农业大学牧医工程学院 ,河南 郑州 450002)
收稿日期:2010-07-25
基金项目:郑州市科技创新团队资助项目(10CXTD148)
作者简介:韩卫丽(1978-),女 ,河南卫辉人 ,硕士研究生 ,研究方向为
分子免疫学。 (Tel)13523435315;(E-mail)hanxing zz@
l63.com
通讯作者:崔保安 , (E-mail)baoancui@henau.edu.cn
　　摘要:　通过观察病毒引起的细胞病变效应(Cytopathogenicefect, CPE)和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法
(MTT)检测留兰香提取物抗猪细小病毒(PPV)活性 , 计算药物对病变的抑制率和半数抑制浓度(50% inhibiting
concentration, IC
50
), 并从药物预防给药(抗病毒吸附)、直接杀灭及治疗给药(抑制病毒在细胞内的生物合成)3个
方面分析留兰香提取物抗PPV活性的作用机制。结果显示:留兰香挥发油在这 3种作用方式中对PPV均有抑制效
果 , 其半数抑制浓度(IC50)分别为 0.008 0 mg/ml、 0.001 9 mg/ml、 0.003 6 mg/ml, 治疗指数(TI)分别为 25.88、
108.95、 57.50;留兰香水提液和粗提物对 PPV直接杀灭的半数有效浓度(IC50)分别为 0.034 0 mg/ml、 0.356 0
mg/ml,治疗指数(TI)分别为 79.18、8.37;留兰香水提液和粗提物抑制病毒在细胞内生物合成的半数有效浓度
(IC50)分别为0.043 0 mg/ml、0.063 0mg/ml,治疗指数(TI)分别为 62.60、 47.27,留兰香水提液和粗提物均无抗病
毒吸附作用。表明留兰香挥发油在对PPV的 3种作用方式中均有安全高效活性 ,留兰香水提液和粗提物对PPV侵
入细胞无阻止作用 , 但在直接灭活和抑制其在细胞内的增殖方面均有较高的活性。
关键词:　留兰香;猪细小病毒;细胞病变效应;MTT法
中图分类号:　S853.7　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2011)03-0556-05
AntiviralactivityofMenthaspicataLinn.extractsagainstporcineparvo-
virusinvitro
HANWei-li, 　CUIBao-an, 　ZHANGHong-ying, 　WANGXue-bing, 　XUDuan-hong, 　CHENRui-liang
(ColegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine, HenanAgriculturalUniversity, Zhengzhou450002, China)
　　Abstract:　TheexperimentaimedtoinvestigateantiviralactivityofMenthaspicataLinn.extractsagainstporcine
parvovirus(PPV)invitro.TheactivitywasmeasuredbyMTTassayandCPE(cytopathogenicefect), basedonwhich,
inhibitionratioandmedianinhibitingconcentration(IC50)werecalculated.Theantiviralmechanismwasanalyzedthrough
threewaysofdrugadministration, addingtheextractsintocellsbefore, afterandsimultaneouswithPPVvirus.Theresults
demonstratedthatthevolatileoilsofMenthaspicataLinn.hadantivirusactivitiesinthethreereactions.Theirmedianin-
hibitingconcentrations(IC
50
)were0.008 0 mg/ml, 0.001 9mg/mland0.003 6 mg/mlrespectively.Andthetreatment
indexes(TI)were25.88, 108.95and57.50 respectively.Theaqueousextractsandroughextractsexhibitedantivirusac-
tivitiesinthetwoways(afterandsimultaneouswithPPV).Whenthetwoextractswereaddedintocellssimultaneouswith
PPV, thentheirIC50 were0.034 0 mg/mland0.356 0 mg/mlrespectively, andTIwere79.18 and8.37 respectively.
WhenthetwoextractswereaddedintocelsafterPPV, IC50 were0.043 0 mg/mland0.063 0 mg/mlrespectively, andTI
were62.60 and47.27 respectively.Whiletheybothhad
noantivirusactivitywhenaddedintocelsbeforePPV.It
indicatedthatthevolatileoilsofMenthaspicataLinn.had
safeandhigh-efficientantivirusactivityinthethreereac-
tions.Theaqueousandroughextractscouldnotkeepout
PPVvirusintocels, butcouldeficientlykillthem and
556
controltheirmultiplicationincells.
Keywords:　MenthaspicataLinn.;porcineparvovirus;cytopathogeniceffect;MTTformazan
　　猪细小病毒(PPV)为细小病毒科细小病毒属 ,
单股线状 DNA,可引起以母猪繁殖障碍和不妊症为
主要特征的病毒性传染病 ,母猪孕前期感染可致流
产 、死胎 、木乃伊胎[ 1] ,仔猪感染后可引起皮炎和腹
泻 。从 20世纪 60年代中期分离出该病毒和逐步明
确其致病作用以来 ,该病在全世界范围内阳性检出
率极高 ,目前仍是引起母猪繁殖障碍和仔猪死亡的
主要病原[ 2] ,给繁殖猪场带来巨大损失 。
留兰香(MenthaspicataLinn.)又名绿薄荷 、花
香菜 ,为唇形科薄荷属植物 [ 3-4] ,是重要的特用经济
天然香料作物 。原产欧洲 , 20世纪 80年代初中国
从美国引种 [ 5] ,近年来种植面积大规模增加 [ 6] 。留
兰香具有疏风散热 、和中理气 、辟秽解毒 、消炎 、止
血 、收敛等功效 [ 7-8] 。
国内外对其同属植物薄荷 、欧薄荷的化学成分
及药理作用研究较多 ,但对留兰香的研究多集中在
其挥发油的化学成分上 , 有关留兰香油抗菌[ 9] 、抗
炎 [ 3]方面的报道较多 ,但对其抗病毒方面的报道则
很少。本研究拟探明留兰香全草提取物及其挥发油
的体外抗猪细小病毒作用 ,为其应用于畜牧业生产
提供一定的科学依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　PK-15细胞 、PPV毒株　PK-15细胞购自中
国兽医药品监察所 ,按常规方法保存 、传代 、培养 。
PPV标准毒株 7909购于中国兽医药品监察所 ,经过
鉴定已适应 PK-15细胞。
1.1.2　药物制备　留兰香的挥发油 、水提液 、粗提
物为作者所在实验室制备 。留兰香挥发油用水蒸气
蒸馏法收集 ,加入一定浓度的吐温-80和三蒸水制
备成含量为 9.28 mg/ml的溶液;留兰香经水提醇
沉 ,回收乙醇 ,制备成生药含量为 1.00 g/ml的水提
液;留兰香经水提醇沉 ,回收乙醇 ,浓缩后加到预处
理过的 D-101大孔树脂上 ,收集不同浓度乙醇洗脱
液 ,浓缩烘干 ,用二甲基亚砜(DMSO)溶解 ,制备成
生药含量为 1.00 g/ml的留兰香粗提物 。
1.1.3　主要试剂 　1640培养基 (GIBCO公司产
品)、小牛血清(HyClone公司产品)、1640细胞生长
液(含 10%小牛血清)、1640细胞维持液(含 2.00%
小牛血清)、胰蛋白酶 (0.25%)、 PBS缓冲液 、
7.40%NaHCO3 、双抗 (青霉素 100 IU/ml、链霉素
100 IU/ml)、MTT(Solarbio公司产品)。
1.1.4　主要仪器　二氧化碳培养箱(371型 , Ther-
mo公司)、细胞培养瓶 、 96孔细胞培养板(Coring
costar公司)、XD-202型倒置显微镜(南京江南永新
光学有限公司)、SP-DJ系列垂直净化工作台(上海
浦东物理光学仪器厂)、MultiskanMK3酶联免疫检
测仪(上海雷勃分析仪器有限公司)。
1.2　试验方法
1.2.1　PPV标准毒株 7909的 TCID50测定　采用
CPE(Cytopathicefect)法 [ 1] 。 PK-15细胞计数后调
整为 1 ml2 ×105个 , 按每孔 0.1 ml接种于 96孔细
胞培养板 。 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 18 h左右
至单层细胞长至1 /2 ～ 3 /4时 ,吸去孔中培养液。将
PPV标准毒株病毒液用含 2%小牛血清的 1640维
持液作 10倍比连续稀释 ,各浓度病毒液接种于 96
孔细胞培养板 ,每个浓度设 4孔重复 ,每孔 0.1 ml。
同时设正常细胞为对照 。置 37 ℃、 5 %CO2培养箱
中培养 ,每日观察细胞病变情况 ,连续 5 d。CPE判
定指标:-表示细胞正常;+表示有 25%细胞产生
病变 、圆缩 、脱落 、裂解;2 +表示有 50%细胞产生病
变;3 +表示有 75%细胞产生病变;4 +表示有 75%
以上细胞产生病变 。按 Reed-Muench法计算病毒的
半数感染量(TCID50)。
1.2.2　药物对 PK-15细胞的毒性试验　采用 MTT
法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)。 PK-15细
胞计数后调整为 1 ml2 ×105个 ,按每孔 0.1 ml接种
于 96孔细胞培养板 。 37 ℃、5%CO2孵箱中培养 24
h,弃孔中培养液。加入 2倍比连续稀释成 9个浓度
的药物 ,每个浓度设 4孔重复 ,每孔 0.1 ml。同时设
正常细胞为对照 ,设空白培养基为空白对照孔。置
37 ℃、5%CO2孵箱中培养 ,每日观察 。 4 d后弃孔中
液体 ,加 MIT(5 mg/ml)20 μl,继续培养 4 h后弃孔
中液体 ,每孔加 DMSO0.1 ml,于微量振荡器上振荡
5 ～ 10 min。酶联检测仪于 570 nm处测定 OD值 ,计
算各浓度药物对细胞的抑制百分率 , 并按 Reed-
Muench法计算药物的最大无毒浓度(TC0 )和半数
557韩卫丽等:留兰香提取物体外抗猪细小病毒的作用
毒性浓度(TC50)。抑制率 =(细胞对照 OD值 -给
药试验组 OD值)/(细胞对照 OD值 -空白对照 OD
值)×100%。
1.2.3　药物对 PPV的抑制作用　采用 MTT法 ,根
据病毒的复制周期 ,按 3种不同的给药方式设计 3
组试验 。将 PK-15细胞计数后调整为 1 ml2 ×105
个 ,按每孔 0.1 ml接种于 96孔细胞培养板上 ,约 18
h后长至 1/2 ～ 3/4时 ,采取 3种不同的给药方式:①
先感染病毒后给药(治疗给药方式),用维持液将病
毒稀释为 100TCID50浓度 ,加入 96孔板中 ,每孔 0.1
ml,于培养箱中吸附 2 h感染细胞 , 弃病毒液 ,用
Hanks洗板 2次 ,各药物均从最大无毒浓度开始用
维持液做 2倍稀释 ,各稀释 6个浓度 ,将各浓度药物
加入已经感染的细胞板中 ,每浓度设 4孔重复 ,每孔
0.1 ml。②先给药后感染病毒(预防给药方式),从
最大无毒浓度开始 ,将 2倍比稀释好的 6个浓度的
药物加入 96孔板中 ,每孔 0.1 ml,于培养箱中孵育
2 h,将板中的培养液弃去 ,用 Hanks洗板 2次 ,接种
100TCID50病毒稀释液 ,每孔 0.1 ml。 ③药物与病毒
同时作用(直接灭活方式),不同浓度药物与病毒相
混合后 , 37 ℃培养箱中作用 2 h后接种细胞 ,药物和
病毒终浓度均与①②保持一致 。以上不同的给药方
法 ,每个浓度设 4个复孔 ,同时设细胞对照组和病毒
对照组 ,于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 ,每日观察
细胞病变。 4 d后每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl,于
37 ℃培养箱中孵育 4 h。将细胞板中的液体小心吸
去 ,每孔加入 DMSO0.1 ml,振荡 ,作用 5 ～ 10 min。
酶标仪测 OD值(570 nm),计算不同给药方法对病
毒的抑制率 ,并用 Reed-Muench法计算药物的半数
有效浓度(IC50)。抑制率 =(药物处理组 OD值 -
病毒对照组 OD值)/(细胞对照组 OD值 -病毒对
照组 OD值)×100%。
1.3　统计处理
采用 SPSS13.0统计软件中 One-wayANOVA过
程对各浓度留兰香组 、正常细胞对照组 、病毒对照组
间光密度均数进行方差分析及组间多重比较 ,确定
各药物组间及其与对照组间光密度值是否有显著性
差异;根据药物对细胞的抑制百分率和对病毒的抑
制百分率 ,用 Reed-Muench法计算药物的半数毒性
浓度(TC50)和半数有效浓度(IC50),得到药物的治
疗指数(TI)=TC50 /IC50。
2　结 果
2.1　病毒 TCID50的测定结果
标准 PPV毒株 7909在 PK-15细胞中的TCID50 =
10
-6.35 ,试验中病毒攻击量为 0.1 ml的 100TCID50。
2.2　药物对 PK-15细胞的毒性
将不同浓度的药物作用于细胞 ,根据公式计算
出细胞存活率和 TC50 ,结果见表 1。
表 1　留兰香提取物对 PK-15细胞的毒性
Table1　ToxicitiesofdiferentMenthaspicataLinn.extractsonPK-15 cels
留兰香挥发油
浓度
(mg/ml) 　　OD值
　细胞抑制率
　(%)
留兰香水提液
浓度
(mg/ml) 　　OD值
　细胞抑制率
　(%)
留兰香粗提物
浓度
(mg/ml) 　　OD值
　细胞抑制率
　(%)
0.464 0　　 0.310＊＊ 87.17 12.500 0　　 0.243＊＊ 85.78 12.500 0　　 0.333＊＊ 86.11
0.232 0 0.524＊＊ 59.60 6.250 0 0.254＊＊ 84.37 6.250 0 0.380＊＊ 79.61
0.116 0 0.962 2.91 3.125 0 0.387＊＊ 66.02 3.125 0 0.569＊＊ 53.52
0.058 0 1.012 -3.52 1.562 5 0.927 -8.36 1.562 5 0.940 2.28
0.029 0 1.019 -4.46 0.781 2 0.999＊＊ -18.31 0.781 2 1.020＊ -8.85
0.014 5 1.055 -9.15 0.390 6 0.934 -9.33 0.390 6 1.045＊＊ -12.20
0.007 3 1.054 -8.92 0.195 3 0.943＊ -10.50 0.195 3 1.058＊＊ -14.10
0.003 6 1.027 -5.46 0.097 7 0.954＊ -12.05 0.097 7 0.995 -5.36
0.001 8 1.072＊ -11.28 0.048 8 1.018＊＊ -20.93 0.048 8 1.184＊＊ -31.48
正常细胞对照　 0.985 0 正常细胞对照　 0.866 0 正常细胞对照　 0.956 0
空白培养基对照 0.211 100.00 空白培养基对照 0.140 100.00 空白培养基对照 0.233 100.00
留兰香挥发油 、水提液 、粗提物的 TC50值分别为 0.207、 2.692、2.978;＊、＊＊表示与细胞对照比较差异分别达到 0.05和 0.01显著水平。
558 江 苏 农 业 学 报 　2011年 第 27 卷 第 3期
2.2.1　留兰香挥发油对 PK-15细胞的毒性　由表
1可见:随着处理浓度降低 ,留兰香挥发油对细胞的
抑制率变小 ,其中 OD值最高的是 0.001 8 mg/ml
组 ,细胞活度很高 (P<0.01);浓度为 0.116 0 ～
0.003 6 mg/ml时 OD值与对照组差异不显著(P>
0.05);而浓度在 0.232 0 ～ 0.464 0 mg/ml时 OD值
则极显著低于对照组(P<0.01)。说明留兰香挥发
油在高浓度时抑制细胞生长 ,随着浓度的降低表现
出明显的促细胞生长作用 。
2.2.2　留兰香水提液和留兰香粗提物对 PK-15细
胞的毒性　由表 1可见:留兰香水提液和粗提物对
PK-15细胞的毒性比较接近 ,即随着药物浓度的降
低 ,对细胞的抑制率逐渐降低 , 浓度为 1.562 5 ～
0.048 8 mg/ml时 OD值与对照组相比持平或显著
高于对照组 , 浓度在 3.125 0 ～ 12.500 0 mg/ml时
OD值则极显著低于对照组 (P<0.01)。 2种药物
在高浓度时抑制细胞生长 ,在低浓度时则表现出明
显的促细胞生长作用。
2.3　药物对 PPV增殖的抑制作用
2.3.1　留兰香挥发油对 PPV增殖的抑制作用　表
2显示:留兰香挥发油在与病毒直接作用方式中 ,对
病毒的抑制效果最好 ,在 0.007 3 mg/ml浓度时 ,抑
制率接近 100%;效果较好的为治疗给药方式 ,浓度
达到 0.014 5 mg/ml时 ,对病毒的抑制率超过 90%;
在 3种作用方式中 ,随着浓度升高 ,其抗病毒活性均
增强 。
表 2　留兰香挥发油对猪细小病毒(PPV)的抑制作用
Table2　TheinhibitionofvolatileoilsofMenthaspicataLinn.onPPVvirus
作用方式 浓度 (mg/ml)
0.029 0 0.014 5 0.007 3 0.003 6 0.001 8 0.000 9 IC50 治疗指数
病毒抑制率(%)
预防给药 117.32 69.88 47.05 43.11 24.80 24.80 0.008 0 25.88
直接灭活 111.43 102.26 98.20 84.06 46.02 10.98 0.001 9 108.95
治疗给药 104.32 91.73 88.85 49.40 55.28 40.89 0.003 6 57.50
2.3.2　留兰香水提液及粗提物对 PPV增殖的抑制
作用　表 3显示:留兰香水提液及粗提物在直接灭
活及治疗给药方式中 ,对病毒的抑制作用较为明显 。
留兰香水提液浓度在 0.195 mg/ml以上时 ,在直接
灭活作用方式中对病毒的抑制率达 100%以上;留
兰香粗提物浓度在 0.391 mg/ml时 ,在治疗作用方
式中对病毒的抑制率接近 100%。留兰香水提液及
粗提物在预防给药方式中 ,对病毒的抑制效果都不
明显 。从整体上看 ,药物对病毒的抑制活性随着浓
度的提高而加强。
表 3　留兰香水提液及粗提物对 PPV的抑制作用
Table3　TheinhibitionofaqueousandroughextractsofMenthaspicataLinn.onPPVvirus
药物 作用方式 浓度 (mg/ml)
0.781 0.391 0.195 0.098 0.049 0.024 IC50 治疗指数
病毒抑制率(%)
留兰香水提液 预防给药 45.12 35.52 30.81 9.76 7.91 6.57 - -
直接灭活 152.35 121.03 109.62 87.02 66.22 32.66 0.034 79.18
治疗给药 144.39 101.91 68.75 57.14 51.79 38.44 0.043 62.60
留兰香粗提物 预防给药 31.09 8.99 3.37 -36.70 -44.94 -59.18 - -
直接灭活 101.97 55.91 11.42 22.44 -33.46 -37.40 0.356 8.37
治疗给药 123.17 99.16 88.62 56.04 46.63 25.56 0.063 47.27
3　讨 论
留兰香为民间常用药 ,用于治疗伤风感冒 、头
痛 、胃气痛 、目赤 、口疮 、牙痛等症。也有研究表明 ,
留兰香某些成分具有调节胃肠运动的功能以及镇
静 、缓解胃肠部痉挛的作用[ 10] ,并具有抗细菌 、真菌
559韩卫丽等:留兰香提取物体外抗猪细小病毒的作用
等作用 [ 11] 。本研究结果表明 ,预防给药方式只有留
兰香挥发油具有保护细胞免受 PPV攻击的能力 ,对
病毒吸附在细胞表面有阻止作用 ,而水提液和粗提
物在低浓度范围内则无明显的阻止 PPV的吸附作
用;治疗给药方式时 , 3种提取物皆具有抑制 PPV在
PK-15细胞内生物合成的作用 ,对进入细胞内的病
毒有抑制增殖作用;直接灭活给药方式时 3种提取
物均表现出安全高效的直接杀灭作用 。从整体看 ,
留兰香提取物对 PPV的直接杀灭和抑制其在细胞
内的增殖作用远优于其阻止 PPV吸附细胞的能力。
在本试验中 ,留兰香水提液抗 PPV病毒的效果
优于粗提物 ,留兰香水提液浓缩过 D-101大孔树脂
后 ,除去了大部分易溶于水的极性成分 ,保留了黄酮
类 、木脂素类 [ 8]等非极性成分后 ,溶解制成与水提
液生药含量一致的粗提物 ,试验显示其抗 PPV作用
不及水提液 ,而水溶性成分经预试验并无抗 PPV作
用 ,推测应是留兰香水溶性成分对于其主要有效成
分的活性具有增强作用。
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