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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
现代基因工程和各种生物反应器的出现，使具
有高经济附加值的药用蛋白的生产成为可能。植物
生物反应器为人类提供了一个更加安全和廉价的生
产体系。其中，植物瞬时表达系统具有经济、安全、
快速等特点，已被人们广泛关注。植物瞬时表达系
统利用携带外源基因的病毒在宿主中的大量复制而
获得较高的表达水平，经常使用的病毒载体有烟草
花叶病毒（TMV）、马铃薯 X 病毒（PVX）、烟草脆
裂病毒（TRV）和豇豆花叶病毒（CPMV）等［1，2］。
自从人们发现植物中表达的药用蛋白具有生物
学活性以来，很多研究人员都试图利用植物瞬时表
收稿日期 ：2013-08-05
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31070224）
作者简介 ：杨丽萍，博士，讲师，研究方向 ：植物生物反应器 ；E-mail ：yangliping781124@163.com
通讯作者 ：周晓馥，博士，教授，研究方向 ：植物生物反应器 ；E-mail ：zhouxiaofu@jlnu.edu.cn
利用农杆菌侵染新技术在豌豆中瞬时表达 ha FGF
杨丽萍  金太成  周晓馥
（吉林师范大学生命科学学院，四平 136000）
摘 要 ： 采用一种操作简单的侵染方法，通过豌豆种子吸收携带病毒载体 PEBV 的农杆菌菌液进行 ha FGF 蛋白的表达，并
采用半定量 RT-PCR、Western blotting 和考马斯亮蓝法对蛋白表达的结果进行定量分析。结果表明，利用来源于 PEBV 的病毒载体
在豌豆（Pisum sativum L.）中成功表达了 GFP 和 ha FGF 蛋白，对菌液浓度等条件的优化显著提高了 GFP 的表达效率，植物中药
用蛋白 ha FGF 的表达水平占总可溶性蛋白的 2.6%。该瞬时表达体系具有独特优势，如简便、高效、表达稳定，在生产药用蛋白
方面具有广阔的应用前景。
关键词 ： 人酸性成纤维细胞生长因子 种子吸收法 豌豆早褐病毒 绿色荧光蛋白
Transient Expression of ha FGF in Pea Plants by New Agroinoculation
Biotechnology
Yang Liping Jin Taicheng Zhou Xiaofu
（The School of Life Science，Jilin Normal University，Siping 136000）
Abstract:  The paper described a simple system to product ha FGF protein in pea plants by seed absorbing the Agrobacterium suspension
containing PEBV-based vectors, and the expression results was detected by semi-quantitative RT-PCR, Western blotting, and Coomassie brilliant
blue method. It has been shown that GFP and ha FGF protein were successfully expressed in pea（Pisum sativum L.）plants. The optimization
of Agrobacterium cell density dramatically improved expression efficiency of GFP protein. The amount of recombinant pharmaceutical ha FGF
in plants reached up to 2.6% of the total soluble proteins. The new system has the special advantages as easiest way, high efficiency, stable
expression, and has the wide application in production of pharmaceutical proteins in the future.
Key words:  Human acidic fibroblast growth factor（ha FGF） Seed absorption system Pea early browning virus（PEBV） GFP
达系统来生产药用蛋白。如 Hull 等［3］在烟草中利
用农杆菌介导的瞬时表达系统表达了可治疗炭疽病
的多克隆抗体。人们利用抗原展示策略也成功地表
达了多种抗原蛋白，如利用 TMV 表达流感病毒血凝
素抗原疫苗、人免疫缺陷病毒（HIV-1）膜蛋白抗原
疫苗等［4］；利用 CPMV 表达了口蹄疫病毒（FMDV）
VP1 疫苗，人免疫缺陷病毒（HIV-1）疫苗，人鼻病 -14
（HRV-14）抗原疫苗等［5-7］。目前，利用植物瞬时
表达系统已经成功表达了多种药用蛋白，包括生长
因子、激素、抗体、疫苗等。
常用的植物瞬时表达的侵染技术主要有叶片注
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期72
射法和真空侵染技术。Li 等［8］把人乳铁蛋白 N 端
重组到 PVX 载体，并用叶片注射法在烟草中成功
表达，目的蛋白表达量可达到总可溶蛋白的 0.6%。
Ramrez 等［9］利用真空侵染法在烟草中成功的表达
了乙型肝炎表面抗原的单链抗体。Negrouk 等［10］使
用真空侵染的方法利用莴苣高效表达了功能性重组
抗 体。2002 年，Mahmoudian 等［11］ 利 用 GUS 基 因
做标记基因，对小扁豆子叶节进行真空侵染，并获
得成功。Liu 等［12］2007 年利用叶片注射法在烟草中
表达了具有生物活性的药用蛋白 ha FGF，表达水平
达到总可溶性蛋白 1%。人们不断研究提高蛋白表
达效率和表达水平的策略，而对于其它农杆菌侵染
技术的研究较少，其中 Yang 等［13］ 2008 年利用根部
吸收法在烟草（Nicotiana tabacum L.）中成功表达了
GFP，其表达水平约占植株总可溶性蛋白的 5%。
人 酸 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子（human acidic
fibroblast growth factor，ha FGF）在个体发育、血管
生成、促进伤口愈合等过程中发挥重要功能［14，15］。
ha FGF 具有促进伤口愈合和溃疡修复的功能，使
其成为治疗溃疡及缺血性疾病的新药用蛋白［16，17］。
2011 年，Fan 等［18］利用农杆菌介导的真空渗透瞬
时表达体系，目的蛋白 ha FGF 获得了成功表达。目
前，国内外学者已经成功在昆虫细胞、家蚕、酵
母、哺乳动物和植物等多种不同表达系统中实现了
ha FGF 的表达［19］。人们在不断地研究和开发新的
药用蛋白的生产途径，植物药用蛋白产品表现出潜
在的市场和广阔应用前景［20］。有科学家预测，未来
5-10 年植物将成为临床治疗或诊断药品的主要生产
系统［21，22］。
植物生物反应器的瞬时表达系统近 20 年发展
十分迅速，但人们逐渐认识到其还具有很多局限性，
如侵染技术单一、工作效率低。建立和应用新技术
进行重组药用蛋白表达的研究是十分必要的。由于
植物瞬时表达体系侵染技术方法较少，实验室常用
的叶片注射法需要逐个叶片进行注射，操作既繁琐，
又费时费力。为了建立和优化更多新型侵染技术，
并进一步扩大宿主范围，我们选用豆科植物表达载
体在豌豆中建立并优化新技术体系，进行重组药用
蛋白的表达研究。本研究利用发芽种子自然吸收携
带外源基因和病毒载体的农杆菌重悬液，在豌豆
（Pisum sativum L.）中表达 GFP 和药用蛋白 ha FGF，
旨在通过这种侵染技术提高侵染的工作效率及表达
水平，为利用植物瞬时表达系统规模化生产外源蛋
白提供新的技术方法和研究依据。
1 材料与方法
1.1 材料
豌豆种子和番茄种子以及 JM109、GV3101 等
菌株由本实验室保存 ；豆科植物表达载体 pCAPE1、
pCAPE2-GFP 和 pgR107-haFGF 为 东 北 师 范 大 学 遗
传发育研究所王兴智教授惠赠。植物瞬时表达载体
pCAPE2-haFGF 由本实验室构建。
1.2 方法
1.2.1 菌 液 重 悬 液 的 制 备 与 种 子 吸 收 法 侵 染 植
物 采 用 冻 融 法 将 质 粒 pCAPE2-GFP 和 pCAPE2-
aFGF 转入农杆菌 GV3101 中。通过菌落 PCR 和测序
方法进行阳性克隆的鉴定。分别挑取重组的农杆菌
单 菌 落 GV3101-pCAPE1、GV3101-pCAPE2-GFP 和
GV3101-pCAPE2-aFGF，小摇后挑取菌落放在含有 5
μL/mL 卡那霉素和 5 μL/mL 利福平的 5 mL LB 培养
基中 ；28℃培养 18 h 后按 1∶50 比例进行扩摇，另
加终浓度为 20 μmol/L 的乙酰丁香酮（AS）和终浓
度 为 10 mmol/L 的 乙 磺 酸（MES）。 收 集 菌 体， 用
MMA 溶液重悬（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Mes 和
100 μmol/L AS）。菌液重悬液 MMA 在室温、黑暗条
件下静置 3 h 备用。菌液重悬液 MMA 的制备方法为：
分别在不同浓度 MMA OD600 条件下，利用种子吸收
法对豌豆发芽种子进行侵染试验（每组选取 50 颗
发芽种子）。观察并记录不同菌液浓度下 GFP 的表
达效率（表达 GFP 的株数占总侵染株数的百分比），
重复 2 次试验。
将豌豆种子放在铺有湿润纱布的培养皿上，在
恒温光照培养箱中（25±3）℃每天光照 16 h 和黑暗
8 h，进行发芽处理。将发芽（芽长 1-2 cm）的豌豆
种子浸泡于菌液重悬液 MMA 中，暗培养 24 h 后，
可采用水培或土培法进行培养。
1.2.2 反转录 PCR 反应（Reverse transcription-PCR，
RT-PCR） 分别提取侵染后的豌豆茎和叶片总 RNA，
进行 RT-PCR 反应，具体步骤按照反转录 PCR 试剂
盒（TaKaRa）的操作说明书操作。
2013年第10期 73杨丽萍等 ：利用农杆菌侵染新技术在豌豆中瞬时表达 ha FGF
1.2.3 豌豆植株总可溶性蛋白的提取和检测 以侵
染 7 d 和 14 d 的豌豆茎和叶片为材料，按照 PBS 方
法进行植物总可溶性蛋白的提取。每 100 mg 的植物
材料加 PBS（pH 为 7.2）提取液 100 μL，4℃条件下
12 000 r/min 离心 15 min。提取的样品用 Bradford 建
立的考马斯亮蓝 G-250 法进行蛋白表达水平的定量
分析，取 6 支试管，按表 1 数据配制 0-100 μg/mL
血清白蛋白液各 1 mL。准确吸取所配各管溶液 0.1
mL，分别放入 10 mL 具塞试管中，加入 5 mL 考马
斯亮蓝 G-250 试剂，盖塞，反转混合数次，放置 2
min 后，在 595 nm 下比色，绘制标准曲线。吸取样
品提取液 0.1 mL，放入试管中，加入 5 mL 考马斯亮
蓝 G-250 试剂，充分混合，放置 2 min 后在 595 nm
下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质
浓度，并计算蛋白质含量。用 Western blotting 进行
蛋白水平的分子检测。
表 1 标准曲线的绘制
管号
100 μg/mL 牛血
清蛋白量（mL）
蒸馏水
（mL）
考马斯亮蓝 G-250
试剂（mL）
蛋白质含
量（mg/g）
1 0 1.0 5 0
2 0.2 0.8 5 20
3 0.4 0.6 5 40
4 0.6 0.4 5 60
5 0.8 0.2 5 80
6 1.0 0 5 100
2 结果
2.1 GFP的表达与观察
用 携 带 病 毒 载 体 GV3101-pCAPE1 和 GV3101-
pCAPE2-GFP 的菌液重悬液 OD600 =1.2 侵染豌豆发
芽种子 24 h 后，用水培法或移栽至花盆中继续培养
30 d。分别侵染 3 批豌豆发芽种子，并对 GFP 蛋白
表达的过程进行紫外观察和拍照记录。结果（图 1）
表明，在侵染菌液后第 7 天，GFP 的表达主要在茎
组织中，并向上传递到新生的叶片 ；可以观察到叶
片中的绿色荧光主要集中在叶脉部位（图 1-B）；在
侵染后第 14 天，在茎和叶片中都能观察到较强的绿
色荧光 ；叶片中的绿色荧光显著增加（图 1-C）；在
侵染后第 21 天，茎和叶片中的绿色荧光都开始消退，
在侵染后第 28 天，整株植物的绿色荧光基本消失，
仅在叶片中观察到荧光的残留迹象（图 1-D），而侵
染空载体的对照植物中未观察到绿色荧光（图 1-A）。
A B C D
A ：对照植物 ；B ：侵染后第 7 天豌豆茎和新生叶片中 GFP 的表达 ；C ：侵
染后第 14 天 GFP 在整株豌豆中的表达 ；D ：侵染后第 28 天绿色荧光基本消退
图 1 豌豆中 GFP 的瞬时表达
2.2 豌豆中种子吸收法侵染条件的优化
菌液浓度和菌液活性是影响植物中外源蛋白瞬
时表达的关键条件，首先通过平板划线法进行菌液
活化，然后再对影响 GFP 表达的关键因素——菌
液浓度进行了优化。结果（图 2）表明，菌液重悬
液的浓度过高或过低都不利于 GFP 的表达 ；MMA
OD600=1.0 时为菌液重悬液的最适浓度，GFP 的表达
效率相对较高，占侵染总植株数的 92%（图 2-A）。
同样，对培养温度条件进行优化试验，结果（图 2-B）
表明，当菌液 MMA OD600=1.0 时，种子培养和侵染
的最适温度条件为 30℃。
2.3 豌豆中ha FGF的瞬时表达
首先在转录水平上对基因 ha FGF 的表达进行
了检测。分别以侵染后第 7 天和 14 天的豌豆茎和叶
片为材料，利用 TRIZAL 试剂提取植物总 RNA，并
进行半定量 RT-PCR 检测。结果（图 3-A）表明，侵
染后第 14 天的 ha FGF 基因表达水平较高。以侵染
后第 14 天的豌豆茎和叶片作为材料，用 PBS 法提
取植物总可溶性蛋白，采用考马斯亮蓝法对 ha FGF
蛋白的表达水平进行定量分析，根据所测定的 A595nm
值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，进
行 3 次重复试验，从而计算出样品蛋白的平均浓度
为 2.6 μg/mL。计算 ha FGF 蛋白的表达量占植株叶
片总可溶性蛋白的 2.6%。同样，按照上述方法提取
植物的总可溶性蛋白，并进行 Western blotting 检测，
杂交结果（图 3-B）表明，外源蛋白 ha FGF 在豌豆
的叶片和茎组织中表达。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期74
3 讨论
3.1 豌豆中种子吸收法的建立和优化
植物生物反应器的发展和进步已经为人类带来
巨大的经济价值，其主要表达系统之一的植物瞬时
表达体系还有较大的发展空间。选择豆科模式植物
豌豆作为宿主，利用豆科表达载体 PEBV 进行 GFP
和外源蛋白 ha FGF 的表达研究，针对农杆菌侵染技
术进行改进和优化，以获得更有效的植物瞬时表达
体系。利用种子自然吸收农杆菌菌液表达外源蛋白
的方法具有操作简便、省时省力、适合大量植物的
侵染，具有批量生产的可能性。通过报告基因 GFP
的研究结果对该表达体系进行菌液浓度和温度条件
的优化，可能由于豌豆发芽种子具有较强的吸收能
力，而使该表达体系具有较高的表达效率（92%）。
但是试验中需要注意防止杂菌生长和种子腐烂，
以免影响侵染效率，可以采取每天用灭菌水冲洗的
方法避免 ；也要注意防止发芽种子及幼苗枯萎，可
以用三层纱布保持种子的湿度的方法，也可以及时
移栽到花盆中进行土壤栽培。这些具体条件的优化
可以保证农杆菌重悬液的有效侵染。
3.2 ha FGF在豌豆中的高效表达
人们发现植物中表达的药用蛋白具有生物学活
性以来，国外大量研究人员都试图构建植物病毒载
体来大规模地生产药用蛋白，以满足人们对疾病治
疗的大量需求。人酸性成纤维细胞生长因子 ha FGF
是一种具有高经济价值的药用蛋白，被用于多种疾
病的治疗。植物是最天然最经济的生物反应器，而
我们最需要的是高效和快速的生产技术。研究表明，
在豆科植物中建立的瞬时表达体系，其药用蛋白 ha
FGF 表达水平约占植物可溶性蛋白的 2.6%。2004 年，
Li 等［8］利用植物成功表达了人乳铁传递蛋白，表达
量为 0.6%。2007 年，Liu 等［12］在烟草（N. tabacum）
中成功地表达了 ha FGF，表达量约占总可溶性蛋白
1%。植物稳定表达系统的外源蛋白表达水平普遍较
低，使用病毒表达载体等策略能有效提高外源蛋白
的表达水平［23，24］。与国内外一些药用蛋白的表达量
相比，该表达体系的蛋白表达水平较高，完全适用
于药用蛋白的表达和生产需要。
4 结论
利用来源于 PEBV 的病毒载体进行药用蛋白的
表达研究，并应用新型侵染技术成功表达了 GFP
和药用蛋白 ha FGF。通过对菌液浓度和温度条件
的优化显著提高了 GFP 的表达效率，并获得了 ha
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
A
ਁ㣭⿽ᆀⲴษޫ⑙ᓖć
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
24 26 28 30 32
㺘䗮
᭸⦷
%
㺘䗮
᭸⦷
%
B
㧼⏢䟽ᛜ⏢OD600
A ：菌液浓度 OD600 分别为 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和 1.6 时，豌豆中 GFP
的表达效率 ；B ：豌豆种子培养温度条件对 GFP 的表达效率的影响
图 2 豌豆中表达 GFP 的侵染条件的优化
䉼䉶ਦ 䉼䉶㤾
7 14 7 14 dpi
ha FGF
Actin
dpi
ha FGF
䉼䉶ਦMock 䉼䉶㤾
7 147 14
A
B
7 14
A ：豌豆植株总 RNA 的半定量 PCR 结果 ；Actin 为内参 ；B ：从侵染病毒载
体的豌豆茎、叶中提取总可溶性蛋白，进行 Western blotting ；Mock 为侵染空
载体豌豆 ；7，14 dpi（days post-inoculation）表示侵染后 7 和 14 d
图 3 豌豆中 ha FGF 表达的分析
2013年第10期 75杨丽萍等 ：利用农杆菌侵染新技术在豌豆中瞬时表达 ha FGF
FGF 较高水平的表达。本研究建立了在豌豆（Pisum
sativum L.）中高效、快速和简便的瞬时表达体系。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）