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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
在过去的一段时间里，人们逐渐意识到非编码
RNA（Non-protein-cooding RNAs，ncRNA）的重要性。
从蛋白质合成到基因表达的调控，ncRNA 都扮演着
收稿日期 ：2012-09-20
基金项目 ： 贵州省科技计划项目（黔科合 OZ 字［2009］2），贵州省科学技术基金项目（黔科合 J 字［2008］2318 号），遵义医学院博士科
研启动基金项目（贵州黔科合［2009］3070）
作者简介 ：王燕，女，博士，研究方向 ：肿瘤分子生物学 ；E-mail ：zijunv@163.com
改良消减杂交技术用以筛选差异表达非编码
小 RNA 的应用初探
王燕1  彭莉萍1  陈锦珍2  刘星1  罗镇明1  周天会1
（1. 遵义医学院珠海校区生化与细胞分子生物学教研室，珠海 519041 ；2. 遵义医学院第五附属医院普外科，珠海 519041）
摘 要 ： 旨在构建一种能快速、有效检测不同细胞中差异表达的非编码小 RNA 的方法。以乳腺癌细胞株 MCF7 和非癌乳腺
上皮细胞 HBL100 为材料，用 RNA 分离试剂盒分离获得长度为 18-100 nt 的 RNA 片段，3 端添加 poly（A）尾后利用 smart 技术进
行反转录，在反转录体系中加入生物素标记的 dATP，得到单链 cDNA ；结合生物素 - 磁珠分离技术将 cDNA 与待测 RNA 进行消减
杂交并以 U6 为内参验证消减结果 ；最后利用巢式 PCR 扩增杂交产物，PCR 产物插入 T 载体后，挑取阳性克隆进行测序。结果显
示，总 RNA 按不同大小片段分离富集后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，于 100 nt 以下显示较亮条带 ；以 U6 为内参检测杂交效率，杂
交后 U6 于 33 个循环时可见少量扩增条带 ；杂交产物经巢式 PCR 和电泳表明在 100 nt 范围内有明显条带，得到差异表达的非编码
小 RNA。经过改良的消减杂交方法可以快速、有效的检测不同标本中差异表达的非编码小 RNA。
关键词 ： 非编码小 RNA 消减杂交 乳腺癌细胞
Primary Investigation of Improved Subtractive Hybridization that Can
High Efficiently Screen Differentially Expressed Small ncRNA
Wang Yan1 Peng Liping1 Chen Jinzhen2 Liu Xing1 Luo Zhenming1 Zhou Tianhui1
（1. Zhuhai Campus of Zunyi Medical College Room，Biochemistry and Molecular Biology of the Cell，Zhuhai 519041 ；2. Fifth Department of
General Surgery，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zhuhai 519041）
Abstract:  The purpose of this paper is to build a new method that can detect the differences of small non-coding RNAs in breast cancer
cells. This paper adopt the methods of isolating the total RNA from breast cancer cell lines MCF7 and nontumorigenic cell line HBL100, then
adopting the RNA Isolation Kit to isolate the special size of RNAs（18-100 nt）, which were added poly（A）trails at the 3-end and then
reversing into the first strand of cDNA. After the subtractive hybridization of single stranded cDNA and RNAs, the differences of expressed small
non-coding RNAs can be obtained with the method of using SA-PMPS Isolation System and the final result of hybridization can been tested by
the internal reference of U6. Eventually, the products of hybridization were amplified through Nest PCR and PCR products were then lighted into
T vector for sequencing. Results showed that after isolation, some special bands will be shown within 100 nt in the 10% polyacrylamide gel ；the
result of subtractive products PCR, which adopts the internal reference of U6, only shows visible band after 33 PCR circles. There were obvious
bands within the size of 100 nt after Nest PCR and electrophoresis for the products of subtractive hybridization concluding the differences of
expressed small non-coding RNAs were obtained. In this study, the improved subtractive hybridization can effectively identify the differences of
expressed small non-coding RNAs in different cells.
Key words:  Small non-coding RNA Subtractive hybridization Breast cancer cell
重要的角色。作为一类非编码蛋白质的 RNA，nc-
RNAs 从 RNA 的水平上在生物体内发挥着基础性
功能，包括 DNA 复制、染色体的维持、转录调控、
2013年第2期 147王燕等 ：改良消减杂交技术用以筛选差异表达非编码小 RNA 的应用初探
RNA 的加工、mRNA 的转录与稳定及蛋白质的翻
译［1］。它既包括 microRNA［2］、siRNA、piRNA［3］等
短片段长度的 ncRNA，又包括长度在 200 nt 以上的
ncRNA，它们在生物体内广泛存在，通过 RNA 干扰、
基因沉默、基因印记、DNA 甲基化等机制调控着基
因的表达。例如，一种含 21-23 nt、在生物体内十
分重要且丰度较高的 RNA—microRNAs（miRNA），
它们与多种蛋白质分子形成一种转录沉默复合体与
靶 mRNA 的 3 UTR（非编码区）特异性结合从而抑
制 mRNA 的表达或引起其降解，在基因的转录后调
控中发挥着关键性的作用［4］；许多肿瘤的发生、发
展与细胞内 miRNA 的异常表达有关［5］，因此肿瘤
细胞内差异表达的小 ncRNA 可以作为肿瘤检测和
发生机制研究的一个重要方面。通过基因芯片技术
和生物信息学方法可以检出肿瘤细胞中特异表达的
ncRNA 从而为阐明肿瘤发生的分子机制提供新的试
验依据［6］。但是它只能依赖于已被发现鉴定 ncRNA
却无法筛选出新的 ncRNA。目前检测新 ncRNA 的方
法主要是构建编码各类 ncRNA 特异 cDNA 文库，然
而这种检测结果却会被一些看家 ncRNAs，如核糖体
RNA、核内小 RNA 等严重干扰。而消减杂交技术
可有效地降低甚至消除这种干扰。抑制性消减杂交
技术（suppression subtractive hybridization，SSH）是
Diatchenko 等［7］1996 年在抑制性 PCR 的基础上建
立起来的 cDNA 消减杂交方法，十分适用于克隆分
析造成某种特殊表型的目的基因，是研究细胞产生
变化的分子机理的有效方法。传统的抑制性消减杂
交技术操作步骤多、费时费力、易丢失信息。因此，
在传统消减杂交的基础上，本试验使用了 QIAGEN
公司的 RNA 分离方法，分离一定大小的 RNA 片段
（主要是 18-100 nt 的小 RNA），减小了非目的 RNA
的干扰，同时结合了 Promega 公司的生物素 - 磁珠
亲和分离技术，旨在探索一种快速检测、有效筛选
不同细胞中差异表达的非编码小 RNA 的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
乳腺癌细胞株 MCF7 和乳腺上皮细胞 HBL100，
购于中国科学院细胞库（上海）。主要试剂 PolyA
Ttract mRNA Isolation Systems Kit 购自 Promega 公司 ；
PCR-Select cDNA Subtraction Kit 购自 Clontech 公司 ；
DIG-11-dUTP 购于 Roche 公司 ；Trizol 试剂购自 Invi-
trogen 公司 ；pMD18-T Vector 购于宝生物工程有限
公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 MCF7 和 HBL100 细胞于含有 10%
胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中常规培养，待细胞
长至 90% 左右后用胰酶消化并收集。
1.2.2 不同片段大小 RNA 的分离与富集 采用 Trizol
法提取总 RNA，然后使用 RNeasy MinElute Cleanup
Kit 试剂盒分离纯化大片段（>100 nt）RNA ；用 Mi-
RNeasy Mini Kit 试剂盒按照说明书步骤分离小片段
（18-100 nt）RNA，电泳检测分离富集小 RNA 效果。
1.2.3 添加 poly（A）尾 在微量离心管中依次加入
10×poly（A）polymerase Buffer 5 μL，MgCl2 5 μL，
DTT 5 μL，0.1% BAS 10 μL，ATP 0.5 μL，RNA 10
μmol/L，Poly（A）polymerase（0.2-2 U/μL）5 U，
ddH2O 加至 100 μL，置于 37℃水浴锅中反应 30 min。
1.2.4 含 poly（A）尾 RNA 的分离与 cDNA 第一链
的获得
1.2.4.1 探针的退火 在上一步反应后的微量离心
管内加入 RNase-free ddH2O 至终体积为 500 μL，于
65℃加热 10 min 后加入 3 μL 的 Biotin-oligo（dT）探
针和 3 μL 的 20×SSC，温和摇匀，于室温孵育至完
全冷却。
1.2.4.2 链霉亲和素磁珠粒（SA-PMPS）的洗涤 震
荡盛装 SA-PMPS 的玻璃管磁珠重悬至完全分散，将
管置于磁架上捕获 SA-PMPS，小心移去上清液 ；用
0.5×SSC（每次 300 μL）洗涤 SA-PMPS 3 次，每次
洗后都用磁台捕获 SA-PMPS 并移去上清液，最后用
100 μL 0.5×SSC 重悬洗后的 SA-PMPS。
1.2.4.3 RNA 的捕获、洗涤 将退火后的探针加入
到 含 有 SA-PMPS 管 中， 室 温 孵 育 10 min， 每 1-2
min 翻转管内液体使之混匀 ；然后用磁台捕获 SA-
PMPS，小心移去上清液，再用 0.1×SSC（每次 300
μL）洗涤磁珠 4 次。将最后一次所得 SA-PMPS 重悬
于 100 μL RNase-free ddH2O 中。
1.2.4.4 反转录获得 cDNA 第一链 在离心管内加入
RNA 2 μL，Oligo（dT）primer 2 μL，5×primer Script
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期148
Buffer 8 μL，dNTP 8 μL，Biotin-dUTP 1 μL，Primer-
Script Reverse Transcriptase（200 U/μL）1 μL，RNe-
ase-free ddH2O 加至 40 μL 各反应液，混匀，42℃水
浴中反应 1 h。
1.2.4.5 单链 cDNA 的制备 反转录后将离心管放
于沸水中加热 1 min，再置于冰水中聚然冷却 1 min，
迅速转移离心管至磁架上，小心吸去上清液。取下
离心管，加入 100 μL 0.1×SSC 重悬磁珠，重复以上
操作，即获得单链 cDNA。
1.2.5 消减杂交 取 30 μL 制备好的 SW480 cDNA 探
针于一支 RNease-free 的离心管中，加入 30 μL MCF7
的 RNA 分 离 液 和 13 μL 20×SSC， 混 匀 后， 盖 上
盖子并用封口膜封住管口，放置于分子杂交仪中，
68℃杂交 22 h。
1.2.6 杂交液的纯化 将杂交后的离心管置于磁架
上，小心吸取上清液于另一支 RNease-free 的离心管
中。取一支 MiRNeasy Mini 柱子按照上述 RNA 分离
时的相同步骤操作得到目的 RNA 片段。
1.2.7 目的 RNA 的 RT-PCR 和杂交效果的验证
1.2.7.1 目的 RNA 的反转录 按 poly（A）尾添加的
反应体系将所得 RNA 片段加上 poly（A）尾后采用
smart cDNA 合成方法合成目的 RNA 片段的 cDNA。
反 应 体 系 中 加 入 反 转 录 酶 1 μL， 引 物 SⅠ 2 μL，
引 物 SⅡ 2 μL，5×Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，RNA
30 μL，RNase-free ddH2O 加至 50 μL 各试剂，混匀，
42℃水浴 1 h。其中引物 S Ⅰ和 S Ⅱ的序列分别为 ：
5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACG-
GCCGGG-3 和 5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCG-
ACATG-d（T）30N-1N-3（N=A，G，C 或 T ；N-1=A，
G 或 C）。
1.2.7.2 产物 PCR 反应结束后，在离心管内加入
各反应液进行巢式 PCR。其中引物 S Ⅲ序列为 ：5-
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，第一次 PCR 反
应条件为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 15 s，68℃
退火延伸 6 min，进行 30 个循环 ；最后 72℃保温 10
min。第二次 PCR 时取第一次 PCR 反应产物 1 μL，
引物 1 和引物 2 分别为 ：5-GTATCAACGCAGAGT-3
和 5-CGAGGCGGCCGACATG-3， 反 应 条 件 与 第 一
次 PCR 相 同， 进 行 11 个 循 环。 取 5 μL PCR 产 物
与 5 μL Loading Buffer（ 含 0.2% GoldView） 混 匀 于
1% 的琼脂糖凝胶上电泳（101 V、70 mA）约 15-20
min，观察杂交结果。
1.2.7.3 消减效果的验证 为了验证两组样品已杂
交完全，以 U6 为内参。U6 是一种核内小 RNA，在
真核生物细胞普遍存在，因富含尿嘧啶（U）而得名。
它全长 106 nt，设计其 PCR 上（a）、下游（b）引物
分别为 ：5-GAGCGAAGCCGTCGTGTATA-3 和 5-T-
ATACCTTGCGAAGTGCTTA-3。 取 消 减 前（4 组 样
品）和消减后（4 组样品）的产物按下述程序配置
PCR 反应体系 ：10×PCR Buffer 10 μL ；引物 a 2 μL ；
引物 b 2 μL ；dNTP 10 μL ；Ex Taq 聚合酶 1 μL ；cDNA
30 μL ；ddH2O 加至 100 μL。PCR 反应条件为 ：94℃
预变性 5 min ；94℃变性 15 s，68℃退火延伸 6 min，
进 行 18、23、28、33 个 循 环 ；最 后 72 ℃ 保 温 10
min。反应后取 5 μL PCR 产物与 5 μL Loading Buffer
混匀于 1% 的琼脂糖凝胶上电泳（101 V、70 mA）
15-20 min。
1.2.8 T/A 克隆 按常规方法将纯化的 PCR 产物插
入 pUCm-T 载体，转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选，
挑取阳性克隆，提取质粒，PCR 扩增插入片段。
1.2.9 反向 cDNA 斑点杂交 纯化上述 PCR 产物，
经 NaOH 变性后分两个阵列平行点样于两张尼龙膜
上，每个点所占尼龙膜的面积为 0.5 cm×0.5 cm，在
每个点的中心位置上点加浓缩的 PCR 产物约 200
ng（1 μL）。经紫外交联固定于尼龙膜上。用 DIG-
11-dUTP 按试剂盒说明标记探针，探针为 tester 和
driver 的 cDNA。
然后经过预杂交、封闭、洗膜等步骤，把尼龙
膜分别和两种探针共孵育，再进行洗膜、封闭、洗膜，
滴加生物素标记鼠抗地高辛孵育后洗膜，经 DAB 暗
室显色至满意程度。挑选两张膜上显色有差异的点。
1.2.10 测序及同源性分析 挑取经验证的阳性克
隆，送 Invitrogen 公司测序。利用 Blastn 软件将所得
结果与 GenBank 中的收录核苷酸序列进行同源比较。
2 结果
2.1 RNA 分离效果的鉴定
RNA 试剂盒分离后的目标 RNA 样品经 10% 聚
丙烯酰胺凝胶电泳显示 SW480 和 SW620 的 Total RNA
经试剂盒提取分离后，目标 RNA 片段得到了有效地
2013年第2期 149王燕等 ：改良消减杂交技术用以筛选差异表达非编码小 RNA 的应用初探
浓缩和富集（图 1）。 异的克隆，部分结果见图 4。
M 1 2 3 4
100
bp
M ：RNA 分 子 质 量 Marker ；1 ：SW480 总 RNA ；2 ：SW620 总 RNA ；3 ：SW480
分离后的 RNA ；4 ：SW620 分离后的 RNA
图 1 经 10%PAGE 的 RNA 分离片段
M
100
bp
1 2 3 4 5 6 7 8
M ：DNA 分子质量 Marker ；1-4 ：消减后 U6 的 PCR 产物（分别为 18、23、
28 和 33 循环）；5-8：消减前 U6 的 PCR 产物（分别为 18、23、28 和 33 循环）
图 2 验证消减效果的琼脂糖凝胶电泳
2.3 杂交产物的扩增
杂交产物巢式 PCR 扩增中，第一次和第二次
PCR 均在 100 nt 左右显示特异性条带，且第二次
PCR 与第一次相比条带更窄，特异性较高，因此可
以确定杂交产物中含有目标 RNA 片段（图 3）。
2.4 反向cDNA斑点杂交结果
将阳性克隆的 PCR 产物平行点在两张带正电
的尼龙膜上，分别与地高辛标记的 tester 和 driver
cDNA 探针进行反向斑点杂交，试验重复 3 次，经
软件分析挑选灰度值相差 3 倍及以上的点定为有差
M 1 2
100
bp
M ：DNA 分子质量 Marker ；1 ：第一次 PCR 产物 ；2 ：第二次 PCR 产物
图 3 巢式 PCR 扩增杂交产物的琼脂糖凝胶电泳
1
A
A
B
C
D
E
F
G
H
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1
A
B
B
C
D
E
F
G
H
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
两张相同的尼龙膜分别与地高辛标记的 MCF7 细胞小 RNA cDNA，即 tester
（A）；HBL100 细胞小 RNA cDNA，即 driver（B）的探针杂交。以 U6（点
A1、A2）为阳性内对照，酵母 DNA（点 A3、A4）为阴性对照
图 4 反向斑点杂交部分结果
3 讨论
人类基因组中含有约 105 个基因，但并非在每
个细胞中都可以表达。基因表达具有选择性和时
空性，正因为如此，机体中各类细胞才会呈现出形
态和功能的差异。许多疾病的发生与发展都同细胞
内基因的异常表达密切相关。肿瘤细胞表型的改变
就是其中一个典型的例子。恶性肿瘤具有许多不同
于正常细胞的明显特征，如转移性、浸润性和表达
谱的改变等。其中癌细胞的转移主要涉及两种基因
2.2 杂交效果的验证
以 U6 为内参对杂交前后的产物进行不同循环的
PCR 扩增，电泳结果（图 2）显示，消减后的产物
经过 18、23 和 28 次循环扩增后在 100 nt 左右均未
显示明显的特异性条带，说明消减效果较好。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期150
的改变 ：转移基因和转移抑制基因［8］。因此，克
隆这些细胞中差异表达的基因成为了表型研究和
疾 病 治 疗 的 前 提。mRNA 差 异 显 示 技 术（mRNA
differential display，DD）［9］与代表性差异分析技术
（representional difference analysis，RAD）［10］ 在 差 异
表达 mRNA 的检测中已广泛运用，但是都还存在缺
点 ：DD 技术测得的结果假阳性率高，而 RAD 技术
的操作繁琐。在此基础上建立的抑制性消减杂交技
术（suppression subtractive hybridization，SSH）［7］克
服了 DD 和 RAD 技术的缺点而得到普遍运用。本试
验以乳腺癌细胞 MCF7 与其对照细胞 HBL100 为材
料，通过消减杂交和 PCR 技术找到了两类细胞差异
表达的非编码小 RNA，为癌细胞转化机制的研究提
供了试验依据。试验中结合了 Promega 公司的 RNA
分离技术，不仅收集到了特异性片段、达到了浓
缩和富集的效果而且简化了试验操作 ；利用 Biotin-
oligo（dT）和生物素 - 磁珠亲和技术，直接在结合
了磁珠的 oligo（dT）上进行 RT 制备 cDNA 探针与
提取的 RNA 杂交，省去了传统消减杂交技术中制备
双链 cDNA 再同探针杂交的操作，在取得相同效果
的基础上再次简化了试验步骤 ；在扩增杂交产物时
采取巢式 PCR 技术，几乎或完全消除了引物配对特
异性不强造成的非特异性扩增污染，提高了产物的
特异性，是一种改良的消减杂交技术。此外，试验
中制备的 cDNA 探针在与 RNA 杂交后可以回收利用，
只要将结合有 RNA 的磁珠用蒸馏水洗涤 3-4 次除去
RNA 即得到单链 cDNA。可以利用这种探针进行相
关的检测。
4 结论
利用这种改良的消减杂交技术，成功地分离到
一批在 MCF 和 HBL100 细胞中差异表达的非编码小
RNA，较之传统的抑制消减杂交技术更快速、操作
更简便，因此试验中建立的这种方法可以应用于不
同组织、细胞中差异表达非编码小 RNA 的分离与
鉴定。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）