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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):230-235
Toll 样受体家族（Toll-like receptors，TLRs）是
先天免疫系统中最古老、最保守的一类模式识别受
体家族，可以识别绝大部分的病原相关分子模式
（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），对
于先天免疫的激活和获得性免疫的启动扮演着极为
重要的角色［1］。研究者已经确认从无脊椎后口动
物［2］、海洋动物［3，4］到鸟类［5］，以及哺乳动物小
鼠［6］和人类［7］都具有 TLRs，并已开展了积极的免
收稿日期 ：2015-01-23
基金项目 ：沈阳师范大学博士启动基金项目（054-55440107029），沈阳师范大学生态与环境研究中心主任基金项目（EERC-Y-201404）
作者简介 ：王泽，女，博士，研究方向 ：发育免疫学 ；E-mail ：synu.wangze@aliyun.com
通讯作者 ：陆宇燕，女，研究方向 ：细胞毒理学 ；E-mail ：185570795@qq.com
东北林蛙发育早期 TLR2 的表达及免疫应答特征
王泽1 赫天一2 陆宇燕1
（1. 沈阳师范大学化学与生命科学学院，沈阳 110034 ；2. 沈阳医学院附属中心医院中心实验室，沈阳 110024）
摘 要 ： 旨在研究东北林蛙发育早期 TLR2 的表达特征及其针对不同 PAMPs 的免疫应答特征。免疫组化染色及 RT-PCR 对
11 期至 42 期东北林蛙 TLR2 进行定位和定量检测 ；29 期蝌蚪 0.5 μg/mL 的 LTA，LPS，ZymoA，Poly I∶C 急性腹腔注射，RT-PCR
检测 24 h 内 TLR2 mRNA 相对表达量变化。结果显示，TLR2 在东北林蛙发育早期的组织中分布广泛，11 期 TLR2 mRNA 相对表达
量 0.187±0.021，25 期升至 0.373±0.031 后，42 期降至 0.170±0.020。24 h 内未检测到 LPS 组和 Zymo A 组 TLR2 mRNA 相对表达
量显著性变化（P>0.05），LTA 组在 4 h 与 12 h 出现两次极显著性升高（P<0.01）；PolyI∶C 组于 8 h 至峰值（P<0.01）。东北林蛙
发育早期 TLR2 的时空表达特征与其发育阶段的生境变化相适应，29 期东北林蛙的 TLR2 对 4 种 PAMPs 识别和应答兼具了鱼类和
哺乳动物的特征，体现了免疫系统在进化上的演变。
关键词 ： 东北林蛙 ；Toll 样受体 2 ；免疫应答 ；病原相关分子模式
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.001
The Expression and Immune Response Characteristics of TLR2 at the
Early Development Stage of Rana chensinensis
Wang Ze He Tianyi Lu Yuyan
（College of Chemistry and Life Science，Shenyang Normal University，Shenyang 110034 ；Central Hospital Affiliated To Shenyang Medical
College，Shenyang 110024）
Abstract: It was to study the expression and immune response characteristics of TLR2 at the early development stage of Rana
chensinensis. Immunohistochemistry and RT-PCR were used to locate and quantify the TLR2 mRNA from stage 11 to stage 42 of Rana
chensinensis. Tadpoles at stage 29 were injected with antigen LTA, LPS, ZymoA and Poly I∶C intraperitoneally. The expression changes of
TLR2 mRNA were detected by RT-PCR within 24 h. TLR2 is widely distributed at the early development stage of Rana chensinensis. The
relative expression of TLR2 mRNA increased form 0.187±0.021 to 0.373±0.031 at stage 25, and then returned to 0.170±0.020 progressively.
The expression of TLR2 mRNA had no significant change in the LPS group and the Zymo A group（P>0.05）. TLR2 mRNA of the LTE group
peaked twice at 4 h 与 12 h after antigen injection（P<0.01）；and the PolyI ：C group peaked at 8 h（P<0.01）. The expression character of
TLR2 matches with its living environment at the early development stage of Rana chensinensis.TLR2 did not responses to the challenge of LPS
and ZymoA timely at the stage 29, on the other hand, TLR2 recognized and responsed to LTA and PolyI∶C group effectively. TLR2 of Rana
chensinensis possesses the recognition and response characteristics to PAMPs both of fish and mammals.
Key words: Rana chensinensis ；TLR2 ；immune response ；pathogen-associated molecular patterns
2015,31(10) 231王泽等：东北林蛙发育早期 TLR2 的表达及免疫应答特征
疫学研究。2007 年，Ishii 等［8］完成了无尾两栖类
非洲爪蟾 TLRs 的测序工作，发现 TLR mRNA 在蝌
蚪和成体时期的所有组织中普遍表达 ；2012 年吴立
舒证实东北林蛙皮肤组织中 TLR1、2、4、5、6、8
参与了抗虹彩病毒感染的免疫应答，其中 TLR1 和
TLR8 可能具有特异识别虹彩病毒的功能［9］，目前
为止，关于无尾两栖类个体发育过程中 TLRs 的表
达特征及免疫应答机制的研究尚无突破性进展。
东 北 林 蛙（Rana chensinensis）， 别 名 哈 士 蟆，
无尾两栖类的模式动物之一，具有重要的经济和科
学研究价值 ；纵观东北林蛙的生活史不难发现，其
发育早期所依存的水环境微生物复杂，相对于成体
的陆生生活，机体面临的生存挑战更为严峻 ；该阶
段机体的先天免疫防御系统能够快速而有效的识别
和清除病原微生物，对于蝌蚪顺利的完成个体发
育过程极尤为重要。因此，我们拟以 TLRs 中表达
范围最广，识别病原微生物种类最多的成员——
Toll 样 受 体 2（Toll-like receptors 2，TLR2） 为 切 入
点，选用发育早期的东北林蛙作为研究对象，采
用 脂 多 糖（Lipopolysaccharides，LPS）， 脂 磷 壁 酸
（Lipteichoic acid，LTA）， 酵 母 多 糖 A（Zymosan A
from Saccharomyces cerevisiae，ZymoA），聚肌胞苷酸
（Polyinosinic-polycytidylic，Poly I∶C）分别模拟革兰
氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母菌和病毒的急
性感染，首次对两栖类东北林蛙发育早期 TLR2 的
表达特征及针对不同 PAMPs 的免疫应答特征进行描
述，对于全面了解 TLRS 免疫应答机制的演化过程
具有积极的科研意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 东北林蛙受精卵，购自于本溪天
泽林蛙养殖服务中心 ；实验室曝气 1 d、18-25℃的
自来水培养，350 只 / 箱，烘干熟蛋黄及新鲜菜叶
喂食。
1.1.2 主要试剂 LPS（鼎国），PolyI∶C（Sigma），
zymosan A（Sigma），LTA（Sigma），I 型胶原兔抗人
TLR2 单克隆抗体及 SABC 即用型免疫组织化学试剂
盒（过氧化物酶，武汉博士德生物工程有限公司），
总 RNA 提 取 试 剂 盒 及 TIANScript RT Kit（ 天 根 ），
Phusion® High-Fidelity PCR Master Mixwith HF Buffer
（NEB），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 取材 参考王寿兵［10］的分期标准并结合东
北林蛙的发育特征，选择 11 期（侧唇期）、17 期（尾
芽期）、19 期（心跳期）、21 期（脱膜期）、23 期（鳃
盖褶期）、25 期（两侧鳃盖完成期）、27 期（圆盾形
肢芽期）、29 期（侧指状肢芽期）、37 期（第 1、2
趾分离期）和 42 期（前肢伸出期）10 个发育时期
进行取材 ；每个时期取材 10 次，15 个样本 / 次 ；5
批次中性多聚甲醛固定，4℃储存 ；5 批次 RNase-
free 冻存管保存，-80℃存储。
1.2.2 抗 原 刺 激 设 对 照 组，LTA 组，LPS 组，
ZymoA 组和 Poly I∶C 组，无菌任氏液调整抗原浓度
为 0.5 μg/mL，发育至 29 期蝌蚪抗原急性腹腔注射，
2 μL/ 只；注射后 2、4、8、12 和 24 h 取材 3 次，10 只 /
次 ；对照组注射同等剂量无菌任氏液。
1.2.3 免疫组织化学检测 常规石蜡包埋，5 μm 切
片，脱蜡至水，pH6.0 枸橼酸缓冲溶液抗原修复 ；
正常山羊血清封闭，一抗 1∶200 稀释后，4℃孵育
过夜，对照组采用 PBS 代替对照，1∶200 稀释的羊
抗兔 IgG 抗血清室温孵育 45 min ；滴加 ABC 试剂，
DAB 显色 5 min；苏木精复染，常规脱水透明，封固。
显微镜观察并采集图像。
1.2.4 半 定 量 PCR 检 测 试 剂 盒 法 提 取 蝌 蚪 总
RNA， 参 照 TIANScript RT Kit 步 骤 反 转 录 得 到
cDNA，GAPDH 作为内参，RT-PCR 扩增 TLR2，引
物 序 列 分 别 为 ：TLR2-F ：CGCCAATGAAACTGTG-
CTT ；TLR2-R ：CGTACTTACACCATTCGCTTCT ；
GAPDH -F ：AGCAAAGGCTGTTGGGAAAGT ；
GAPDH-R：TCAAAGATGGAGGAATGAGTG。反转录：
70℃ 5 min，42℃ 50 min，95℃ 5 min。PCR 扩增体
系 ：95℃ 5 min ；95℃ 10 s ；49℃ 20 s ；72℃ 30 s ；4℃
5 min，50 个循环 ；退火温度 ：TLR2 49℃，GAPDH
55℃。琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，凝胶图像分
析系统（HerolabE.A.S.YWin32，德国）观察结果。
1.2.5 数据统计 采用 SPSS16.0 及 R 软件对数据进
行方差齐性检验（F>0.05），单因素方差分析，数据
以 x
-
±s 表示，其中 0.01
P<0.01 存在极显著性差异。
2 结果
2.1 东北林蛙发育早期TLR2的定位分析
每张切片随机取 10 个非重叠视野（l00×）进
行结果判定，PBS 对照组确定 TLR2 阴性结果 ；DAB
棕色显色为阳性结果，苏木精复染为蓝紫色。TLR2
最早在 19 期的心脏细胞检测到阳性结果（图 1），
21 期检测到肾脏和肝脏细胞的阳性表达（图 2），
TLR2 在消化道主要分布在粘膜层和小肠绒毛，细胞
质和细胞膜表达水平较高，细胞核存在低表达状况。
外鳃为细胞质表达，至 24 期内鳃出现细胞核和细胞
质双重表达的特征 ；软骨、胰腺、肌肉等均检测到
较弱的细胞质表达。
5 μm
A B
C D
A，B ：对照组 ；C ：19 期心脏 ；D ：27 期心脏
图 1 东北林蛙发育早期心脏 TLR2 的免疫组织染色结果
（400×）
5 μm
A B C D
E F G H
I J K L
M N O P
A-D，I-L ：对照组 ；E ：24 期外鳃 ；F ：29 期内鳃 ；G ：21 期肾脏 ；H ：29 期肾脏 ；M ：26 期肠 ；N ：28 期肠 ；O ：21 期肝脏 ；P ：28 期肝脏
图 2 东北林蛙发育早期 TLR2 的免疫组织染色结果（400×）
2015,31(10) 233王泽等：东北林蛙发育早期 TLR2 的表达及免疫应答特征
2.2 东北林蛙发育早期TLR2 mRNA的半定量分析
11 期 东 北 林 蛙 TLR2 mRNA 相 对 表 达 量
0.187±0.021， 随 着 胚 胎 的 发 育 逐 渐 上 升，25 期
至 峰 值 0.373±0.031 后 逐 渐 下 降，42 期 降 低 到
0.170±0.020。相对 11 期，17 期至 25 期表达量增
加极显著（P<0.01）；TLR2 mRNA 相对表达量下调
过程中，29-42 期下降明显与 25 期具极显著性差异
（P<0.01）（图 3，图 4）。
2.3 东北林蛙发育早期TLR2针对不同PAMPs的应
答特征
抗原注射后，LPS 组与 Zymo A 组 TLR2 mRNA
相对表达量出现小幅的上升，但与对照组无显著
性 差 异（P>0.05）；LTA 组 TLR2 mRNA 相 对 表 达
量均高于对照组，于 4 h 与 12 h 出现两次显著性升
高（P<0.01），分别为 0.215±0.170 和 0.191±0.242。
PolyI∶C 组 TLR2 的相对表达量逐渐增加，8 h 至峰
值 0.197±0.0058，具极显著性差异（P<0.01）（图 5，
图 6）。对照组 TLR2 相对表达量未出现显著性变化
（P>0.05）。
3 讨论
哺 乳 动 物 的 TLR2 分 布 广 泛， 主 要 表 达 于 树
突状细胞、单核细胞、巨噬细胞及中性粒细胞等
一线防御相关细胞，上皮细胞及肿瘤细胞也有表
达［11］。本实验结果显示 TLR2 在东北林蛙发育早期
各脏器具有广泛的分布，同时 RT-PCR 检测到 11 期
至 42 期的东北林蛙蝌蚪 TLR2 mRNA 的表达量随发
育时期呈现波动变化特征。Ishii 等［8］也证实 TLRs
mRNA 在非洲爪蟾的蝌蚪和成体时期的所有组织中
存在着差异性表达。从东北林蛙个体发育角度来看，
脱模前后的蝌蚪获得性免疫不健全，机体需直接暴
露于微生物复杂的水环境中，TLR2 作为先天免疫中
一种重要的防御蛋白，其表达量的持续性升高应该
是机体一种积极的保护性调节 ；至 25 期鳃盖闭合，
TLR2 mRNA 表达量至峰值，此时机体体液免疫已经
初具规模，肝脏内具有成熟的 B 细胞，体液中可检
测出分泌型抗体 ；直至 42 期变态发育将近完成，此
时的获得性免疫功能已趋于完善［12］，TLR2 mRNA
的表达水平也基本稳定。东北林蛙发育早期 TLR2
表达的时空特征与东北林蛙的生境变化和发育阶段
相适应，对于东北林蛙胚胎时期应对水环境中各种
抗原的挑战有着积极的作用。
有 关 南 亚 野 鲮 TLR2 的 研 究 发 现，Zymosan，
PGN 和 LTA 均可以诱导 TLR2 表达量的升高［13］；
LPS，Polyl∶C 会引起斜带石斑鱼 TLR2 表达水平显
著上调［14］。但革兰氏阴性细菌感染蓝鲶鱼初期可
检测到 TLR2 表达量出现明显的降低［15］，说明鱼类
TLR2 具有广泛的 PAMPs 识别谱系。革兰氏阳性菌
M 11 17 19 21 23 25 27 29 37 42
M
501
bp
404
353
242
190
147
110
89
11 17 19 21 23 25 27 29 37 42
501
bp
404
353
242
190
147
110
89
A
B
图 3 东北林蛙发育早期 GAPDH（A）和 TLR（B）
电泳图
0.1
TL
R
2
m
R
N
A
ሩ㺘䗮䟿
0.0
**
** **
**
** **
**
11 17 19 21 23 25 27 29 37 42ਁ㛢ᰦᵏ0.2
0.3
0.4
0.5
*表示与 11 期呈显著性差异（0.01
图 4 东北林蛙发育早期 TLR2 mRNA 相对表达量变化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10234
也是哺乳动物 TLR2 的主要配体，介导 LTA 诱发的
多种炎症反应［16］。本实验中 LTA 组在 24 h 内皆检
测到 TLR2 mRNA 表达量的上升，并出现两次极显
著性升高，启动最迅速，上调幅度最大，应答时程
最长，说明东北林蛙发育早期 TLR2 可以识别并应
答革兰氏阳性细菌的刺激，与鱼类和哺乳动物具有
极大的相似性，从一定角度上反应了 TLR2 信号转
导的保守性。人工合成的双链 RNA 类似物 PolyI∶C
可以作为诱导剂模拟病毒感染，研究已经证实哺乳
动物 TLR2 无法识别病毒的 dsRNA，TLR3 是哺乳动
物识别病毒双链 RNA 及其类似物 PolyI∶C 的主要
受体 ；但是彩虹病毒可以诱导东北林蛙皮肤 TLR2
在感染后 12 h 后出现上调［9］。本实验中 PolyI∶C 组
TLR2 表达量缓慢增加至 8 h 达到峰值，应答幅度及
速度仅次于 LTA 组。因此，无尾两栖类的 TLR2 可
能具有比哺乳动物更为广泛的配体识别和防御功能，
29 期东北林蛙蝌蚪 TLR2 对于哺乳类动物 TLR2 不
识别的病毒 dsRNA 产生了积极的应答，更倾向于鱼
类 TLR2 的应答特征。研究已经证明非洲爪蟾 TLRs
由哺乳动物和鱼类两种类型的 TLRs 共同组成［8］，
TLR2 这种功能上的差异很可能是与其结构演变相匹
配，以适应水陆两栖的过渡性生活环境。
哺乳动物的 TLR2 可识别 LPS 并产生炎性因子，
但 TLR2 并不是决定革兰氏阴性菌感染的必须受体，
而是作为“二级受体”加强炎症反应的进程［17］，
TLR2 敲 除 小 鼠 对 伤 寒 菌 感 染 相 对 耐 受， 炎 症 较
弱，而 TLR9 敲除小鼠则表现出极度敏感［18］，说明
TLR2 在控制感染和活化免疫系统中的冗余。本实验
中 LPS 的刺激并未引起蝌蚪 TLR2 mRNA 的显著性
501
M ሩ➗ 2h
A B C D
A B C D
4h 2h 4h8h 12h 24h
M ሩ➗ 2h 4h 2h 4h8h 12h 24h
bp
404
353
242
190
147
110
89
501
bp
404
353
242
190
147
110
89
501
M
GAPDH
TLR2
2h 4h8h 12h 24h 2h 4h8h 12h 24h 8h 12h 24h
2h 4h8h 12h 24h 2h 4h8h 12h 24h 8h 12h 24hM
bp
404
353
242
190
147
110
89
501
bp
404
353
242
190
147
110
89
A ：LPS 组 ；B ：Zymo A 组 ；C ：PolyI∶C 组 ；D ：LTA 组
图 5 各实验组 TLR2 和 GAPDH 电泳图
0.00
0 2 4 8ᣇࡪ◰ਾᰦ䰤h 12 240.050.10
0.15
*
**
** **
*
TL
R
2
m
R
N
A
ሩ㺘䗮䟿 0.20 LPSLTAPolyIĩCZymdA0.25
*表示与对照组呈显著性差异（0.01
图 6 各实验组 TLR2 mRNA 相对表达量变化
2015,31(10) 235王泽等：东北林蛙发育早期 TLR2 的表达及免疫应答特征
变化，我们推测无尾两栖类的 TLR2 可能作为辅助
受体对革兰氏阴性菌进行识别，其激活需要较长的
应答时间。而 ZymoA 作为一种最古老的真菌细胞壁
成分，哺乳动物的 TLR2 与 TLR6 以异源二聚体的
形式对其进行识别与应答，可引起腹膜炎模型小鼠
白细胞 NF-κB 的磷酸化，控制炎症反应的过程［19］；
大鼠小神经胶质细胞上表达的 TLR2 可以在其配体
ZymoA 的刺激下，引起细胞中 IL-1β 的释放［20］；本
实验中 TLR2 在 ZymoA 刺激后 24 h 内表达量未检测
到显著性变化（P>0.05），无尾两栖动物 TLR2 是否
识别并应答 ZymoA 的刺激还有待深入研究。
4 结论
29 期东北林蛙 TLR2 对 LPS 和 ZymoA 未产生积
极应答，对 LTA 和 PolyI∶C 进行了有效的识别和应
答，说明无尾两栖类的 TLR2 已经逐渐失去了鱼类
TLR2 广泛的 PAMPs 配体识别谱系 ；其针对微生物
的防御兼具了鱼类和哺乳动物两者的应答特征，在
一定程度上体现了免疫系统在进化上的过渡特征。
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（责任编辑 李楠）