全 文 ：·综述与专论· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-06-23
基金项目 ： 河北省自然科学基金（C2011205045）, 河北省留学回国人员资助项目（20100705）, 河北省科技支撑项目（10205521D）, 河北
师范大学博士启动基金项目（L2009B13）
作者简介 : 何广正 , 男 , 硕士研究生，研究方向 ：分子细菌学 ; E-mail: heguangzheng666@163.com
通讯作者 : 鞠建松 , 男 , 博士，副教授，研究方向 ：微生物酶学及其分子进化 ; E-mail: jujiansong@126.com
丙氨酸脱氢酶研究概况 *
何广正 徐书景 马宁 刘东 鞠建松
（河北师范大学生命科学学院，石家庄 050016）
摘 要 ： 丙氨酸脱氢酶（alanine dehydrogenase, ALD, EC 1.4.1.1）是一种以烟酰胺腺嘌呤（NAD）为辅酶的氨基酸脱氢酶。
丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸、氨及 NADH。丙氨酸脱氢酶也是调节氨基酸代谢和糖代谢的重要酶类，其催
化反应的产物丙酮酸广泛应用于医药、农药和食品等领域 , 具有良好的发展前景。主要介绍丙氨酸脱氢酶的纯化及活力检测、酶
空间结构（底物结合位点），以及催化反应机理等方面的研究。
关键词 ： 丙氨酸脱氢酶 催化机理 丙酮酸 烟酰胺腺嘌呤 脱氢酶
Research Summary of Alanine Dehydrogenase
He Guangzheng Xu Shujing Ma Ning Liu Dong Ju Jiansong
（College of Life Science, Hebei Normal Universitys, Shijiazhuang 050016）
Abstract ： Alanine dehydrogenase (ALD, EC 1.4.1.1) is an amino acid dehydrogenase that is a NAD-dependent enzyme. It catalyzes
a reversible oxidative deamination of L-alanine to pyruvate and ammonia, with NADH as cofactor. It is a key enzyme in regulating amino acid
metabolism and glucose metabolism, pyruvate, a promising reaction product, is widely utilized in medicine, pesticides, food and other fields. The
recent data about this enzyme was summarized, including its purification and activity detection, enzyme structure, and catalytic mechanism.
Key words ： Alanine dehydrogenase Catalytic mechanism Pyruvate Nicotinamide adenine dinucleotide（NAD） Dehydrogenase
丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨生成丙
酮酸，同时还原 NAD+ 生成 NADH，它可以受琥珀酸、
苹果酸、α- 酮戊二酸和丙酮酸等的诱导产生，同时
丙氨酸脱氢酶调节酮酸和氨基酸的稳态平衡［1,2］，在
氨基酸和酮酸合成中至关重要。丙氨酸脱氢酶也是
与氨基酸代谢和糖代谢有关的酶［3,4］，它在调节糖代
谢和氨基酸代谢中也起重要作用。产物丙酮酸在医
药工业中常被用于合成消炎镇痛药辛可芬、抗结核
药异烟肼丙酮酸钙、驱虫药恩波吡维胺以及抗病毒
剂氮杂喹喔啉等，也可作为饲料和食品添加剂，具
有很好的防腐保鲜功能，还可作为生物技术诊断试
剂、检定脂肪的显色剂和减肥保健品［5］等。
丙氨酸脱氢酶自 1955 年被鉴定以来，至今已
有许多关于丙氨酸脱氢酶的研究报道，特别是近年
来通过晶体结构解析酶蛋白空间结构，为深入阐述
丙氨酸脱氢酶的催化机理提供了更为有利的条件 ；
同时也为根据反应底物酮酸合理开发新的抗病毒类
药物和生物制品提供理论基础。
1 丙氨酸脱氢酶的来源
丙氨酸脱氢酶分布广泛，在细菌、植物和真核
藻类都有发现，并在微生物的碳氮代谢中起关键作
用，包括在孢子形成过程中以 L-ala 为主要能源，通
过三羧酸循环提供能量［6-8］，同时还参与固氮作用（氨
同化）保证生物体氮源充足［9,10］。在动物体内也存
在丙氨酸脱氢酶，其主要作用是平衡机体内的糖代
谢和氨基酸代谢，尤其是机体在极端条件下，该酶
催化产生大量的丙酮酸，为机体提供能量。
丙氨酸脱氢酶早在 1955 年就已被鉴定，但直
到 1990 年该酶的编码基因才被克隆［11］。目前已经
从超嗜热古菌 Archaeoglobus fulgidus［12］，细长聚球
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期28
藻 Synechococcus elongatus PCC 7942［9］ 以 及 纳 豆 菌
Bacillus subtilis［13］ 等多个生物体内发现了丙氨酸脱
氢酶的存在。此外，1993 年，Siranosian 等［7］研究
发现丙氨酸脱氢酶参与 Bacillus subtilis 的孢子形成 ；
1999 年，Galkin 和 Kulakova［14］对来自两株极地菌
中的丙氨酸脱氢酶进行酶学特性研究时发现 Arg 所
构成的盐桥决定了该蛋白酶的热稳定性。1998 年，
Patrick 等［8］第一次解析了来自于席藻（Phormidium
lapideum） 中 丙 氨 酸 脱 氢 酶 的 空 间 结 构， 随 后
Tripathi 等［15］解析了 Mycobacterium tuberculosis 中丙
氨酸脱氢酶的空间结构，为深入阐述丙氨酸脱氢酶
的催化机理提供了更为便利的条件。表 1 显示了几
种不同来源的丙氨酸脱氢酶的基本信息。
表 1 不同来源的丙氨酸脱氢酶基本性质比较
2 酶蛋白的纯化及活力测定
丙氨酸脱氢酶的纯化方法主要有硫酸铵分级沉
淀、DEAE- 纤维素离子交换柱层析、亲和镍柱层析
及分子筛柱层析等方法，通过以上两个或两个以上
方法联用足以纯化获得较均一的酶蛋白。酶活力的
测定一般是通过反应底物的减少或增加来衡量酶活
力的强弱。一般测定的是产物增加的量，即丙酮酸
的增加量，下面简要介绍几种测定方法。
2.1 紫外分光光度法
该 方 法 是 通 过 检 测 反 应 产 物 丙 酮 酸 的 生 成
量来计算酶活力，是根据丙酮酸在紫外吸收光谱
290-340 nm 区有较强的光吸收而建立的紫外分光光
度法［19］。在 pH11.0 的水溶液中，320 nm 波长下，
只有丙酮酸有吸收，而其他有机酸和杂质无吸收或
吸收不明显，这避免了其他酸类的影响（pH 大于 7.0
后丙酮酸的吸光值基本恒定）。还可以根据反应过程
中 NADH 的增加量测定酶活，因为 NADH 在 340 nm
下有吸收峰。该方法操作简便，应用广泛，常用于
酶活测定，但准确性不高，数值波动较大。
2.2 相对滴定法
相对滴定是将不同被测物的溶液滴到相同的状
态时所消耗滴定剂的体积与被测物含量成正比为定
量基础的滴定分析方法。将其应用于极弱酸碱的滴
定，无需确定化学计量点，能消除经典滴定法中由
于化学计量点和滴定终点不重合带来的终点误差。
此法是在一定条件下对乳酸和丙酮酸进行滴定，绘
制滴定曲线和标准曲线，利用滴定剂氢氧化钠的体
积（浓度）与被测物丙酮酸含量成比例的关系即可
求得混合弱酸体系中丙酮酸的含量［20］。相对滴定法
原理简单，但是操作比较繁琐，精确度不够，又因
其是通过换算得出来的结果，所以也不能用于精密
的分析，仅可作为一个参考值。
2.3 高效液相色谱法
HPLC 主要是通过丙酮酸的紫外吸光波长进行
测量，样品通过 HPLC 柱时不同物质的流出时间和
保留时间不同，样品含量不同在色谱图上的峰值也
不相同，根据丙酮酸在色谱图上的峰面积计算出丙
酮酸的含量［21，22］。HPLC 操作简单方便，能灵敏地
检测到样品中的丙酮酸量，常用于试验分析 ；此方
法的不足之处是对仪器设备要求高，成本投入较大。
2.4 颜色反应
此法是基于在 L-丙氨酸脱氨反应中除加辅酶
NAD+ 外，还加入 phenazine methosulfate（吩嗪硫酸
甲酯）和 nitroblue tetrazolium（氮蓝四唑，硝基四
氮唑），整个反应中添加这两种物质后，在 37℃下
作用 10 min，得到的反应液呈紫色，在 595 nm 处
丙氨酸脱氢酶 长度 ( bp) 氨基酸残基 分子量 .(kD) 低聚合反应 活性位点 最适值 ( pH) 抑制剂
MtbAld[15] 1119 373 40 hexa/trimer H96,D260, R15,K75 — —
PlaAld[8] 1083 361 40 hexamer R15,K74,H95 — —
EaeAld[16] 1131 377 40 hexamer K74 8.7/10.9 Cu2+ Hg2+
MpsAld[17] — — 53 tetramer — 9.0 Hgcl2
SfrAld[18] — — 51 tetramer — 8.5/10 Hgcl2
2011年第12期 29何广正等 ：丙氨酸脱氢酶研究概况
有吸光值［19］。此方法的特点是反应简单，颜色反
应效果明显易观察。另外，基于此原理，通过非变
性电泳进行活性染色能够较为方便地鉴定酶蛋白的
活性功能［19］。
3 丙氨酸脱氢酶的空间结构
丙氨酸脱氢酶存在四聚体、六聚体和八聚体 3
种结构，不同来源的丙氨酸脱氢酶结构有所不同。来
自P. lapdeum［8］，M. tuberculosis［15］和E. aerogenes［16］ 的
丙氨酸脱氢酶表现为六聚体，亚基大小约为 40 kD ；
来自 Soybean nodule bacteroids ［16,23］，Methylotropic
pseudomonas sp［17］ 和 Streptomyces fradiae［18］ 则 为 四
聚体，其亚基约为 43-51 kD ；而来自 Streptomyces
aureofacies［16］的丙氨酸脱氢酶比较特殊，由 8 个亚
基构成，其亚基大小约为 48 kD。下面主要以自然
界存在最多的六聚体丙氨酸脱氢酶为代表加以介绍。
3.1 亚基结构
来自 P. lapdeum 的 L-丙氨酸脱氢酶中有 6 个亚
基［8］，每个亚基由两个折叠紧密的结构域构成，同
一个亚基上的两个结构域具有一定的相似性，两个
结构域之间由裂沟隔开，仅以 α 螺旋相连接。两个
结构域分别被命名为 domain Ⅰ和 domain Ⅱ，每一
个结构域也可以看成是由两个相似的超二级结构组
合成的，这个超二级结构是由 β 折叠和 α 螺旋组成，
在 β 折叠的周围由 α 螺旋围绕包裹成桶状结构，两
个相似的超二级结构（桶状结构）组合成一个结构
域［8］。每个结构域包括了 13 个 α 螺旋、15 个 β 折
叠和 8 个延伸的肽链，相互间通过氢键连接，脱氢
酶活性位点可能位于两个结构域之间的裂缝连接处，
即可能位于两个 domain 之间的裂沟内部（图 1-a，
图 1-b）。
3.2 空间结构
P. lapdeum 中丙氨酸脱氢酶的 6 个亚基紧密地
聚合在一起形成一个六聚体蛋白，可以看成是二聚
体形成的三聚物（图 1-b），它含有 32 个对称轴，外
貌近似一个圆的外形。另外，与对称有关的分子位
于 domain 的外表面（远离亚基的中心和亚基间的裂
沟），且这些分子和亚基表面的一些其他分子相互作
用。亚基表面上堆叠着一些具有溶解能力的分子，
这些具有溶解能力的分子使亚基表面具有了亲水和
疏水性质。六聚体蛋白的 3 个界面中有两个是亲水
区，一个是疏水区，疏水区和亲水区相互间隔。其
中一个亲水区是由分子外表面的 Glu225 和 Ser221，
以及邻近亚基上的 Arg24 和 Glu28 组成；而另一个
亲水区则由 Glu207 与邻近亚基上的 Lys184、Glu161
和 Arg138 组成。
空间对称关联到二聚体亚基表面以及 domain Ⅱ
中折叠结构的 N-末端 163-167 位残基所形成的氢
键和环状结构。界面内部明显的亲水特性关系到
Lys166、Lys169、Gln192、Gln194、Glu215、Glu223
及 Glu230 的相互作用。
3.3 丙酮酸的结合位点
丙酮酸的结合位点位于两个结构域之间的沟缝
内，丙酮酸与沟缝内 Arg15 的羧基基团相互作用使
丙酮酸和脱氢酶的结合更紧密，Lys75 与丙酮酸的
羰基和羧基上的氧结合，而 His96 和羰基氧形成氢
键，与丙酮酸相互作用的还有水分子 Wat53 和活性
位 点 Asp260，Asp260 使 丙 酮 酸 和 NAD 的（ 烟 碱
环）距离更近结合更充分。其中水分子 Wat53 还与
His96 和 Glu76 存在相互作用，促进催化反应的进
行（图 2）［15］。
3.4 NAD+的结合位点
NAD+ 主 要 与 domain Ⅱ 的 C-末 端 结 合［3］。 酶
促反应过程中 238-247 位氨基酸所形成的环状结构
发生轻微的改变使 NAD 结合更充分有效，NAD 的
腺嘌呤环固定在酶的疏水区域内，与 NAD 结合有
关的氨基酸残基分别是 Met301、Asn300、Asp260、
Ile267、Val239、 Ser134、Thr178、Ala179、Ala 240、
Asp198、Gly177 和 Lys203［15］（图 2）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期30
使得底物和酶紧密结合形成复合物。酶和底物所形
成的复合物与催化有关的 His96 的距离拉近，这样
便可以顺利的进行脱氢酶的催化反应。Asp260 是丙
氨酸脱氢酶中的必不可少的羧酸氨基酸，Asp260 和
Glu118 都处于丙氨酸脱氢酶氨基酸序列的保守序列
里。
丙酮酸 si-面和酶的 Tyr94 紧密结合，re-面和烟
碱结合，铵分子从烟碱方向 re- 面攻击丙酮酸给丙酮
酸提供一个氨基，底物和酶之间在反应过程中会捕
获一个水分子并作为羟基的受体［25］。反应中铵与丙
酮酸先形成亚胺丙酮酸，由 NADH 提供的 H+ 与亚
胺丙酮酸的 Cα 结合。这样就形成了丙氨酸，同时也
生成了一个水分子和 NAD+（图 3-b）。
5 小结
丙氨酸脱氢酶可以将丙氨酸分解成为丙酮酸和
氨以及具有还原性的 NADH（或 NADPH），因此，
它在细胞的碳代谢、氮代谢和能量代谢等多方面发
挥着重要作用。丙氨酸在已知的蛋白中广泛存在，
而且还是细胞壁肽聚糖骨架中的重要成分，所以丙
氨酸脱氢酶在细胞质的蛋白质以及细胞壁生物合成
中具有重要作用。丙氨酸脱氢酶能通过氨同化作用
降低氨浓度（如根瘤菌固氮），通过调控细胞内的氮
代谢间接地调节抗生素的生物合成 ；同时丙氨酸脱
氢酶也为细菌代谢提供所需的碳源 ；丙氨酸脱氢酶
4 丙氨酸脱氢酶的催化机理
丙氨酸脱氢酶是双向反应酶，催化反应方程
式，如图 3-a 所示，通常正向反应是氧化脱氨反应 ：
丙氨酸作为反应底物生成丙酮酸、NADH，并释放
NH3。 逆反应则是氨化反应：由丙酮酸转换为丙氨酸，
消耗一分子铵和 NADH［8］。
4.1 正反应——氧化脱氨
底物 L-ala 与丙氨酸脱氢酶的活性位点 Lys75
和 Arg15 结合［15］。L-ala 与 NAD+ 接触发生反应，上
述反应是丙氨酸的 Cα 脱氢，NAD+ 接受 Cα 脱的氢
离子，形成一个含有 -NH2+ 的丙酮酸（亚胺丙酮酸
iminopyruvate ii）和 NADH，NH2+ 和丙氨酸的 Cα 形
成化学键使亚胺丙酮酸带一分子正电荷。一个水分
子进入脱氢酶的活性位点并且攻击亚胺丙酮酸的 Cα，
同时水分子提供羟基给亚胺丙酮酸的 Cα 生成一个含
阳离子的酸（甲醇胺 carbinolamine iii）。在脱氢酶的
催化作用下，甲醇胺 Cα 上由水分子提供的羟基上的
H+ 离子与 NH2 结合生成 NH3，同时也形成丙酮酸以
及 NADH（图 3-b）。
4.2 逆反应——氨化生成氨基酸
丙酮酸通过 Lys75 和 Arg15 与丙氨酸脱氢酶结
合，His96 的咪唑环和丙酮酸结合并在反应中起催化
作用（图 2）。Lys75 与丙酮酸的羰基结合，丙氨酸
脱氢酶的 Glu118 上的羧基与 His96 的咪唑环可以催
化反应顺利进行。在催化反应过程中结构域 domain
会发生移动变化，Asp260 使烟碱和丙酮酸充分接触，
2011年第12期 31
还参与并调控了芽孢杆菌的孢子萌发、耻垢分枝杆
菌休眠以及黄色黏球菌发育等 ；而在肺结核疾病的
治疗方面，由于结合分枝杆菌中丙氨酸脱氢酶所特
有的 B 细胞抗原特性是结核病诊断的一个有效依据，
能为结核病的预防和治疗提供技术支持，可以有效
地减少结核病的发生［19］。科研人员基于 L-丙氨酸是
细菌细胞壁肽聚糖骨架中的重要成分和丙氨酸脱氢
酶的生物学性质曾经开发了一些生物抑菌剂，对于
细菌尤其是致病菌的生长起到一定的抑制作用。但
是由于这些抑制剂的特异性弱，严重影响了抑制剂
抑菌作用的发挥。目前，本实验室正致力于从极端
环境中克隆获取嗜极丙氨酸脱氢酶，通过酶学特性
表征和酶蛋白结构解析探索酶蛋白对极端环境下的
催化反应机制，并通过分子进化手段定向改造酶蛋
白，为工业生产提供合适的酶蛋白。随着愈来愈多
科研人员从多方面对丙氨酸脱氢酶进行研究，相信
不久的将来，在充分了解酶蛋白催化机制的基础上，
合理利用酶蛋白参与生物活性小分子的工业生产，
或以酶蛋白为靶标，开发合适的抑菌剂和治疗药物
以有效地抑制细菌滋生和疾病的防治都将成为可能。

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