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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):106-112
常 绿 阔 叶 灌 木 蒙 古 沙 冬 青（Ammopiptanthus
mongolicus），作为古老的第三季残遗物种［1］，主要
分布在我国的内蒙古、宁夏、甘肃等省区［2，3］，其
适应性很强，不仅抗寒而且耐旱，在年降水量低于
240 mm、蒸发量 2 000-3 000 mm、极端低温 -24.8℃、
极端高温 37.7℃的恶劣环境下，仍能正常生长［4］。
鉴于在这种极端胁迫条件下的生存能力，使得沙冬
青成为一种研究荒漠植物抗逆性的理想材料。
在植物生长受到的诸多环境胁迫中，渗透胁迫
是其中最为严重的制约因素之一［5，6］。植物适应渗
透胁迫是一种复杂的生理现象。植物通过体内积累
可溶性渗透物质，保证正常的细胞结构，以应对渗
透胁迫［7］。在这些可溶性物质中，脯氨酸是分布最
广的渗透剂［8］。在受到渗透胁迫时，脯氨酸作为一
个渗透调节剂持续在植物体内积累［9］，使细胞保
持适当的渗透势，稳定并保护生物大分子结构以及
收稿日期 ： 2014-09-11
基金项目 ：国家自然科学基金重大研究计划项目（91125028）
作者简介 ：岳光振，男，硕士研究生，研究方向 ：植物逆境生理生化特征 ；E-mail ：biboqingyan@163.com
通讯作者 ：苏彦华，男，博士，研究员，研究方向 ：分子植物营养学 ；E-mail ：yhsu@issas.ac.cn
沙冬青脯氨酸转运体基因的克隆及表达分析
岳光振  金曼  李俊林  杨顺瑛  郭满园  苏彦华
（中国科学院南京土壤研究所 土壤与农业可持续发展国家重点实验室，南京 210008）
摘 要 ： 通过 RACE 技术从沙冬青中克隆获得了脯氨酸转运体基因 AmProT（GenBank 登录号为 KJ873133）。序列分析表明，
AmProT 基因开放阅读框为 1 329 bp，编码 442 个氨基酸，预测蛋白质分子量为 48.07 kD，等电点为 9.32，含有 11 个跨膜区域，具
有典型的脯氨酸转运蛋白的特征。进化分析显示，AmProT 与大豆 ProT 的相似性达到 86%。荧光定量 PCR 分析表明，AmProT 在
地上部的表达量要显著高于地下部，在受到干旱、高盐、脱落酸胁迫后表达量呈上调趋势，推测 AmProT 可能在沙冬青响应干旱、
盐等非生物胁迫过程中发挥作用。
关键词 ： 沙冬青 ；脯氨酸转运体基因 ；基因克隆 ；表达分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.017
Cloning and Expression Analysis of Proline Transporter Gene in
Ammopiptanthus mongolicus
Yue Guangzhen Jin Man Li Junlin Yang Shunying Guo Manyuan Su Yanhua
（State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture/Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008）
Abstract: The cDNA of proline transporter gene in Ammopiptanthus mongolicus（GenBank accession No. KJ873133）was amplified
by RACE technology. Bioinformatics analysis showed that the length of AmProT ORF was 1 329 bp, the gene encoded a putative polypeptide of
442 amino acids with a calculated molecular mass of 48.0733 kD and a theoretical pI of 9.32. It had 11 transmembrance domains, which is the
typical characteristics of proline translocator. Phylogenic analysis indicated that AmProT was 86% similar to proline transporter gene of Glycine
max. Real-time PCR analysis revealed that AmProT expressed in all tissues examined with more higher level in the above-ground part than the
underground part; expression profiles under different stress treatments such as drought, salt and ABA were compared, and the results revealed
that transcriptional level of AmProT was up-regulated. It is speculated that AmProT plays an important role in response to abiotic stresses such as
drought and salt.
Key words: Ammopiptanthus mongolicus ；proline transporter gene ；gene cloning ；expression analysis
2015,31(5) 107岳光振等：沙冬青脯氨酸转运体基因的克隆及表达分析
功能［10］。
脯氨酸在植物体内不是均一存在的，在一些不
含叶绿体的组织中，脯氨酸的积累主要靠外源脯氨
酸 的 转 运［11］。 自 从 1996 年 Rentsch 等［12］ 利 用 酵
母 SHR 缺陷突变体与拟南芥 cDNA 文库克隆出第一
个编码脯氨酸转运蛋白的基因（ProT2）以来，已
经 有 水 稻（Oryza sativa）［13］、 拟 南 芥（Arabidopsis
thaliana）、 榆 钱 菠 菜（Atriplex hortensis）［14］、 大
麦（Hordeum vulgare）［15］ 等 的 ProT 基 因 被 成 功 克
隆。研究发现，脯氨酸转运体基因的表达具有物种
差异性。Udea 等［16］发现，大麦 HvProt 基因主要在
根部表达，在受到盐胁迫的情况下表达更为强烈 ；
Igarashi［13］和 Silke 等［17］发现水稻的 OsProT 基因和
拟南芥 AtProT3 基因主要在植株地上部表达。
目前，关于沙冬青基因克隆与遗传表达方面的
研究，Wei 等［18］发现 AmNHX2 基因在转基因拟南
芥受到干旱和盐胁迫时表达量增加 ；Liu 等［19］克
隆获得 AmLEA，异位表达发现该基因提高了大肠
杆菌对冷和热的适应能力 ；Song 等［20］发现 AmGS
提高了转基因石楠树的御寒能力。另外，Zhou［21］、
Pang［22］和 Wu［23］等分别对沙冬青进行了转录组测序，
分析研究了沙冬青在干旱和冷胁迫下部分基因的表
达状况。
脯氨酸在沙冬青适应胁迫过程中发挥着重要作
用［24，25］，目前还没有关于沙冬青脯氨酸转运体基
因克隆与表达方面的报道。本研究通过 RACE 技术，
克隆了沙冬青脯氨酸转运基因，命名为 AmProT（登
录号 KJ873133），利用生物信息学方法对其核苷酸
序列以及编码的氨基酸序列进行分析，并通过实时
荧光定量 PCR 技术对该基因的组织表达模式以及胁
迫调控表达模式进行分析，旨为进一步研究其在抗
逆过程中的生物学功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）种子
由甘肃民勤沙生植物园提供。
1.1.1 沙冬青育苗 挑取大小一致、籽粒饱满的沙
冬青种子，洗净后用 70% 的乙醇浸泡 30 s，用无
菌水清洗 4-5 次，清水浸泡 24 h，种子吸胀。然
后转移到铺有双层吸水纸的灭菌培养皿中，向培
养皿中加适量蒸馏水，置于 25℃的暗光培养箱中
进行催芽。3 d 之后，将长势一致的发芽沙冬青转
移 到 有 孔 的， 内 径 为 17.5 cm×9 cm×3.5 cm 的 长
方体塑料盒中，每盒定植 72 棵沙冬青，用改良的
pH5.8 的 1/2Hoagland［大量元素 Ca（NO3）2·4H2O，
945 mg/L ；NaNO3，425 mg/L ；NH4NO3，80 mg/L ；
NaH2PO4，121 mg/L ；MgSO4·7H2O，493 mg/L ；
微 量 元 素 H3BO3，2.86 mg/L ；MnSO4·4H2O，1.61
mg/L ；CuSO4·7H2O，0.07 mg/L ；ZnSO4·7H2O，
0.22 mg/L ；Na2MnO4·2H2O，0.12 mg/L ； 铁 盐
FeSO4·7H2O，5.57 g/L ；Na2EDTA·2H2O，7.45 g/L］
营养液培养，每 2 d 更换一次新营养液。
1.1.2 处理及取样 培养 3 周之后，选取生长一致
的四叶一心期沙冬青幼苗进行 3 种胁迫处理 ：18%
（W/V）的 PEG-6000（-0.4 MPa），100 mmol/L 的 Na-
Cl，100 μmol/L 的脱落酸（ABA）。样品在处理 1、3、6、
12、24、48 h 时，分别从地上部和地下部取样，对
照为处理 0 h 的样品。上述样品均用液氮速冻，存
于 -80℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成 称
取 0.1 g 沙 冬 青 样 品， 用 RNAiso Plus 植 物 RNA 提
取试剂盒（Invitrogen 公司）提取总 RNA。取 RNA
2 μg， 根 据 Primescript 1st Strand cDNA Synthesis Kit
（Invirtrogen）试剂盒的说明，以 Oligo-dT 为引物通
过 RT-PCR 逆转录制备 cDNA 第一链。用于 cDNA
全长的克隆和定量分析。
1.2.2 全长 cDNA 序列克隆 用 DNAMAN 软件比对
NCBI 上 登 录 的 豇 豆（Vigna unguiculata）（AB3775-
28）、 拟 南 芥（Arabidopsis thaliana）（NM_129215）、
番茄（Solanum lycopersicum）（NM_001247065）和苜
蓿（Medicago truncatula）（XM_003616498） 等 植 物
的 ProT 基因序列。设计保守区引物 P1（5-YAVYG-
CGATTCATGGTTTC-A-3）/P2（5-AATYAYAMRTC-
HGCAAAAACA-3）；根据保守区片段测序结果设计
引物 P3（5-CCATTTTTCCTGATTATCTTT-3）/P4（5-
TGGCACTGGTTC-AACATTGGTTT-3）用于 3-RACE
克隆，P5（5-ATGATGTAGCCAGTATTTATC-3）/P6
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5108
（5-TGTTGACT-CCGGTAGTGAGG-3）用于 5-RACE
克隆，根据保守区，3-RACE 和 5-RACE 三段 cDNA
序列的拼接结果，设计引物 P5/P6 于用基因全长扩
增。3-RACE 和 5-RACE 反 应 按 SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit User Manual（Clontech）试剂
盒说明书进行。各轮 PCR 产物均用胶回收试剂盒纯
化后与 pMD19-T 克隆载体连接，转化 JM109 感受态
细胞，挑取阳性菌落，PCR 鉴定后由华大公司测序。
1.2.3 生物信息学分析 通过 DNAMAN6.0 将沙冬
青 ProT 基因 cDNA 全长序列翻译成氨基酸序列 ；利
用 ProtParam 分析其编码蛋白质的基本理化性质 ；通
过 NCBI 中的 Conserved Domains 分析其功能结构域 ；
用 SignalP4.1 软件预测信号肽 ；用 TMpred 软件预测
可能存在的跨膜区 ；利用 Psort 预测亚细胞定位 ；利
用 Sopma 进行蛋白质二级结构分析。
利用 NCBI 的 Blast 程序进行 AmProT 基因编码
氨基酸序列的一致性对比，采用 Mega5.0 软件构建
其系统发育进化树。
1.2.4 实时荧光定量 PCR 分析 以培养 3 周之后
的 沙 冬 青 为 材 料，18%（W/V） 的 PEG-6000，100
mmol/L NaCl，100 μmol/L 脱 落 酸（ABA）， 处 理 0、
1、6、12、24、48 h 后，称取 0.1 g 样品，参照植物
RNA 提取试剂盒说明书提取样品总 RNA。
根 据 获 得 的 cDNA 序 列， 设 计 引 物 AmProT-
BD-S1（5-ACGATTAGGCAGCCAGTTGT-3） 和 Am-
ProT-BD-F1（5-GAAGGAGAGCCGCCA-CAAAT-3），
选定看家基因 β-actin 为内参基因［Ac-tin F（5-CT-
GACATGCGCCGTAGGAACG），Actin R（5-CCCTG-
CTTATGCCAGTCTTTT）］。 根 据 SYBR® Select Master
Mix（Applied Biosystems by Life Technologies 公 司 ）
试剂盒说明书，于 Bio-Rad CFX-96 仪器上进行 qRT-
PCR。反应体系为 SYBR® Select Master Mix 10 μL、正
反引物各 0.4 μL、cDNA 2.5 μL、ddH2O 6.7 μL。反应
条件为 ：95℃预变性 30 s ；95℃变性 10 s，60℃退
火 10 s，72℃延伸 15 s，44 个循环。每个取样点设
3 次技术重复，试验共设 3 次生物学重复。
2 结果
2.1 AmProT基因的克隆与序列分析
利用简并引物 P1/P2 扩增获得片段长度为 1 236
bp。3-RACE 和 5-RACE 分 别 获 得 的 片 段 长 度 为
311 bp 和 206 bp（图 1）。将保守区，3-RACE 和 5-
RACE 三段 cDNA 序列进行拼接，根据拼接序列进行
PCR 扩增，测序结果与拼接结果完全一致。AmProT
基因全长 1 587 bp（GenBank 登录号 KJ873133），其
中 5 端非翻译区（5UTR）长 61 bp，3 端非翻译区
（3UTR）长 197 bp，ORF 长 1 329 bp，编码 442 个
氨基酸（图 2）。
4500
bp
3000
2250
1500
1000
750
500
250
1 M 2 M
2000
bp
1000
750
500
250
100
3M
A
C
B
D
2000
bp
1000
750
500
250
100
2000
bp
1000
750
500
250
100
4 M
M ：Marker ；1 ：3 端产物 ；2 ：5 端产物 ；3 ：P1/P2 扩增产物 ；
4 ：全长扩增产物
图 1 AmProT 基因的 PCR 扩增电泳
2.2 AmProT基因的生物信息学分析
通过 ProtParam 预测该基因编码的蛋白分子式
为 C2253H3459N543O592S14，分子量为 48.07 kD，等电点
为 9.32，属于碱性蛋白质。负电荷氨基酸（Asp+Glu）
20 个 ；正电荷氨基酸（Arg+Lys）30 个，不稳定系
数为 26.38，属于稳定型蛋白（<40 蛋白稳定），脂
肪系数为 110.77，平均亲水性（GRAVY）0.617，预
测该蛋白质为疏水性蛋白。利用 NCBI 的 Conserved
Domains 分析发现，AmProT 蛋白与已知蛋白质结构
功能数据库中其他物种 ProT 具有相似的结构功能
域。运用 SignalP4.1 程序对 ProT 编码的蛋白序列进
行 N 端信号肽预测，结果发现无信号肽结构。通过
2015,31(5) 109岳光振等：沙冬青脯氨酸转运体基因的克隆及表达分析
TMHMM2.0 预测可知，AmProT 编码的蛋白含有 11
个跨膜区域（图 3）。PSORT Prediction 软件预测该
蛋白质定位于细胞质膜的可信度为 0.6，定位于高尔
基体的可信度为 0.4，定位于叶绿体类囊体膜的可信
度为 0.394，定位于内质网的可信度为 0.3，因此认
为该蛋白最可能定位于细胞质膜。
氨基酸序列与已克隆的其他植物基因编码的氨基酸
序列均有不同程度的相似性，与大豆基因相似性最
高，为 86% ；与菜豆、豇豆、蒺藜苜蓿、桃、葡萄、
拟南芥和番茄的相似性分别为 83%、83%、83%、
77%、75%、73% 和 72%。利用 MEGA5.0 构建沙冬
青 ProT 系统进化树。由图 5 可见，沙冬青 ProT 蛋
白与大豆（Glycine max）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、
豇豆（Vigna unguiculata）在同一个小分支上，同源
性最高。
2.4 AmProT基因在不同胁迫下的表达分析
2.4.1 AmProT 基因的组织特异性表达分析 分别提
取沙冬青地上部和地下部的总 RNA，采用荧光定量
PCR 方法检测 ProT 基因在这两部分中的表达丰度，
以看家基因 β-actin 为内参基因。图 6 显示，AmProT
基因在地上部和地下部中都有表达，在地上部的表
达量要显著高于地下部。
2.4.2 AmProT 基因的胁迫诱导表达分析 分别用
干旱、盐、脱落酸处理沙冬青幼苗，利用荧光定量
PCR 分析 AmProT 基因的表达模式。分析结果（图 7）
表明，干旱［18%（W/V）的 PEG-6000］处理可以
诱导该基因的表达，在处理之后 1 h 时表达量迅速升
高，到 6 h 时略有下降，但仍高于本底表达，之后
表达量随时间的延长而上升，48 h 时表达量达到最
大值。盐（100 mmol/L 的 NaCl）处理后，表达量在
1 h 时迅速上升，6 h 时达到最大值，之后逐渐下降，
1
91
181
271
361
451
541
631
721
811
901
991
1081
1171
1261
1351
1441
1531
图 2 AmProT 基因编码的核苷酸及氨基酸序列
50 150 250 350 400300200100
transmembrane
0
0.2
0.4
0.6
pr
ob
ab
ili
ty 0.8
1.0
1.2
inside outside仌㢢ḷ䇶㿱⭥ᆀ⡸
图 3 AmProT 蛋白的跨膜结构与分析
利 用 在 线 Sopma 预 测 AmProT 蛋 白 的 二 级 结
构，结果（图 4）表明，该蛋白由 α-螺旋、延伸直
链、无规则卷曲 3 种形式组成，其中 α-螺旋包含
218 个氨基酸，占 49.32% ；延伸直链包含 86 个氨基
酸，占 19.46% ；无规则卷曲包含 138 个氨基酸，占
31.22%。
2.3 AmProT基因编码蛋白系统的进化分析
利 用 NCBI 的 Blast 进 行 AmProT 基 因 编 码 氨
基酸序列的一致性比对，分析结果表明，其编码的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5110
但仍高于本底值。脱落酸（100 μmol/L）处理后，该
基因的表达量在 1 h 显著提高，3 h 略有下降，6 h
时再次升高，并达到最高，之后，表达量随时间的
延长逐渐下降，但较本底表达仍然保持较高水平。
3 讨论
脯氨酸作为植物体内主要的渗透调节物质，在
应对渗透胁迫时发挥重要作用，研究表明，脯氨
酸转运体基因是植物体内脯氨酸转运、调配的功
能基因［12-15］。本研究利用 ProT 基因家族高度保守
的结构域，首次克隆了沙冬青脯氨酸转运体基因
AmProT，从其编码蛋白的二级结构含有 11 个跨膜
区域的特征来看，其编码的蛋白是典型的 ProT 转运
蛋白［26］。AmProT 编码的氨基酸序列与其他已克隆
的植物基因编码的氨基酸序列均有不同程度的相似
性，其中与同属豆科植物的大豆、菜豆、豇豆、蒺
藜苜蓿的相似性较高，分别为 86%、83%、83%、
83%，说明了与同属豆科的植物亲缘关系较近，基
因结构在进化过程中保持较高的保守性。
脯氨酸的生物合成部位主要是在细胞质基质
和叶绿体中［27］，在渗透胁迫下，植物叶部合成的
脯氨酸含量较高，根部合成的脯氨酸不足以满足其
对渗透胁迫的需求［28-31］。本研究的 qPCR 结果显
示，AmProT 基因在沙冬青的地上部表达量显著高于
地下部，说明 AmProT 基因是一个在地上部中优势
表达的基因。推测与叶片中大量合成的脯氨酸，需
要大量的转运体有关。这与前人研究结果，即水稻
的 OsProT 基因［13］ 和拟南芥 AtProT3 基因［17］ 主要
在植株地上部中表达相一致。通过对 AmProT 的胁
迫表达模式研究发现，该基因的表达量在干旱胁迫
后呈现“升—降—升”的趋势，产生这一现象可能
是因为 AmProT 基因的转录受到反馈机制调节，在
受到干旱胁迫时，蛋白维持在较高水平。在盐胁迫
和 ABA 处理下，AmProT 基因在沙冬青体内的表达
表现出相似的趋势，表达量先升高后降低，可能是
受到这两种胁迫时，该基因上游的正调控因子与该
50 150 250 350300200100
图中序列长度 ：442aa ；α-螺旋 ：49.32%（218/442）；延伸链 ：19.46%（86/442）；无规则卷曲 ：31.22%（138/442）
图 4 AmProT 蛋白的二级结构预测䉷䉶Vigna unguiculataAB377528.2㨌䉶Phaseolus vulgarisXM 007163435.1བྷ䉶Glycine maxBT097963.1⋉ߜ䶂Ammopiptanthus mongolicusKJ872133㫪㰌㤌㬯Medicago truncatulaXM_003616498.1㦐㨌CapsellaXM 006291091.1ᤏই㣕Arabidopsis thalianaNM 129215.3ኡᎋ㨌Eutrema salsugineumXM 006411168.1ṳPrunus persicaXM 007220331.1⮚㤴Solanum lycopersicumNM 001247065.1100100 99100889767
分支上的数值表示 1 000 次重复抽样符合聚类的百分数
图 5 AmProT 基因编码氨基酸序列的系统进化树分析
0
1
2
3
4
5 ൠл䜘 ൠк䜘㓴㓷ಘᇈ⴨ሩ㺘䗮䟿
图 6 AmProT 基因的组织表达模式
2015,31(5) 111岳光振等：沙冬青脯氨酸转运体基因的克隆及表达分析
基因的启动因子结合激活了基因的表达，使其在胁
迫后上调，之后略有下降，趋于平稳。这也印证了
ProT 基因普遍存在于植物组织中，而表达水平受渗
透胁迫诱导的观点［12］。在本试验中，AmProT 对干
旱、盐胁迫及脱落酸均有响应，显示其在植物胁迫
响应的过程中可能发挥重要作用，而其在抗逆过程
中的生物学功能需要进一步的研究。
4 结论
从沙冬青克隆获得一个新的基因 AmProT，该基
因全长 1 587 bp，编码 442 个氨基酸，其编码蛋白
的二级结构含有 11 个跨膜区域，是 ProT 转运蛋白
的一个显著特征。AmProT 在地上部中优势表达，对
干旱、盐胁迫及脱落酸都能产生响应。
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A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 1 3 6 12 24 48༴⨶ᰦ䰤/h⴨ሩ㺘䗮䟿
B
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 1 3 6 12 24 48༴⨶ᰦ䰤/h⴨ሩ㺘䗮䟿
C
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 1 3 6 12 24 48༴⨶ᰦ䰤/h⴨ሩ㺘䗮䟿
A ：PEG 处理 ；B ：NaCl 处理 ；C ：ABA 处理
图 7 AmProT 基因的胁迫诱导表达模式
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5112
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（责任编辑 李楠）