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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
自 20 世纪 80 年代，第一株转基因植物问世以
来［1］，转基因技术在植物遗传改良中发挥着愈来愈
重要的作用，已在多种作物中取得成功［2］。但在植
物转基因操作过程中，转化细胞的筛选通常是通过
筛选标记基因来实现的。转化完成后标记基因失去
作用，他们的存在还可能带来生物安全性问题［3］。
特别是到目前为止，植物转基因中所使用的筛选标
记基因主要是抗生素抗性和除草剂抗性基因，包括
卡那霉素和潮霉素抗性、bar（bialophos）和 EPSP
（5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）抗性等
少数几个基因。一方面给转基因植物的再次转化带
来不便［2，4］，同时给环境和食品安全带来潜在威胁。
这些抗性基因可能通过花粉介导逃逸到其野生近缘
收稿日期 ：2014-01-27
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（2013AA102702）
作者简介 ：池俊杰，男，硕士，研究方向 ：次生细胞壁合成转录调控 ；E-mail ：cjj_2337@163.com
通讯作者 ：王宏芝，女，副研究员，研究方向 ：次生细胞壁合成转录调控 ；E-mail ：wanghongzhi@baafs.net.cn
拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除
池俊杰1，2  戴绍军1  魏建华2  王宏芝2
（1. 东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心 东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040 ；
2. 北京农业生物技术研究中心，北京 100097）
摘 要 ： 通过在拟南芥原生质体中瞬时表达重组酶删除系统，以拟南芥热激蛋白 Hsp18.2 基因的启动子诱导加入马铃薯
StLs1 基因第 2 个内含子的重组酶表达，证明瞬时转化质粒 DNA 中位于识别位点之间的基因元件可以被有效删除。建立了一种快
速验证重组酶外源基因删除系统的方法。
关键词 ： 位点特异性重组系统 热激蛋白 Hsp18.2 启动子 拟南芥原生质体瞬时表达
Recombinase-mediated Marker Gene Excision in Transient Gene
Expression System of Arabidopsis Mesophyll Protoplasts
Chi Junjie1，2 Dai Shaojun1 Wei Jianhua2 Wang Hongzhi2
（1. Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University，Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology
Restoration in Oil Field，Ministry of Education，Harbin 150040 ；2. Beijing Agro-Biotechnology Research Center，Beijing 100097）
Abstract:  In the present study, we used transient gene expression system of Arabidopsis mesophyll protoplasts to test and compare site-
specific recombination constructs, which the expression of recombinase was induced by the promoter for heat-shock proteins Hsp18.2, developed
a simple and convenient system for rapid assessment of site-specific recombination constructs.
Key words:  Site-specific recombination system Promoter for heat-shock proteins Hsp18.2 Transient gene expression system of
Arabidopsis protoplast
种中，导致自然生态系统或农业生态系统失衡。
近年来，研究者们利用位点特异重组系统来删
除标记基因以提高转基因植物的安全性及获得无标
记基因的转基因植物［5-9］。位点特异重组系统，由
于工作原理简单、删除效率相对较高，被广泛应用
于转基因植物选择标记基因的删除。目前已经在植
物上得到有效应用的位点特异性重组系统包括 ：来
源于细菌噬菌体 P1 的 Cre/loxP 系统［10］；来源于啤
酒酵母的 2 μm 质粒的 FLP/FRT 系统［11-13］和来源于
接合酵母 SR 质粒的 R/RS 系统［14］。Cre/loxP 系统和
FLP/FRT 系统在植物中应用最为广泛，删除效率也
相对较高。罗克明等［15］采用含有 loxPFRT 融合识
别位点的删除系统，在 T0 代转基因烟草花粉基因组
2014年第7期 87池俊杰等 ：拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除
中外源基因的最高删除效率达到 100%，远高于只含
有单一识别位点的 Cre/loxP 或 FLP/FRT 删除系统。
在位点特异重组系统中，组成型表达重组酶会
导致植物基因组重排［16］和植物生长异常［17］。因此
有效控制重组酶在特定时间、特定植物组织部位表
达是提高其应用效率，减少重组酶过量表达对植物
造成伤害的关键。组织特异性启动子和诱导性启动
子的应用成为有效的解决方案。Lyznik 等［18］1995
年在玉米细胞中通过 I-Isp 启动子控制 FLP 基因表
达，转基因植物细胞中的外源基因得到了一定程度
的删除。Kilby 等［19］ 采用来自大豆的热激蛋白启
动子 Glnhspl7.6L 实现了对重组酶 FLP 基因表达的
随时控制。Zuo 等［20］ 通过雌二醇诱导 Cre 基因表
达，实现了筛选标记基因及 Cre 基因的自动删除，
解决了无性繁殖植物获得无选择标记转基因植株的
难题。在 FLP/FRT 系统中，利用大豆热激蛋白启动
子 Gmhsp17.5-E 有效删除了杂交山杨转基因植株的
卡那霉素筛选标记基因［12］。其它使用的特异性表
达启动子包括来自拟南芥的热激蛋白 Hsp18.2 基因
启动子［21］、花粉和种子特异表达启动子［22］及乙醇
诱导启动子［22］。此外，通过将 FLP/FRT 和 Cre/loxp
的识别位点序列融合，重组酶系统删除效率明显
提高［23］。
通常，一种新型重组酶删除系统的验证需要获
得稳定转化的转基因植株，试验周期长［22］。而基因
删除载体的构建和植物转化过程，往往由于所选启
动子在非诱导条件下存在少量的本底表达，经常导
致试验过程反复。因此，需要建立一种快速验证重
组酶外源基因删除系统的方法，用于验证重组酶的
有效诱导表达及识别序列之间基因元件的有效删除。
本研究通过在拟南芥原生质体中瞬时表达重组酶删
除系统，证明瞬时转化质粒 DNA 中位于识别位点之
间的基因元件可有效的删除，建立一种快速验证重
组酶外源基因删除系统的方法，旨在为后期的稳定
转化，获得无筛选标记的转基因植株奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
野 生 型 拟 南 芥（Arabidopsis thaliana，ecotype
Columbia）种子消毒后，用无菌水悬浮，于 4℃春化
2 d，然后铺在 1/2 MS 平板上。待发芽后移植到营养
钵中。培养条件为 22℃，14 h，光照 ；18℃，10 h，
黑暗 ；光照强度为 120-150 μmol/m2·s。取生长 4
周未抽薹的健壮植株的第 5、6、7 片真叶用作拟南
芥原生质体分离。
1.2 方法
1.2.1 热激启动子克隆 根据拟南芥热激蛋白 Hsp-
18.2 基因及其上游序列［24］，设计特异引物 Hspf ：
5-GGTACCATGGTCATTTCTTCTGGTTC-3 和 Hspr ：
5-AGATCTGTTCGTTGCTTTTCGGGAGAC-3，下划线
为 Kpn I 和 Bgl II 酶切位点，以拟南芥基因组为模板
进行 PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目标条带，
连接到 pGEM-T easy vector 进行测序验证。
1.2.2 表达载体的构建 pLFGNHF ：含有重组酶
FLPe cDNA 的质粒 pGEM-T-FLPe 以及含有融合识别
位点 LF 的质粒 pLFGN 由西南大学罗克明教授提供。
Nos 终止子（NOSt）插入到 FLPe 重组酶的 3 末端，
720 bp 的 Hsp18.2 基因启动子（Hsp18.2p）序列和
Hsp18.2p-FLPe-NOSt 表达框架分别经 Kpn I 和 Sal I
酶切位点引入到 FLPe cDNA 的上游和 pLFGN 中，获
得用于标记基因删除的转化载体 pLFGNHF（图 1）。
载体中的 FLPe 不含内含子，所有表达元件均位于识
别序列之间。
pDGFPW 在 FLPe 重 组 酶 基 因 自 起 始 密 码 子
后 65 bp 处插入内含子，为 189 bp 的马铃薯 StLs1
基因的第 2 个内含子［25］。含有内含子的重组酶合
成基因 FLPeFIN 由 Invitrogen 公司合成，表达框架
Hsp18.2p-FLPeFIN-NOSt 通 过 Kpn I 和 Sal I 酶 切 位
点 引 入 表 达 载 体 pLFGN 中， 代 替 了 其 中 的 35Sp-
GUS∷NPTII-Nost 表达框架。再通过 Bgl II 和 Sma I
酶切位点引入 35Sp-NPTII-Nost 表达框架，通过 Nhe
I 和 Spe I 酶切位点在 loxPFRT 融合识别位点外引入
35Sp-GFP-Nost 表达框架，获得最终表达载体，命名
为 pDGFPW（图 2-A）。热激处理诱导重组酶表达后，
位于 loxPFRT 融合识别位点间的基因元件（图 2-C）
将被删除，删除后残留的片段如图 2-B 所示。
1.2.3 拟南芥原生质体瞬时表达 使用 QIGEN 质粒
提取试剂盒（Cat. No.12143）提取质粒 DNA。PEG
介导的拟南芥原生质体转染参考 Dr. Sheen 实验室的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期88
方法［26］，转染的原生质体置于 6 孔培养皿中，22℃
弱光条件下培养约 18 h，激光共聚焦显微镜于 488
nm 激发光下观察 GFP 表达情况。
1.2.4 重组酶诱导表达 转染 pDGFPW 和对照载
体质粒 DNA 的原生质体，22℃弱光条件下培养约
18 h，观察 GFP 表达情况。对照载体为改造后的
pGreen0029，其中引入了 35Sp∷GFP 表达框架，命
名为 pGreen35S∷GFP。转染 pDGFPW 质粒 DNA 的
原生质体在 37℃恒温培养箱中热激处理 3 h，诱导
重组酶 FLPe 表达，之后转入 22℃弱光条件下培养
2 h。转染对照载体的原生质体在 22℃弱光照条件下
继续培养 5 h。
1.2.5 重组酶 FLPe 转录表达 将原生质体及缓冲液
收集到离心管中，液氮速冻，研磨。使用 QIAGEN
公 司 的 RNeasy Micro Kit（Cat. No.74004） 提 取 总
RNA， 使 用 Invitrogen 公 司 的 反 转 录 试 剂 盒 进 行
cDNA 第一链合成，通过 RT-PCR 方法检测重组酶
FLPe 的转录表达。重组酶 FLPe 的检测引物分别位
于内含子序列两侧，以检测转录后重组酶 RNA 前体
的正确剪切，引物 intronf（5-CTAAGGTCCTGGTT-
C-GTCA-3）和 intronr（5-CAGATGCTTTCACCCTCA-
C-3）位置参见图 2-A。
1.2.6 目标基因元件的删除检测 通过 PCR 方法
检测位于识别位点之间的基因元件是否删除。引物
WDf 和 WDr 位于 loxPFRT 识别位点之外（图 2-B）。
其中正向引物 WDf ：5-AAGGAGCGGGCGCCATTC-
AG-3 位于 LB-LF 之间，反向引物 WDr ：5-ATGCT-
CCTCGTGGGTGGGGG-3 位于 35S Promoter 序列内。
当特异性识别位点间的序列正确删除后，扩增出目
的条带为 945 bp。
RBloxPFRTNosGUS::NPTII35SLB loxPFRT Hsp 18.2 NosFLPe
CTTCGCTATTACGCCAGC
Primer A
GGCATTTCAGGAAGTTTCG
Primer B
Primer C
CTATCGCCTTCTTGACGAG
Primer D
CGGGACAAGCCGTTTTAC
图 1 表达载体 pLFGNHF
CTAAGGTCCTGGTTCGTCA
Primer A
A
B
C
LB loxPFRT Hsp 18.2
Primer intronf
FLPeFIN
Intron
Primer B Primer intronr
Primer WDf
LB loxPFRT 35S
Primer WDr
GFP Nos RB
NosNPTII35SNosFLPeFINHsp 18.2
Intron
loxPFRT
CAGATGCTTTCACCCTCAC
AAGGAGCGGGCGCCATTCAG ATGCTCCTCGTGGGTGGGGG
Nos 35S
Primer C
NPTII Nos 35S GFP Nos RB
37ć✝◰༴⨶loxPFRT Primer EGATTATTGCTCGGGTAGATCG
A ：表达载体 pDGFPW ；B ：删除后残留的片段 ；C ：被删除的基因片段
图 2 pDGFPW 表达载体及外源基因删除示意图
2014年第7期 89池俊杰等 ：拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除
2 结果
2.1 热激蛋白Hsp18.2基因启动子克隆
以拟南芥基因组 DNA 为模板，PCR 扩增热激蛋
白 Hsp18.2 基因启动子序列，目标片段 720 bp（图 3）。
DNAMAN 多重序列比对分析表明扩增序列与 Gen-
Bank 公布序列在核酸水平的一致性达 99.85%，其中
只在 181 bp 处出现一个不匹配碱基（可能是测序错
误，或是扩增错误），相应的热激响应元件和 TATA
box 元件未发生改变（图 4）。因此认为得到的启动
子序列可响应热激处理，启动下游基因转录表达。
800
bp
M 1
bp
500
720
M ：DNA Marker ；1 ：Hsp18.2 启动子
图 3 Hsp18.2 启动子 PCR 扩增结果
HSP18.2 Proᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Proᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Proᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Proᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Proᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Proᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Proᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Pro
V
I II
VII
III
VI
IVᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
HSP18.2 Pro 719
720
640
639
560
559
480
479
400
399
320
319
240
239
160
160
80
80
ᢙ໎ᒿࡇ
Consensus
I-VI ：启动子中存在的热激响应元件 ；VII ：启动子中的 TATA box 元件
图 4 扩增序列与 Hsp18.2 启动子序列（登录号 X17295）比对
2.2 热激蛋白Hsp18.2基因启动子表达泄露
如 图 5 所 示， 载 体 pLFGNHF 用 PrimerAD 组
合进行 PCR 扩增出特异条带，表明两个 LF 位点
之间的序列被删除，也就说明热激蛋白 Hsp18.2 基
因启动子存在表达泄露 ；相对的载体 pDGFPW 用
PrimerAE 组合进行 PCR 没有扩增出条带，说明重组
酶 FLPe 基因中加入内含子后有效的防止了重组酶
FLPe 在原核中的表达泄露。
2.3 标记基因删除表达载体pDGFPW瞬时转化拟
南芥原生质体
在激光共聚焦显微镜下，试验组和对照组都观
察到绿色荧光，由于 CaMV35S 启动子为组成型的，
所以在整个原生质体细胞中均可见 GFP 表达（图 6），
ਜ਼ᴹ䖭փⲴDH5αབྷ㛐ᵶ㧼
DH5α
M 1 2 3 M 4 5 6
pDGFPW pLFGNHF
M ：DNA Marker ；1 ：PrimerAB ；2 ：PrimerCE ；3 ：PrimerAE ；4 ：PrimerAB ；
5 ：PrimerCD ；6 ：PrimerAD
图 5 热激蛋白 Hsp18.2 基因启动子表达泄露
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期90
A B C
1
2
1 ：pDGFPW 载体瞬时表达 ；2 ：pGreen35S∷GFP 阳性对照载体瞬时表达 ；A ：
明场图像和激发光下图像叠加 ；B ：488 nm 激发光下 GFP 绿色荧光 ；C ：明
场显微镜下观察
图 6 GFP 拟南芥原生质体瞬时表达
表明 pDGFPW 载体已成功转入拟南芥原生质体细胞
中，并正确表达。
2.4 标记基因删除检测
2.4.1 重组酶诱导表达 载体 pDGFPW 瞬时转化拟
南芥原生质体，热激诱导处理后提取总 RNA。RT-
PCR 方法检验重组酶基因的转录表达和正确剪接，
用 Primer intronf/r 进行 PCR 检测。pDGFPW 转染的
拟南芥原生质体，热激后 FLPe 重组酶扩增片段约为
430 bp，而以 DNA 为模板扩增出含有内含子的特异
条带 619 bp 左右，对照组无条带（图 7）。DNA 测
序表明拟南芥热激启动子 Hsp18.2 在 37℃热激处理
条件下启动重组酶 FLPe 转录，FLPe 前体 RNA 在拟
南芥原生质体细胞中正确剪接，切除内含子（图 8）。
600
M 1 2 3
bp
400
M ：DNA Marker ；1 ：pDGFPW 转染的原生质体经热激处理 ；2 ：pDGFPW 转
染的原生质体未经热激处理的对照 ；3 ：pDGFPW 载体 DNA
图 7 含有内含子的重组酶基因的转录表达和正确剪接
DNA 序列长达 6 kb，在相同的 PCR 延伸时间内无法
扩增出条带（图 9）。
3 讨论
自 20 世纪 80 年代，第一株转基因植物问世以来，
大部分转基因过程均以抗生素抗性或除草剂抗性作
为筛选转化体的标记［16］。抗生素抗性或除草剂抗性
可造成转基因逃逸，带来生物安全隐患，因此人们
希望在获得转基因后，从植物体中去除抗生素抗性
或除草剂抗性基因。位点特异重组系统目前被广泛
应用于转基因植物选择标记基因的删除。但由于删
除效率较低，不能完全去除转基因植物中的外源基
因。因此也很难运用于生产实践，消除转基因植物
带来的安全问题。
验证删除系统的正确性，是位点特异重组系统
应用于安全转基因植物研发的关键。本研究建立的
拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因
删除方法，具有简单快速、试验周期短等优点，能
够快速实现多种 loxP 突变位点的筛选。
在位点特异重组系统的研究中，有效控制重组
酶系统的表达是提高其应用效率，减少过量表达对
植物造成伤害的关键。由于组成型表达重组酶会导
致植物基因组重排和植物生长异常［16，17］，在位点特
异重组系统中需要使用组织特异性启动子和诱导性
启动子控制重组酶在特定时间、特定植物组织部位
表达，并将重组酶表达框架和抗生素抗性基因表达
框架均放置于重组识别位点之间，当重组酶经诱导
表达后，可同时删除重组酶和抗生素抗性基因，最
大限度减少重组酶过量表达对植物造成的伤害。为
了有效控制重组酶表达，需要筛选对诱导条件能够
严格反应的启动子，且该诱导条件在转基因试验操
作中能够被严格控制。避免重组酶表达泄露阻止载
体构建和植物转基因操作的顺利进行。本研究使用
的拟南芥热激蛋白 Hsp18.2 基因启动子在 37℃下诱
导表达，当含有删除载体 pLFGNHF 的大肠杆菌菌
株 DH5α 在 37℃条件下培养，造成重组酶表达，导
致部分质粒拷贝中位于识别位点之间的重组酶和卡
那抗性基因表达框架被删除。为了避免热激蛋白
Hsp18.2 基因启动子表达泄露引起的重组酶在大肠杆
菌和农杆菌中的表达，在 FLPe 重组酶基因中引入
2.4.2 重组酶诱导后删除标记基因 载体 pDGFPW
瞬时转化拟南芥原生质体，热激诱导重组酶表达，
提取 DNA，PCR 方法验证瞬时转化载体 DNA 中位
于两个识别位点之间的序列是否删除。pDGFPW 转
染的原生质体用 WDf/r 引物进行 PCR 检测，热激处
理后扩增出 945 bp 左右的特异条带，表明重组酶成
功识别 loxPFRT 融合位点并删除两个融合识别位点
间的 DNA 序列，而未处理对照由于融合位点间的
2014年第7期 91池俊杰等 ：拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除
189 bp 的马铃薯 StLs1 基因的第 2 个内含子［25］，无
论在单子叶还是双子叶植物中此内含子均可被有效
加工剪接［27］。在原核生物中，泄露表达的 FLPe 前
体 mRNA 由于无法正确剪接，不产生有功能的重组
酶蛋白，保证了载体的正常构建和后期的植物转化。
通过拟南芥原生质体瞬时表达检验位点特异性
重组系统，可以快速鉴定重组酶对特异位点的识别，
筛选更稳定的严格响应诱导条件的物理或化学诱导
启动子。根据实际出现的问题，及时调整试验方案，
达到严格控制重组酶表达的目的，保证后续植物转
基因工作的顺利进行。
4 结论
本研究建立了一种快速验证重组酶外源基因删
除系统的方法。证明在拟南芥原生质体中瞬时表达
位点特异性重组酶删除载体，特异条件诱导重组酶
表达，可有效删除瞬时转化质粒 DNA 中位于识别位
点之间的基因元件。
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Adv, 2011, 29（6）：703-714.
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Primer intronf
1
1
61
30
121
30
181
30
241
52
301
112
361
172
421
232
481
292
541
352
601
412
Primer intronr
Upper line ：嵌合内含子的 FLPe 基因片段 ；Lower line ：热激后 RT-PCR 扩增的 FLPe 基因片段 ；实线长方形 ：
剪切掉的内含子序列 ；虚线长方形 ：扩增引物
图 8 热激处理后测序结果与已知序列比对结果
M 1 2
bp
1000
M ：DNA Marker ；1 ：pDGFPW 转染的原生质体经热激处理 ；2 ：pDGFPW 转
染的原生质体未经热激处理的对照
图 9 标记基因删除检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期92
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（责任编辑 马鑫）