全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
高效删除标记基因的 Bhlea2 植物表达载体的构建
邹璐琳1，2 魏建华2 王宏芝2 张少斌1
(1沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110866;2北京农业生物技术研究中心，北京 100097)
摘 要: 为培育去除选择标记基因的耐旱转基因植物，同时利用 Cre /Lox 和 FLP / frt 系统，构建一个能够高效删除标记
基因的 Bhlea2 基因植物表达载体。拟南芥 rd29A启动子是在低温、干旱、高盐胁迫下的快速应答启动子，玉米 ubiquitin 启动
子可有效驱动外源基因的转录，拟南芥 pAB5 启动子是花粉及胚胎等发育早期特异表达的启动子，利用上述启动子构建了表
达 Bhlea2 基因并能够删除标记基因的植物表达载体。该表达载体包括重组酶表达元件 pAB5-FLP、Bhlea2 抗旱基因表达元件
rd29A-Bhlea2 和 bar标记基因表达元件 ubiquitin-bar。
关键词: 位点特异性重组系统 标记基因删除 转基因植物
Construction of a Bhlea2 Gene Vector with Efficient Deleting
Marker Gene System in Transgenic Plants
Zou Lulin1，2 Wei Jianhua2 Wang Hongzhi2 Zhang Shaobin1
(1Biological Science and Technology College，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866;
2Beijing Agro-biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Science，Beijing 100097)
Abstract: For breeding the marker-free transgenic plants with high tolerance to drought，a Bhlea2 gene vector with efficient dele-
ting marker gene system was constructed using the system of Cre /Lox and FLP / frt． Rd29A promoter is a rapid responsive promoter from
Arabidopsis thaliana under the condition of low temperature，drought and high salt stress． The promoter of the maize ubiquitin gene can
efficiently regulate the transcription of a foreign gene in transgenic plants． pAB5 promoter of Arabidopsis thaliana expresses especially at
the early development stage of pollen and embryo． Using the promoter of above，we constructed a Bhlea2 gene vector with efficient dele-
ting marker gene system，the vector contained the elements of pAB5-FLP，rd29A-Bhlea2 and ubiquitin-bar．
Key words: Site-specific recombination system Deletion marker gene Transgenic plants
收稿日期:2011-04-11
基金项目:创新能力建设专项(KJCX201102003) ，转基因重大专项(2009ZX08009-060B) ，国家高技术研究发展计划“863”计划(2009AA10Z107) ，北
京主要作物高效育种关键技术的合作研究(2010DFB33740) ，辽宁省教育厅高等学校科学技术研究项目(2008663)
作者简介:邹璐琳，女，硕士研究生，研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:08104012@ 163． com
通讯作者:王宏芝，女，博士，副研究员，研究方向:农业生物技术;E-mail:wanghongzhi@ baafs． net． cn
张少斌，男，博士，副教授，研究方向:植物分子生物学;E-mail:zsb20022001@ yahoo． com． cn
植物转基因技术经过 20 多年的发展，已成为增
加粮食产量、减少环境污染最重要的手段之一［1，2］。
虽然转基因植物为人们带来了巨大的经济和社会效
益，但其安全性问题也引起了全世界越来越广泛的
关注［3］。通过培育无选择标记的转基因植物
(Marker-free transgenic plants，MFTPs)是提高转基因
植物安全性的有效方法之一［4，5］。
目前，用于构建无选择标记基因的转基因体系
主要有共转化系统、转座子系统、同源重组系统和位
点特异性重组系统，其中位点特异性重组系统的应
用最为广泛。2002 年 Lauth 等［6］研究发现，将 lox
和 frt分别置于目的基因的两端，在重组酶的作用
下，能够提高重组酶蛋白识别和删除的效率。2004
年罗克明［2，7 － 11］综合利用了噬菌体 Cre / lox 和酵母
FLP / frt两套位点特异性重组系统，将识别位点 lox
和 frt以及重组酶 FLP融合在一起，获得了一个可以
高效删除外源基因的全新的基因删除系统，并在烟
草中得以验证。
本研究利用罗克明构建的全新的基因删除系统，
构建了一个以 bar 做筛选标记基因，由 rd29A启动子
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
驱动 LEA蛋白编码基因 Bhlea2 基因［12 － 14］的单子叶
植物表达载体，目的是利用抗性标记基因筛选出转化
体，然后在植物特定发育阶段将除目的基因以外的所
有外源基因从植物的特定器官中消除，从而为培育无
选择标记基因的耐旱单子叶植物打下基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)为 Columbia 生态
型，由北京农业生物技术研究中心保存。质粒
pSP72、SK、pBAC144、pBin19-Bhlea2、pBPC26、pubi-
mcs以及质粒 T easy-Flpe、T easy-nos 均为本实验室
保存。质粒 pLFGN由罗克明惠赠。
大肠杆菌 DH5α、质粒小提试剂盒、基因组
DNA小提试剂盒及 DNA Marker 购自天根生化科
技公司;各种 DNA限制性内切酶、Taq DNA聚合酶
和碱性磷酸激酶(CIAP)购自大连宝生物工程公
司;T4 DNA连接酶、T Easy Vector及胶回收试剂盒
购自 Promega公司;测序及引物合成由上海英骏公
司完成。
1. 2 方法
1. 2. 1 PCR引物如表 1 所示。
表 1 试验所用引物
基因名称
片段
长度
(bp)
引物序列(5 － 3)
酶切
位点
Bhlea2 402 F:GGATCCATGCAGACTGCGAAGC BamHⅠ
R:GAGCTCCTACTGAGTCGGAGCT SacⅠ
pAB5 1 841 F2:GGTACCACCCAACAAGTTCCCT-
TCC
KpnⅠ
F1:GGTACCGGCAAGACTCTTCGTC-
TTTG
KpnⅠ
R1:GGGCAATTCCAGATGCAAC
NPTⅡ 296 F:GTCGACGACCACCAAGCGAAACATC SalⅠ
(pLFGN) R:AAGCTTATATCACGGGTAGCCAACG Hind Ⅲ
pAB5-flpe 491 F:GGTTGGTTAGCGAATGTA
R:GGTTAGTTCAGCAGCACA
rd29A- 2 250 F:TTCCGGTGGAAGTGAGTG
Bhlea2-nos R:CCCGATCTAGTAACATAGATGAC
1. 2. 2 pAB5启动子的克隆 根据 Belostotsky 等［15］
的报道，选取来自拟南芥子房、花粉以及胚胎发育早
期特异性表达的启动子 pAB5，控制重组酶 FLP 基因
的表 达。根 据 NCBI 中 公 布 的 序 列 (登 录 号
AC012654)设计引物。以拟南芥基因组 DNA 为模板
在 50 μL反应体系中利用巢式 PCR 方法扩增，扩增
程序为:98℃预变性 30 s;98℃ 10 s，65. 8℃ 30 s，72℃
50 s，20个循环;72℃ 延伸 7 min。取一扩产物 2 μL
作模板，98℃预变性 30 s;98℃ 10 s，65. 8℃ 30 s，72℃
1 min，30个循环;72℃延伸7 min;18℃保存。将 PCR
产物回收连入 T Easy载体，测序。
1. 2. 3 中间载体的构建 利用试验室保存的原始
质粒，首先构建以 EcoRⅠ为上下游酶切位点的 T
easy-rd29A-Bhlea2-nos载体，以 KpnⅠ为上下游酶切
位点的 SK-pAB5-Flp-nos 载体，以 HindⅢ为上下游
酶切位点的 pubi-ubi-bar-nos载体。
1. 2. 4 植物表达载体 pLF-Lea2 的构建 首先改造
质粒 pLFGN，利用表 1 中引物扩增约 300 bp 的 NPT
Ⅱ片段，替换质粒中的 35S-GUS-NPTⅡ片段，并引入
Hind Ⅲ酶切位点，改造后的质粒命名为 pLF，它在
Lox / frt序列上游有 EcoRⅠ酶切位点，在两个 Lox / frt
序列之间含有 KpnⅠ和 HindⅢ酶切位点。
利用 EcoRⅠ酶切 T-easy-rd29A-Bhlea2-nos，回
收表达元件 rd29A-Bhlea2-nos 基因片段;利用 EcoR
Ⅰ酶切 pLF，回收载体，将两者连接，鉴定连接方向
正确后命名该载体为 pLF1。
利用 KpnⅠ单酶切质粒 SK-pAB5-Flp-nos，回收
表达元件 pAB5-Flp-nos 基因片段，用 KpnⅠ单酶切
质粒 pLF1，回收载体，将两者连接，鉴定连接方向正
确后命名该载体为 pLF2。
通过 HindⅢ单酶切质粒 pubi-ubi-bar-Nos，回收
表达元件 ubi-bar-nos基因片段，用 HindⅢ单酶切质
粒 pLF2，回收载体，将两者连接，鉴定连接方向正确
后，得到最终载体 pLF-Lea2(图 1)。
2 结果
2. 1 pAB5 启动子的克隆与序列分析
以拟南芥基因组 DNA为模板进行巢式 PCR 扩
增，经 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳得到大小约 1 800 bp
的片段，结果见图 2。测序结果表明，克隆片段大小
为 1 841 bp，与公布的序列相似性为 100%。
08
2011 年第 11 期 邹璐琳等:高效删除标记基因的 Bhlea2 植物表达载体的构建
图 1 表达载体 pLF-Lea2 结构示意图
图 2 PCR扩增 pAB5 启动子
2. 2 表达载体 pLF-Lea2 的鉴定
表达载体 pLF-Lea2 中 rd29A-Bhlea2-nos基因的
PCR和酶切鉴定如图 3 所示，PCR扩增和酶切片段
大小为 2. 5 kb左右，与理论值相符。表达载体 pLF-
Lea2 中，pAB5-Flp-nos片段大小为 3. 5 kb 左右，ubi-
bar-nos片段大小为 2. 7 kb左右，PCR和酶切鉴定均
正确(图略)。将 PCR 与酶切鉴定正确的 pLF-Lea2
再进行序列测定，测序结果表明载体构建正确，可用
于植物基因转化。
3 讨论
3. 1 组织特异性启动子的选择
启动子处于转录调控的中心环节［16］，外源基因
在植物体内的有效表达需要合适的启动子。拟南芥
rd29A基因编码一种与 LEA蛋白相似的亲水性蛋
M． DNA Marker;1，2． PCR扩增结果;3，4．酶切鉴定结果
图 3 表达载体 pLF-Lea2 中 rd29A-Bhlea2-nos
基因的 PCR扩增及酶切鉴定
白，其表达受干旱、高盐及低温的诱导，rd29A 启动
子是上述胁迫下的快速应答启动子，其中含有与
DRE和 ABRE等逆境调控相关的顺式作用元件，响
应 ABA和干旱等环境信号，通常被应用于植物抗逆
境转基因研究工作中［17］。pAB5 启动子是来自拟南
芥花粉、子房以及胚胎发育早期特异性表达的启动
子［18］，该启动子驱动重组酶基因 FLP 表达，从而将
转基因植物花粉或种子中的标记基因删除［19，20］。
3. 2 用单一限制性内切酶连接载体与目的基因
由于原始质粒载体 pLFGN 上可用的酶切位点
少，因此，在与 3 个目的基因片段(rd29A-Bhlea2-
nos、pAB5-Flp-nos、ubi-bar-nos)连接的过程中分别
使用单一的限制性内切酶 EcoRⅠ、KpnⅠ和 HindⅢ
进行连接。当用一个限制性内切酶切开质粒载体
后，需要对酶切后的载体进行彻底的去磷酸化处理，
以避免载体自连。由于目的基因两端也均为同一个
限制性内切酶酶切位点，它与载体连接就有正反两
个方向，对连接后的载体还要进行连接方向的鉴定，
可以使用两个限制性内切酶酶切，一个酶切位点在
载体的一端，另一个酶切位点在目的基因的 1 /3 或
者 2 /3 处，然后根据酶切片段的大小判断连接方向，
必要时可以测序确定。
3. 3 转基因生物安全
随着转基因技术的发展，部分转基因生物相关
产品(如转基因大豆油)已经为人们所熟悉，但是关
于转基因生物安全的探讨一直受到广泛关注。一个
转基因生物产品是否能进入市场，首先要进行转基
18
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
因生物安全评价，而这个安全评价是一个系统而复
杂的过程。为了降低转基因生物风险，简化安全评
价过程，人们开发了各种转基因系统以减少非目的
基因片段所带来的潜在风险。本研究就是同时利用
两套位点特异性重组系统(lox / frt) ，利用 pAB5 启动
子，在花粉及胚胎等发育早期高效率删除标记基因
bar 及重组酶 FLP 等非目的基因片段(图 1，两个
lox / frt之间的部分) ，从而保证在种子中只含有目的
基因表达产物 Bhlea2，从而降低了转基因生物的潜
在风险，为培育耐旱转基因植物奠定了良好基础。
4 结论
本研究克隆了拟南芥的 pAB5 启动子，同时利
用实验室保存的原始质粒，构建了能够高效删除标
记基因的 Bhlea2 植物表达载体 PLF-Lea2。在该载
体中，由 ubiquitin启动子启动 bar 基因的表达，用于
转基因植株的筛选。由拟南芥 rd29A 启动子启动
Bhlea2 基因的表达，检测转基因植株抗旱性的变化。
当 pAB5 启动子启动重组酶 Flp表达时，则将载体上
的 bar等标记基因全部删除，只保留目的基因，为获
得安全性高的转基因植株提供参考。
参 考 文 献
［1］Zambryske P，Joos H，Genetello C，et al． Ti plasmid vector for the in-
troduction of DNA into plant cells without alteration of their normal
regulation capacity． EMBO J，1983，2(12) :2143-2150．
［2］罗克明．一种用于转基因植物安全性控制的高效基因删除系统
“Gene-Deletor”的构建［D］．重庆:西南农业大学，2004．
［3］李文凤，季静，王罡，等．提高转基因植物标记基因安全性策略的
研究进展．中国农业科学，2010，43(9) :1761-1770．
［4］李蓓，单晓，尹小燕，等．单子叶植物的 FLP / frt 位点特异性重组
系统的构建．山东大学学报:理学版，2006，41(6) :149-156．
［5］魏毅东，许惠滨，张建福，等． 转基因植物选择标记基因删除技
术．分子植物育种，2010，8(4) :804-809．
［6］Lauth M，Spreafico F，Dethleffsen K，et al． Stable and efficient cas-
sette exchange under non-selectable conditions by combined use of
two site-specific recombinases． Nucleic Acids Res，2002，30(21) :
115-128．
［7］Luo KM，Duan H，Zhao DG，et al． GM-gene-deletor:fused loxP-FRT
recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or
CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of to-
bacco plants． Plant Biotechnology Journal，2007，5(2) :263-274．
［8］罗克明，赵德刚，Li Yi，等． 一个新的重组酶系统在转基因植物
外源基因删除中的应用．高技术通讯，2005，15(7) :61-66．
［9］ Luo KM，Sun M，Deng W，et al． Exision of selectable marker gene
from transgenic tobacco using the GM-gene-deletor system regulated
by a heat-inducible promoter． Biotechol Lett，2008，30 (7) :
1295-1302．
［10］Lu LT，Liu Y，Zhu YY，et al． Selectable gene auto-exicision via a
cold inducible‘gene deletor’system． African Journal of Agricultur-
al Research，2010，17(5) :2426-2433．
［11］Gidoni D，Srivastava V，Carmi N． Site-specific excisional recombi-
nation strategies for elimination of undesirable transgenes from crop
plants． In Vitro Cell Dev Biol-Plant，2008，44(6) :457-467．
［12］吴仁花，王丽丽，王智，等．复苏植物牛耳草引导蛋白基因的克
隆与表达．自然科学进展，2008，18(10) :1111-1118．
［13］Liu X，Wang Z，Wang L，et al． LEA 4 group genes from the resurrec-
tion plant Boea hygrometrica confer dehydration tolerance in trans-
genic tobacco． Plant Science，2009，176(1) :90-98．
［14］刘霞，邓馨．复苏植物牛耳草 Bhlea2 基因启动子的分离和基因
表达模式研究．自然科学进展，2009，19(1) :39-44．
［15］单晓，李蓓，张举仁．利用 FLP / frt 重组系统产生无选择标记的
转基因烟草植株．生物工程学报，2006，22(5) :744-750．
［16］Lu J，Zhao HY，He YK，et al． Advances and progresses of high pro-
moter research and its application． Natural Science Progress，2004，
14(8) :856-862．
［17］石君，吴忠义，黄丛林，等． 利用 Cre / loxP 系统和 rd29A 启动子
构建诱导型植物标记基因删除载体． 分子植物育种，2009，7
(5) :1040-1044．
［18］Belostotsky DA，Meagher RB． A pollen-，ovule-，and early embryo-
specific poly(A)binding protein from Arabidopsis complements es-
sential functions in yeast． The Plant Cell，1996，8(8) :1261-1275．
［19］赵德刚，吕立堂，贺爱公，等．“外源基因清除”技术(Gene-
Deletor)原理、特点、及潜在应用前景． 分子植物育种，2008，6
(3) :413-418．
［20］安新民，荆艳萍，刘军梅，等．一种消除转基因植物潜在风险的
新技术．中国生物工程杂志，2010，30(2) :115-119．
(责任编辑 马鑫)
28