全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
基因芯片在海洋微藻研究中的应用前景
唐晨 1 田晓玲 1 胡乐琴 1 贾睿 1 徐韧 2 王金辉 2 项有堂 2 何培民 1
( 1上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2国家海洋局东海环境检测中心,上海 200137 )
摘 要: 基因芯片通常指 DNA芯片 ,其基本原理是将大量的寡核苷酸分子固定于支持物上 ,然后与标记的样品进行
杂交 ,通过检测杂交信号从而获取结果。多年来, 我国在医药疾病研究、微生物检测等领域已成功研制出多种基因芯片, 取
得了骄人的成绩,但在对海洋微藻研究的应用上成果较少。现着力从实际应用的角度阐述基因芯片及其在海洋微藻研究
中的应用。
关键词: 基因芯片 海洋微藻 核酸序列检测 应用前景
Application and Perspective of Gene Chip in
M arineM icroalgae Research
Tang Chen
1
T ian X iaoling
1
Hu Leq in
1
Jia Rui
1
Xu Ren
2
W ang J inhu i
2
Xiang Youtang
2
H e Pe im in
1
(
1
College of Fisheries and Lif e Science, Shanghai O cean University, Shanghai 201306;
2
East China Sea Environm entM onitoring C enter, State O ceanic Administration, Shanghai 200137)
Abstrac:t Gene ch ip usua lly re fers to DNA ch ip. Its basic p rinc ip le is that a large num ber o f o ligonuc leotidem o lecu les fix ed on
the support m ater ialw ere first hybr id ized w ith the labe led sam p le, and then the resu lts can be acquired bym ea suring the hybrid iza tion
signa.l Over the years, a v ariety o f gene chips in m ed ic ine, m icrobia l de tection, has been successfully deve loped in China and m any
im press ive ach ievem en ts have been obta ined. H ow ever, the application o f gene ch ips in m ar inem ic roa lg ae has been few repo rted. This
artic le introduced the applica tion and pe rspec tive o f gene ch ip in m arine m icroa lg ae.
Key wo rds: Gene chip M arine m icroa lgae Nuc le ic ac id sequence detec tion Applica tion and pe rspec tive
收稿日期: 20100511
基金项目:上海市优秀学科带头人计划项目 ( 08XD1403700) , 上海市科委国际合作项目 ( 08540702600 )
作者简介:唐晨, 男,硕士研究生 ,研究方向: 海洋生物学; Em ai:l tangch en0423@ gm ai.l com
通讯作者:何培民 ,男,博士, 教授,研究方向 :藻类学; Em ai:l pm he@ shou. edu. cn
随着人类基因组计划的实施以及分子生物学
的快速发展, 基因芯片等一批高新生物技术产品
孕育而生 [ 1 ]。基因芯片是在基因检测、DNA杂交、
测序等传统生物技术的基础上进行创新与拓展,
并集成了照相平板印刷技术、高分子合成技术、探
针固相原位合成技术、激光共聚焦显微技术和精
密控制技术, 使得合成、固定高密度的数以万计的
探针分子以及对杂交信号进行灵敏、准确、实时地
检测分析变得切实可行 [ 2]。该技术已在生命科学
众多领域显示出巨大的潜力与诱人的前景 [ 3 ] , 被
认为是继基因克隆技术、基因测序技术和 PCR技
术后的又一次革命性技术突破 [ 4 ]。如在生物制药
领域、环境医学领域、分子生物学研究领域和医学
临床检验领域就显示出强大的生命力。其中关键
就是其具有集约化、标准化、微型化的特点 [ 5] , 从
而有可能实现 将整个实验室微缩到一片芯片上 !
的愿望。
1 基因芯片
11 概念和原理
基因芯片 ( gene chip)属于生物芯片的一种, 又
称 DNA芯片 ( DNA chip)、DNA微阵列 ( DNA m i
croarray)或寡核苷酸微阵列 ( oligonucleo tide m icroar
ray) ,实际上就是以特定的排列方式固定有大量寡
核苷酸、cDNA或 DNA片段的载体。这一概念最早
2010年第 11期 唐晨等: 基因芯片在海洋微藻研究中的应用前景
由美国的 A ffymetrix公司提出, 并依此研制出世界
上第一块基因芯片。其原理是根据核酸的分子杂交
衍生而来,它将众多具有特异性的寡核苷酸片段或基
因片段按照一定方式规则地固定于玻璃片、硅片、陶
瓷等固相支持物表面,再与待测的且已被标记的核酸
样品按照碱基互补配对原则进行杂交,然后通过特定
的检测系统检测杂交信号,并借由计算机设备进行分
析和处理,从而高效快速地得到试验信息 [ 6]。
12 基因芯片的特性
这一技术明显的特性就是将生物化学分析系统
进行微缩,集中分析实现高通量、连续、高效且快速
的检测过程,大大缩减了试验时间, 减少试剂消耗。
例如, 在一张面积为 2 ∀ 4 cm2的芯片载体上,可以固
定数量高达 8 ∀ 103个基因探针 [ 7] , 可一次性对大量
分子进行检测分析; 并且, 基因芯片还具有高灵敏
性、高准确性、载体坚固且耐高温、可对基因表达进
行定性和定量分析、检测靶分子种类多等特性。此
外,芯片制作及对样品的分析、杂交洗片等过程都可
实现自动化,工作效率大幅提高 [ 8]。这些优势极大
地推动了芯片技术的产业化进程, 吸引了来自全世
界研究者的目光,获取了政府、商界的大量政策和资
本支持。
13 芯片的分类
基因芯片大体可分为微阵列芯片和微流控芯片
两种。微阵列芯片又包括固相微阵列芯片和液相微
阵列两种。
131 固相微阵列芯片 固相微阵列芯片是指按
照一定密度将生物信息分子 (如基因片段、cDNA片
段或多肽、蛋白质 )固定在固相载体上的微阵列,阵
列中每个分子的序列及位置都是已知的, 并已预先
设定好序列点阵。它的应用较广,横跨众多领域,商
业化程度也最高。一般认为固相微阵列芯片即为基
因芯片。它也可细划为几种类型。
按照载体上所固定的探针长度来划分, 可分为
cDNA芯片和寡核苷酸芯片两种 [ 4]。 ( 1) cDNA芯
片:由 Schena建立,将特定的 cDNA经 PCR扩增后
借助机械手直接点到基片上。 ( 2)寡核苷酸芯片:
分为长寡核苷酸芯片和短寡核苷酸芯片两种, 首先
由 Fodor报道,是利用照相平板印刷术和固相合成
技术在基片上生成寡核苷酸。与 cDNA芯片制作的
一个主要不同点是, 它需多一步转录获得 cRNA的
过程。
按照芯片使用功能和用途来划分, 可分为测序
芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片等 [ 8, 9]。
测序芯片是对大量目的基因进行快速分析。基因表
达芯片是将大量的具有特异性的寡核苷酸或 cDNA
片段固定在一块 DNA 芯片上, 对不同来源及不同
时期等情况下的材料细胞内的 mRNA 或反转录后
产生的 cDNA进行检测,从而对这些基因表达的个
体特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和
判断,迅速将某个或某几个基因与疾病联系起来,极
快地确定这些基因的功能, 同时可进一步研究基因
与基因间相互作用关系。
按照载体基质不同来划分,可分为无机片基基
因芯片和有机片基基因芯片 [ 9]。无机片基基因芯
片, 是指其基质基片为无机物,如玻璃、硅片等;有机
片基基因芯片,是指其基质基片为有机物, 如凝胶、
尼龙膜等。
132 液相微阵列芯片 最近几年,新开发出一种
利用微球体作为探针载体, 在液相环境中进行杂交
反应,并结合流式细胞仪检测的微阵列芯片,称作液
相阵列芯片 ( liqu id ch ip) , 或悬浮芯片 ( suspension
array)。其原理是通过两种不同颜色的荧光染料,
按照不同浓度将微球体染色。微球表面都带有活性
羧基化基团,可与氨基标记的核酸探针共价耦联形
成复合体 [ 10 ]。检测时, 复合体与待测物特异性结
合。运用光电转换和数字信号处理技术,通过一束
激光识别微球所产生的特异性荧光, 以确定微球类
型, 进而确定待测物种类;另一束激光识别微球表面
发生杂交反应后产生的荧光信号强度,从而决定待
测物的量 [ 11 ]。这类芯片可同时检测成百上千的蛋
白质和核酸靶分子 [ 12] , 具有快速、敏锐及特异性分
子分析的能力。且克服了固相微阵列芯片点样时容
易发生点样错位、耗时、平行等量加样困难、加样头
反复加样易发生样本间污染、重复性差等缺点 [ 13] ,
操作更为简单, 准确度更高。在疾病诊断 [ 14]、病原
微生物检测 [ 15]、给药系统研究 [ 16]等领域有着广泛
地应用潜力。
微流控芯片是通过微细加工技术将微通道、
微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件窗口和
73
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
连接器等功能元件像集成电路一样, 使它们集成
在芯片材料上的微全分析系统 [ 17 ]。最初是利用其
毛细管及渗流作毛细管电泳分析, 但随着 MESM
(微型机电系统 )、LIGA ( X光深层曝光微电铸复
制技术 )和纳米技术等的引入 [ 18] , 其应用范围得
到快速拓展。尤其是 Bu rns等 [ 19 ]研制出第一块多
系统集成芯片后,该技术得到足够重视, 相关产业
发展迅猛。 Labona ch ip (芯片实验室 )是微流控
芯片发展的趋势, 也是生物芯片技术发展的最终
目标 [ 20]。它将整个生化检测分析过程缩微到芯片
上, 集全功能性、自动化、便捷、高效等特点于一
体, 是最理想的生物芯片。部分生物芯片公司已
经开发出第一代芯片实验室, 但实际应用并未达
到预期效果。相信在未来, 芯片实验室技术会越
发成熟,应用覆盖面也会更广。
2 基因芯片在海洋微藻研究中的应用前景
在我国, 基因芯片在海洋微藻领域的应用研究
还未见报道,但其在海洋微藻物种鉴定、基因遗传多
样性分析、活性物质筛选等方面却具有广阔的应用
前景。
21 在海洋微藻分类与鉴定研究方面的应用
分类与鉴定是整个生物学研究的基础。传统的
分类鉴定方法主要以形态鉴定为主, 需借助显微镜
对藻体显微结构进行观察,该方法具有一定局限性。
以共生甲藻属藻为例,因适应共生生活的需要,其细
胞形态特征改变或丧失, 这使得对该属藻体的形态
学鉴定工作变得非常困难 [ 21]。虽然用电子显微镜
观察质体 ( plastid)和细胞核的超微结构对鉴定工作
有一定帮助,但由于这些特征往往经常变化或难以
观察清楚而限制了其应用。至今, 共生甲藻属中只
有 4个种得以确认 [ 21]。另外也有多个共生种仅仅
被命名,但并未有具体的特征描述。也曾有研究人
员提出,可对有壳甲藻的甲片进行处理 [ 22 ] ,使其结
构在光镜下清晰呈现,得以识别。但该方法操作复
杂,适用性也偏小。分子生物学技术的快速发展,使
得分析不同分类阶元的系统发生关系成为可能。相
对于形态学性状而言,分子性状不仅是前者的补充,
而且具有能较客观准确地反映生物类群之间的系统
发生、易于定量化等优点 [ 23]。不过分子生物技术也
存在操作复杂、费用较高、现场检测效率低等问题,
尤其面对赤潮灾害,还无法建立快速准确的分子预
警机制。基因芯片就可突破这个瓶颈,能在现场展
开实时分类和鉴定。
近几年,国外已有研究人员成功研制出相关的
基因芯片。如 G escher等 [ 24 ]研制出一种用于监控和
鉴定亚历山大藻的基因芯片 # # # ALEX芯片。他们
使用针对亚历山大藻属部分藻株已经公布的 18S
rDNA和 28S rDNA序列而设计的特异性探针, 制作
成固相芯片,分别对纯培养的藻液及海水样品进行
检测。值得注意的是,他们分析结果后发现,部分公
开的特异性探针无法在芯片上发挥功效,这可能是
受到现有技术的缺陷等因素所致。Ahn等 [ 25]利用
芯片对多种赤潮藻进行鉴定。我国研究人员经过多
年的努力,已经为基因芯片的研制打下了坚实的基
础。他们研究了我国海域内的棕囊藻 [ 26]、赤潮异弯
藻 [ 27]、亚历山大藻 [ 28 ]、利玛原甲藻 [ 29] 等藻类的
rRNA基因、产毒基因,获取了特异性基因序列的信
息。部分特异性基因序列也被成功研制成基因探
针 [ 30, 31] ,在对实地水样的检测时取得了不错的效
果。相信随着众多藻体的特异性表达基因不断被发
现, 基因芯片的应用将更广泛,对藻株的分类与鉴定
的时间也将大大缩短。
22 在遗传多样性分析与基因突变方面的应用
海洋微藻数量巨大、种群繁多、多样性程度高。
利用基因芯片来检测遗传多样性,突显快速、高通量
且准确的优势, 尤其是使用芯片实验室 ( Labona
Ch ip)。它将分子杂交、显影等步骤微缩至同一块芯
片上进行,实现反应流程化、衔接快速化,真正意义
上达到自动、智能处理分析样品和结果。此外,基因
芯片还可以准确地确定突变位点和突变类型, 同时
检测多个基因乃至整个基因组的突变 [ 32] , 对发现新
藻株和经济藻类选育有所帮助。
23 在海藻基因差异性表达上的应用前景
基因芯片技术可以直接检测 mRNA 的种类及
其丰富度, 因而成为研究基因表达的有力工具 [ 5]。
然而,基因表达受到外界环境和内在环境双重影响。
在不同的环境条件下,基因表达的效果存在一定差
异。如在有毒赤潮生物产毒机制的研究中, 研究人
员可借助基因芯片便捷直观地分析产毒基因在外界
环境及内在生理变化等因素影响下的差异性表达,
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2010年第 11期 唐晨等: 基因芯片在海洋微藻研究中的应用前景
以致弄清产毒机制。然而, 现阶段研究者还停留在
对环境因素变化致使生理变化 (即产毒与否 )的研
究上。虽然能推测出一些结论,但并不具有足够的
说服力。这仅仅从表象得出结论, 忽略了产毒的实
质源自特定基因的操控。
24 在海藻活性物质筛选方面的应用
海洋微藻内含有在代谢过程中产生的大量活
性物质,具有很高的应用价值。如蛋白质, 许多微
藻体内的蛋白含量达到 60%以上, 营养价值颇高,
可作为营养保健食品 [ 33] , 螺旋藻等就已在许多国
家实现产业化生产;藻胆蛋白, 在蓝藻等藻类体内
含有,具有荧光特性, 免疫学上常被制成荧光探
针 [ 34] ;多不饱和脂肪酸 ( PUFA s) , 包括长链不饱和
脂肪酸 EPA (二十碳五烯酸 )和 DHA (二十二碳六
烯酸 ) , 它们对婴幼儿大脑发育及成人心血管疾病
治疗和预防有一定的效果 [ 35] , 金藻中的 PUFA s含
量几乎占到其脂肪酸总量的 1 /2[ 36] , 对这些活性
物质进行筛选,开发相关产业, 可为人类提供更多
更广的生活物资。传统的方法耗时长、效率低, 如
运用基因工程技术转移调控特定物质产生的基因
至细菌中表达, 其中筛选特定基因就需花费大量
时间。基因芯片因其快速、高通量等特点, 有着显
著优势,单从筛选特定基因上看就可节省不少时
间。如 cDNA芯片便可用于筛选反义寡核苷酸类
药物 [ 37]。
3 基因芯片在海藻研究中存在的问题及
展望
基因芯片技术是一种高效、快速的核酸分析手
段,它的出现给细胞生物学、分子生物学领域带来了
新的革命,也为海洋微藻的研究提供了崭新的思路,
笔者认为目前影响基因芯片在海藻研究中广泛应用
的主要因素有: ( 1)目前人类对海洋微藻的分子生
物学研究还不够深入和全面,海藻基因信息少,甚至
不少藻种的基因信息为空白,芯片的使用范围受到
限制; ( 2)部分探针的特异性不高, 检测结果不尽人
意; ( 3)基因芯片造价昂贵, 虽然操作简单方便, 但
从商业成本上考虑,实用性不如传统技术; ( 4)芯片
的制作工艺还不成熟,存在一定的缺陷。但从长远
来看, 基因芯片的优势明显,前景喜人。相信随着芯
片技术的不断成熟, 人类对海洋微藻的研究更加便
捷, 也更加广泛。
参 考 文 献
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(下转第 86页 )
75
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
量,裂解液中加入 05%的两性电解质,并放置盐桥
可获得较好的等电聚焦效果。适当延长平衡时间,
应用 8% - 16%的梯度胶进行第二向电泳可达到较
好的分辨效果,此体系的试验结果有较好的重复性。
致谢:本文的实验工作是在匈牙利科学院生物研究中心,
匈牙利塞格德大学生物技术系和农业部都市农业 (北方 )重
点开放实验室完成的 ,在此表示感谢。
参 考 文 献
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