全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第4期
收稿日期:2008-02-27
作者简介:刘俊杰(1982-),女,硕士,主要从事蔬菜设施生理研究;E-mail:jweixiaochun@yahoo.com.cn
通讯作者:史为民(1970-),男,博士,副教授,从事设施生理生态研究;E-mail:shiweiminhh@yahoo.com.cn
随着分子生物学的发展和基因工程的广泛应
用,带动了许多新技术的创立,如近几年建立的
PCR、RFLP、DDRT-PCR等技术以及反义技术与离
体定向诱变相结合的蛋白质工程等。在基因工程的
研究与实践中,了解基因功能及其表达调控并人为
地加以利用则是一个关键。近些年迅速发展起来的
反义技术就是从反义遗传学的角度来探索基因的
结构、功能和改造等。
1 反义基因技术的概念
反义基因技术的基础是根据核酸杂交原理设
计针对特定靶序列的反义核酸,从而抑制特定基因的
表达,包括反义 RNA、反义 DNA及核酶(Ribozyme),
它们通过人工合成和生物合成获得。
1.1 反义 RNA
根据反义 RNA的作用机制可将其分为 3类:I
类反义 RNA直接作用于靶 mRNA的 SD序列和
(或)部分编码区,直接抑制翻译,或与靶 mRNA结
合形成双链 RNA,从而易被 RNA酶Ⅲ降解;Ⅱ类反
义 RNA与 mRNA的非编码区结合,引起 mRNA构
象变化,抑制翻译;Ⅲ类反义 RNA则直接抑制靶
mRNA的转录。
1.2 反义 DNA
反义 DNA是指一段能与特定的 DNA或 RNA
以碱基互补配对的方式结合,并阻止其转录和翻译
的短核酸片段,主要指反义寡核苷酸,因更具药用
价值而倍受重视。
1.3 核酶(Ribozyme)
核酶(Ribozyme)是具有酶活性的 RNA,主要参
加 RNA的加工与成熟。天然核酶可分为 4类:(Ⅰ)
异体催化剪切型,如 RnaseP;(Ⅱ)自体催化的剪切
型,如植物类病毒、拟病毒和卫星 RNA;(Ⅲ)第一
组内含子自我剪接型,如四膜虫人核 26SrRNA;
反义基因技术及其在植物研究上的应用
刘俊杰 魏小春 齐树森 史为民
(石河子大学园艺系,石河子 832000)
摘 要: 介绍了反义基因的概念、分子生物学基础以及作用原理,对反义基因技术及其在现代植物研究中的应用
进行了概述。反义基因在调控果实成熟、改良作物品质、获得作物雄性不育系、改变植物花色、增强植物抗病性和研究未
知基因的功能等方面具有重要的作用。并对反义基因技术的应用进行了展望。
关键词: 反义基因 作用原理 基因调控 应用研究
AntisenseGeneTechnologyandItsApplication
inthePlantResearch
LiuJunjie WeiXiaochun QiShusen ShiWeimin
(HorticultureDepartment,ShiheziUniversity,Shihezi832000)
Abstract: Introducedimportanceofantosensegenecharacteristicsandprincipleandbio-molecularbaseofanti
genetechnology,otherwiseitsapplicationintheplantresearchiscovered.Antisensegeneplayagreatroletoincrease
cropresistantstorage,betercropquality,getmale-sterileplantsinfertilityrestoration,changeflowercolour,enhanceplant
diseaseresistance,andresearchunknowngeneetc.Meanwhile,theapplicationofantisensegenetechnologyisprospected.
Keywords: Antisensegene Actionmechanism Generegulation Applicationresearch
2008年第4期
(Ⅳ)第二组内含子自我剪接型。
2 反义基因的分子生物学基础
近年在研究基因表达调控中发现,除了人们普
遍熟悉的基因调控是通过蛋白质与核酸的相互作
用机理外,还有一些 RNA分子专一地参与基因表
达的调控,即反义 RNA分子,反义 RNA的调控是
一种新的基因表达调控机制,它是核酸对核酸的相
互作用。进一步研究证实,这些反义 RNA分子是以
DNA的非模板链为模板指导合成的,但这类反义
RNA分子并不能象 mRNA那样,结合上核糖体,翻
译出蛋白质,而是以 RNA分子形式存在并与靶基
因转录的 RNA(包括 mRNA)分子,通过碱基互补,
形成复合体,从而影响了 RNA的剪接、加工以及与
核糖体的结合,阻止了 mRNA正常的转译和表达,
导致靶基因特异性抑制或产生下向调节效果[1]。因
此,从基因调控上看,这种反义 RNA分子亦可称干
扰 mRNA的互补 RNA(micRNA)。
反义 RNA理论与技术的形成和发展是基于原
核生物中天然存在的反义 RNA及其调控机理的研
究而发展起来的。Tomizawa等首先报道了反义
RNA的分子生物学功能,他们在研究 E.coli的
ColEI质粒复制时,发现到反义 RNA对质粒复制有
调节作用。此后在其它质粒复制[2]、转座子 Tn10、λ-
噬菌体、大肠杆菌基因组均发现有反义基因存在,
表明反义 RNA是原核生物中广泛存在的一种调节
因子,对细菌或噬菌体的基因表达、质粒复制等起
调节作用。在真核生物体内尚未发现天然存在的反
义 RNA,显然也包含植物中不存在天然反义 RNA,
尽管在大麦胚乳细胞内也观察到反义 RNA转录
物。这启示人们利用重组 DNA技术人工构建反义
基因系统调节生物(包括植物)体内的基因表达是
可行的。
现代植物基因工程对于怎样产生或利用反义
RNA已取得重大进展。人们只要将一个不含启动
子的基因或片段的 3′末端以相反的方向接上一个
启动子,然后导入到植物基因组中,就可产生反义
RNA,以抑制植物内源基因组上相应的基因表达,
产生反义 RNA的基因或片段相应地称为反义基
因。理想的反义 RNA分子应该与靶基因的 mRNA
分子具特异互补性,当两类 RNA同时存在时,形成
反义 RNA:mRNA复合体,阻止了 mRNA的翻译,造
成特定基因表达失活或沉默。反义 RNA导致的基
因沉默主要是转录后水平的基因沉默,是否在在转
录水平上发生基因沉默,还值得研究。
3 反义基因技术的作用原理
反义 RNA是通过靶 RNA进行碱基配对结合
的方式参与有关的基囚表达的调控(图 1)。目前推
测的反义 RNA作用方式有与 mRNA结合形成的二
聚体阻断了核糖核蛋白体同 mRNA的结合,从而达
到了阻断翻译的目的;与 mRNA的结合阻断了
mRNA向细胞质的运输;与 mRNA的结合使得
mRNA易被酶识别而降解。目前尚不清楚是否还有
其它的作用方式存在。
常见的获得反义 RNA的方法与基因工程方法
相同。首先,以 mRNA为模板合成互补配对的一条
DNA链,然后以合成的互补 DNA为模板合成互补
配对的另一条 DNA链,此双链 DNA片段就是目的
基因片段,将目的基因片段反向插入适当的载体
中,然后将重组载体导入细胞,当重组载体基因表
达时,由于是反向插入。因此,启动子引导的不是目
的基因的转录,而是与目的基因互补配对的反义基
因的转录,从而得到反义 RNA,在实际应用中,构
建的反义基因常常只是目的基因的 5′端与 3′端的
部分互补碱基配对序列,但长度一般至少要大于
50bp。
4 反义基因技术在植物研究中的应用
参与基因表达调控的反义 RNA最初是在原核
生物中发现的。20世纪 50年代发现了 mRNA、
tRNA、rRNA;60年代末期,Ogrel,Crick等提出了生
命起源的 RNA学说;1975年哈佛大学 Zamecnik等
利用一段 13个碱基序列的反义 DNA成功地抑制
了 Rous肉瘤病毒(RSv)的复制,引起人们极大的关
注。1982年以后,Cech、Altman以及 Noler等人,证
图 1 反义 RNA基因抑制作用的基本原理
刘俊杰等:反义基因技术及其在植物研究上的应用 79
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
实了 RNA的催化作用,RNA学说才引人注目。1983
年 Mizuno等及 Simons和 Kleekner同时发现反义
RNA的调节作用,从而揭示了一种新的基因表达
调节机制。关于反义 RNA技术的研究开始也集中
在原核生物,直到真核生物自然反义系统的发现,
特别是 Izant等[3]首次证实人工构建的反义寡核昔
酸在真核生物中具有生物学效应以来,反义技术在
真核生物中的研究才得以迅速发展。随其研究而发
展形成的反义技术提供了一种更为直接有效的人
为控制基因表达的方法而倍受生物学界关注。
4.1 调控果实成熟
利用 DNA重组技术,人工构建反义基因与反
义 RNA系统,调控生物体内特定基因的表达进而
延长植物果实贮藏保鲜,已成为果蔬贮藏保鲜研究
工作中最活跃的领域之一。Hamilton等[4]首次通过
表达 pTOM13的反义基因降低了番茄的乙烯生物
合成,使转基因果实的成熟期延迟。Oeler[5]把番茄
ACC合成酶反义基因导入番茄果实,转基因植株乙
烯合成严重受阻,在表达反义 RNA的纯合子果实
中,乙烯合成 99.5%被抑制,不出现呼吸高峰,在大
气或植株上保存 90~120d,不变红变软,只产生桔
黄色,只有经外源乙烯处理后果实才成熟变软,表
现出正常番茄的颜色和风味。此后,Atkinson等都
得到了转基因的番茄植株,转基因番茄也成为利用
反义技术控制果实成熟最成功的例子。另外,王春
霞等[6]采用番茄 ACC合成酶反义与正义基因对西
瓜的转化研究表明,反义基因可以抑制西瓜果实中
乙烯的释放。张智俊[7]等将 ACC脱氨酶基因转入哈
密瓜中,获得了转化植株,延长了哈密瓜果实的贮
藏期和供应期。Ayub等[8]采用 ACC氧化酶反义基
因表达技术来调节甜瓜果实成熟,也获得成功。同
时,与果实成熟相关的基因工程研究在果树领域也
日渐深入。Scoria.R等[9]成功地获得了导入 ACC氧
化酶反义基因的转基因桃植株。宋喜贵等[10]把番茄
ACC合成酶反义基因转导到称猴桃中,获得了内源
乙烯受到抑制的转基因植株。何业华等[11]又把 ACC
合成酶反义基因转化到枣树中,获得了反义 ACC
基因在转化体中得到表达的转基因植株。Maria等[12]
也报道用 ACC合成酶反义基因处理显著降低花椰
菜采后 50h乙烯的合成量,呼吸作用显著降低,这
有助于采后花椰菜的贮存和运输。徐晓峰等[13]通过
ACC氧化酶反义基因转化青花菜的研究,结果表明
乙烯的合成受到了不同程度的抑制。寇晓虹等[14]将
多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因转化加工番茄果
实饱满有光泽;Northern杂交结果表明,转反义 PG
基因加工番茄果实外果皮 PG基因表达水平比对
照低。转基因植株的表型观察和分子检测结果相吻
合。目前,有关的研究工作仍在继续进行,并已扩展
到了草莓、梨、苹果、香蕉[15,16]、芒果、康乃馨[17]、甜
瓜[18~21]、中国樱桃[22]和桃[23],目的基因片段也扩展到
了编码多聚半乳糖醛酸酶,纤维素酶和果胶脂酶的
基因。因此,反义 RNA技术在利用植物基因工程手
段进行果蔬保鲜中具有广阔的应用前景。
4.2 改良作物品质
随着生活水平的提高和科学技术的进步,人们
对稻米等粮食作物食用品质的要求也越来越高。利
用反义 RNA技术就可以通过对 waxy基因的遗传
操作降低水稻生物体内特定基因表达水平,来控制
水稻中直链淀粉的合成,从而改变其在胚乳中的相
对含量,达到改良稻米淀粉品质和食用品质的目
的,培育优质水稻新品种。邹良平等报道利用农杆
菌介导法将反义 waxy基因导入水稻得到了部分转
基因植株的 Tl代种子中的直链淀粉含量有不同程
度的下降,最低的己下降至 6.3%,与对照相比下降
了 9.8%。吴方喜等[24]通过对 rbel正、反义基因改变
釉稻直链淀粉含量的研究,转 rbel正向表达结构的
明恢 81直链淀粉含量总体上明显下降,转 rbel反
向表达结构的明恢 81直链淀粉含量总体上明显上
升。高方远等[25]导入反义 Wx基因改良杂交籼稻保
持系直链淀粉含量。Visser等[26]首先在马铃薯上成
功地应用内源 GBSS反义基因抑制了 GBSS基因的
的表达,降低了 GBSS活性的 70%~100%,完全的
抑制可得到不含直链淀粉的淀粉。在马铃薯中导入
外源 GBSS基因的反义基因获得了类似的结果。陈
春艳等[27]构建了 Patatin、Wun1启动子驱动的 PPO
反义基因植物的表达载体,表达载体的建立为获得
地上部分 PPO活性正常、块茎损伤低褐化的马铃
薯加工型改良品种奠定了基础。成娟等[28]在对低温
条件下转 AcInv反义基因马铃薯品系后发现随着
低温贮藏时间的延长,各转基因品系块茎中干物质
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含量变化不大,淀粉含量虽有下降但较为平缓;转
基因品系中的还原糖含量增加幅度比受体品种的
明显降低,转 AcInv反义基因的 “甘农薯 1号”和
“大西洋”块茎抗低温糖化能力明显高于未转 AcInv
反义基因的品系。周苏玫等[29]将外源 Trxs基因导入
小麦 89500,结果表明,00T89转基因株系与对照同
步发育,生育期相近,但是产量、单粒重等都明显增
加。
在谷物中的抗原蛋白是食物中重要的抗营养
因子之一,常导致过敏和腹泻,因此降低谷物中抗
原蛋白的含量是谷物品质改良的重要目标。Yuichi
等[30]报道用反义技术得到了抗原蛋白(14~16Dka
抗原)含量大量降低的转基因水稻。Yoshiyuki等[31]
尝试用水稻谷蛋白 A(GlutelniA)反义基因技术降
低稻谷中谷蛋白含量,结果在 T2和 T4代植株中谷
蛋白含量大量降低,同时检测发现谷蛋白 AmRNA
含量相应降低;后续研究发现转基因稻谷的酿造性
能得到了改善。Curtis等报道采用 Gigantea(GI)反
义基因转化处理小萝卜,成功得到了花期延迟,产
量提高的萝卜新品系。
植物油是人类主要的脂类来源之一,植物油的
组分因多是含有双键的不饱和脂肪酸,故在室温下
多呈液态,易氧化酸败。因此,需要进行催化加氢加
工,改变其熔点等性质;但使得成本升高,并且导致
顺式双键转变为反式双键,而后者被认为对健康不
利。Knutzon等[32]己成功地在芜著(Brassicarapa)和
甘蓝型油菜(Brassicanapus)中导入了抑制硬脂酞-
ACP脱饱和酶基因表达的反义基因,并得到了表
达,使得在贮藏脂类生物合成期间,转基因植株种
子中该酶的活性大大降低,油菜种子中硬脂酸的含
量从原来的 2%提高到了 40%。石东乔等[33]构建了
包含反义 Fadz基因(油酸脱饱和酶基因)的表达载
体转化油菜,以期获得高油酸含量的油菜新品系。
陈锦清等[34]也构建了含有丙酮酸梭化酶(PEP)基因
反义片段的表达载体转化油菜,以期使油菜油脂/
蛋白质含量比率向高油脂转化。张承妹等[35]利用高
效农杆菌遗传转化系统将 ACP反义基因片段导入
油菜;PCR和 GUS染色结果表明抗性植株中有
60%的植株含有导入的目的基因。这为油菜籽脂肪
酸遗传改良提供了一种新的方法。
反义基因技术抑制毒素合成,因为反义基因可
以专门影响特定基因的表达,所以被用来抑制某些
不需要的基因。例如,棉花种子中的棉毒素和油菜
种子中的硫昔类次生代谢物的存在,严重影响了这
些高蛋白资源的饲用价值。合成相关反义基因抑制
其关键合成酶基因的表达,可望得到无毒素的转基
因植物。此外,目前正在进行的有开发前景的项目
还有:利用反义 RNA技术增加植物对除草剂的抗
性;转基因植物中标记基因及选择标记的封闭;增
加植物体内蔗糖含量;抑制尼古丁合成酶基因的表
达;降低木质素的含量,改变烟草或树木的加工特
性;获得不含咖啡因的咖啡豆[36]等许多方面。
4.3 获得作物雄性不育系
雄性不育系(母本)对提高作物杂交育种效率
和效果有非常重要的作用;是作物杂交育种的技术
关键,常规的方法很难得到。目前,用反义 RNA技
术来获得雄性不育的转基因植株,或恢复植株的雄
性育性的研究工作在不同植物中取得了积极的成
果,对在杂交种子生产中的应用提供了重要的技术
支持。Vain等首先报道了在矮牵牛属(Petunia)中,
反义 RNA的表达在抑制了黄酮类色素的生物合成
的同时,也导致了转基因植株表现出雄性不育的特
征。已有报道指出,在马铃薯和烟草中 rolC基因的
过度表达导致了雄性不育。Vander等[37]将 CaMV35S
启动子与花药盒串联,具有绒毡层特异性,与 CHS
的反义 RNA基因构成嵌合基因,转化矮牵牛,反义
基因在花药中表达,抑制了 CHS的合成,阻碍了花
粉的发育,得到了雄性不育植株。Schmuling等应用
反义 RNA技术获得了含有反义 rolC基因的转基因
烟草植株,其与含 rolC基因的植株杂交后得到的杂
交种子的雄性育性得到了恢复。现己发现了专一地
在花药绒毡层细胞中表达的启动子,将这些具有组
织专一性的启动子同反义基因或编码裂解酶(如蛋
白酶、糖昔酶、核酸酶等)的基因以及适当的标记序
列连接后再导入植株,可获得雄性不育的转基因植
株,并应用于杂交种子的生产中。Zabaleta等[38]将
atp9基因转入烟草,也得到了雄性不育的转化植
株;另外,他们还将反义 atp9基因转入烟草,也得
到了转化植株,而且,将分别含有正义和反义 atp9
基因的转化植株杂交,所得到的后代育性得到了恢
刘俊杰等:反义基因技术及其在植物研究上的应用 81
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
复。陈建南等[39]将玉米热击蛋白 HSP70的反义 RNA
注射高粱,反义 RNA进入可育系花粉后,抑制了花
粉的形成,使可育花粉变成了不育花粉。Hiroyasu
等[40]报道用反义技术得到了雄性部分不育的转基
因烟草植株。余小林等[41]构建反义 CYP86MF基因
植物表达载体并对白菜的转化后发现获得了 130
多株转化再生植株。刘乐承等[42]构建了 BcMF3反
义基因植物表达载体并对拟南芥进行了遗传转化,
结果表明外源基因单一位点插入受体。黄科等[43]利
用 CYP86MF反义基因转化获得青花菜雄性不育植
株。这些研究都揭示进一步利用反义技术提高作物
杂交育种的效率具有广阔的前景。
4.4 改变植物花色
植物的花色在园艺和商业上有重要价值,改变
花色一直是园艺学家们孜孜以求的目标。研究表明
许多植物花的颜色与类黄酮有关,苯基苯乙烯酮合
成酶(CHS)是类黄酮生物合成中起关键作用的酶;
这为利用基因工程调控花色提供了理论依据。
Vander等[44]将 CHS的 cDNA反向连接于 CaMV的
35S启动子上,再连接双元载体 Bin19转化矮牵牛,
使花色由紫红色变为粉红色并夹有白色,有些花朵
完全呈白色。Vain等在矮牵牛属(Peutnia)植物和烟
草中已成功地应用反义 NRA技术抑制了 CHS基
因的表达,使得在转基因植株中的花冠颜色发生改
变,并且颜色的改变是由 CHS基因的表达的程度
决定的。Courthey-Guterson和Napoli[45]将菊花(Dendra
nthemagrandiflorum)中分离的 CHS基因以反义和
正义方向插入粉红色的菊花品种的基因组中,结果
在正义和反义转化植株中都得到了白花或极浅的
粉红色花,而对照没有出现白花植株,而且还发现
转基因植株的白花性状通过营养繁殖能够稳定遗
传而不影响其他性状的表达,这为园艺学育种提供
了一条新途径。Mitiouchkina等报道用查耳酮合成
酶反义基因处理菊花,得到了更浅花色的转基因菊
花植株。在爱尔兰的研究表明:夏荃花颜色的形成
是花色素普与辅助颜料如黄酮和黄酮醇等形成复
合物的结果,复合物越多花色就越趋向蓝色。
Ryutaro等[46]报道向夏荃转化进入 2-氢黄酮醇-4-降
解酶反义基因,结果使 2-氢黄酮醇-4-降解酶基因
失活,黄酮积累,花色更蓝。Amir等[47]用反义技术抑
制康乃馨中的黄酮-3-轻化酶基因的表达,所得到
的转基因植株的花色变浅(野生的橘红色变浅红或
白色),而花香更加浓郁。该项研究工作具有可观的
潜在商业价值。
4.5 增强植物抗病性
反义技术的建立扩展了机体抵御外来微生物
的经典免疫学概念,利用反义 RNA技术来阻断细
菌、病毒在细胞中的复制,20世纪 80年代末期开
始应用于植物抗病的研究。其原理概括就是选择细
菌、病毒复制过程中的关键基因作为靶基因,利用
反义技术将其反义基因或片断转化进入植物细胞,
并使其转录的 RNA结合靶基因的 mRNA,使靶基
因不能正常表达,从而达到干扰抑制细菌、病毒复
制,提高植物抗病能力的目的。经过不断完善,反义
技术在植物抗细菌、病毒的研究中得到了广泛地利
用,己经取得了积极的效果。Andrzej等[48]报道用土
豆卷叶病毒(RNA病毒)壳蛋白反义基因转化的转
基因土豆,使壳蛋白反义基因的表达 mRNA,选择
性结合病毒壳蛋白 mRNA,干扰甚至抑制病毒在细
胞中的复制;这样土豆就对土豆卷叶病毒获得了免
疫力。而 Randles等[49]等在紫花苜蓿抗花叶病毒 N20
的抗病育种中,利用壳蛋白反义基因转化紫花苜
蓿,也获得了对花叶病毒 N20有抗病力的转基因紫
花苜蓿。
目前,有关的研究工作仍在继续进行,随着反
义 RNA作用机制的进一步阐明,目的基因片段的
正确选择,专一表达的、高效的启动子的发现,有可
能在应用反义 RNA技术于植物抗病毒基因工程方
面取得新的突破。另外,反义 RNA技术也为探讨病
原菌的致病机理提供了一条新途径:Vitor等[50]等发
现紫花首楷炭疽病病原菌(Coletotrichumtrifoli)在
侵入紫花苜蓿组织时,其分泌的钙调蛋白/Calmoduli
(参与细胞信号传导)发挥了重要作用;通过钙调蛋
白反义基因转化处理得到的转基因的紫花首楷炭
疽病病原菌,对苜蓿植株丧失了致病性。这进一步
揭示了炭疽病病原菌的致病机理,为以后开展抗病
研究提供了方向。秦余香等[51]根癌农杆菌介导大麦
Mlo反义基因转化小麦,成功获得转基因植株,为
进一步获得生产上可以利用的抗白粉病小麦新品
系奠定了基础。于占东等[52]对 TuMV-Nib反义基因
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遗传转化大白菜研究后经 PCR-Southern杂交、RT-
PCR及 ELISA检测,证明外源 TuMV-Nib基因已整
合到大白菜核基因组中并获得了表达。
4.6 研究未知基因的功能
1992年 Mueler-Roebe等试图分析是否腺苷二
磷酸葡萄糖(ADPG)是马铃薯块茎中淀粉生物合成
的单一前体。ADPG焦磷酸化酶(ADPGase)催化葡
萄糖-1-磷酸和 ATP合成 ADPG,利用反义 RNA技
术,在转基因植物中有效地抑制了 ADPGase基因,
块茎中几乎没有淀粉,这表明淀粉的生物合成被阻
止了,相反的这些块茎干物质中含有过量的蔗糖和
葡萄糖。1991年英国的研究者 Bird等在研究与西
红柿成熟相关的未知基因功能时成功地应用了反
义 RNA技术。他们构建了成熟相关基因 cDNA
pTOM5的反义基因系统,对表达反义 RNA的转基
因植株分析表明类胡萝卜素的生物合成被抑制
97%以上,果实呈黄色,几乎检测不到番茄红素。
1992年 John和 Crow首先克隆了棉纤维中特异表
达的 E6基因,该基因编码的蛋白质具有细胞壁结
构蛋白的特点。1995年 John等利用反义 RNA技术
使棉纤维中 E6蛋白减少 60%~98%,但纤维长度、
强度、成熟度及厚度与对照几乎无差异。这说明 E6
对于正常的纤维发育及纤维结构的完整性的作用
并不是关键的,但也有学者认为 E6可能为超量表
达基因,即 E6在极少量表达条件下即能完成其功
能。Ruan[53]利用反义 RNA技术,构建了 SuSy基因
的反义载体导入棉花,获得了纤维发育受到抑制的
转基因后代植株。产生的种子有的出现无绒表型,
有的纤维长度比正常的要短很多。扫描电镜结果表
明在开花当天,转基因植株胚珠表面的突起数目少
且小,还出现突起塌陷与皱缩的现象;开花后 3d,
突变型的纤维长度要比野生型的短很多。上述实验
结果表明 SuSy在纤维突起与伸长过程中起关键作
用。杨虎清等[54]把 LeETRI反义基因遗传转化番茄
后发现番茄红素的合成受到显著抑制,果实不能形
成正常的五色;推测 LeETRI和番茄的成熟有着密
切的关系。叶建荣等[55]转水稻 osRACD反义基因拟
南芥植株的育性分析后发现 osRACD基因有可能
参与光敏核不育水稻农垦 58S的光周期育性转换
遗传性状的调控,有关这方面的研究目前正在进行
之中。
4.7 在其它植物生理研究中的应用
反义技术在植物生理领域也有广泛的应用,是
近来揭示基因/蛋白在重要生理/生化过程中的作用
和机理的重要试验方法。Lakshmi等[56]研究结果表
明反义技术能够成功应用于研究植物不同色素受
体在光环境变化对植物生长发育影响作用及机理。
Oda等[57]成功地应用反义技术研究了光周期对拟
南芥生长发育的影响,及 PIF3基因在其中的作用。
Zhong等[58]用反义技术将豌豆基质金属蛋白酶反义
基因转化进入拟南芥,结果转基因拟南芥叶绿体基
质金属蛋白酶活性大量降低,且物质吸收过程受到
抑制;实验结果揭示基质金属蛋白酶基因对叶绿体
物质合成和植株生存具重要作用。JoaoHlbert等[59]
等用反义技术转化蔗糖结合蛋白反义基因;得到的
转基因烟草植株相对于对照叶绿体蔗糖结合蛋白
含量降低,蔗糖转运受到抑制,光合作用的效率降
低,植株生长发育缓慢;从而也揭示出蔗糖结合蛋
白基因在植物光合作用的重要作用。另外,一些研
究,通过反义技术辩明了一些基因在某些相关生化
过程中的可能作用。Buccigalia等[60]应用反义技术
研究 p-1,3-葡聚糖酶基因(Tagl)在花粉形成,尤其
在染色体四价体(被主要由 p-1,3-葡聚糖形成的壁
包被)分裂成花粉粒过程中的作用。研究结果尽管
反义基因转基因烟草的 ATGI和 p-1,3-葡聚糖酶
含量大量降低,但四价体分裂和花粉形成均正常,
这揭示 p-1,3-葡聚糖酶基因对四价体分裂并不是
必须因素。
5 反义 RNA技术研究展望
自 1981年 Tomizawa等首先报道反义 RNA在
质粒 CoIE1DNA复制中的调控作用以来,人们对反
义 RNA的研究发展迅速。对反义 RNA的深入研究
提示,此类分子所参与的 RNA/RNA相互作用,可
能是植物基因表达调控的一个重要路径,其作用方
式也赋予了反义 RNA技术方面的优越性:(Ⅰ)反
义 RNA所介导的基因表达阻抑效应是特异的,其
调控对象是有选择性的;(Ⅱ)低丰度的反义 RNA
同样可以产生高效的阻抑作用;(Ⅲ)反义 RNA不
能翻译产生蛋白质,因此反义 RNA技术在基因工
程上的应用具有很大的安全性。但在反义 RNA应
刘俊杰等:反义基因技术及其在植物研究上的应用 83
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
用中也存在许多问题:(Ⅰ)反义 RNA在导入植物
体后,在整合位点,外源基因的表达水平和模式上
通常具有不可预测性,给研究的顺利进行带来了困
难;(Ⅱ)反义 RNA稳定性差,反义模板的最佳长度
和拷贝数难以确定,基因最佳模板的选择和启动子
的选择都有待深入研究;(Ⅲ)反义 RNA进入植物
体后如何修饰才能穿过细胞壁和红胞膜而不受降
解,这也是目前研究的难点。反义技术的应用前景
反义技术的操作和突变不同,能在不破坏目的基因
的前提下调控基因的表达,因此,它既是阐明基因
功能的一种新手段,又拓宽了通过基因工程改良
动、植物品质和治疗疾病的途径。适当地应用反义
RNA技术可以封闭某一特定基因的表达,人为地
模拟基因的点突变,因而使该项技术具有极广泛的
应用前景。总之,反义 RNA作为分子生物学与基因
工程一个热点,将在基础与应用研究中开辟一个新
的领域。
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