全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
产聚 羟基丁酸酯菌株的筛选及发酵条件的优化
崔志芳 季爱云 李春露
(山东科技大学化学与环境工程学院,青岛 266510 )
摘 要: 作为一类可望替代传统塑料的新型可降解生物高分子材料 ,聚 羟基丁酸酯 ( PH B)日益引起人们的重视。采
用尼罗蓝荧光法从污水中初筛得到产 PHB的细菌,摇瓶发酵复筛得到一株 PHB产量较高的菌株 AE13, 同时对该菌株的发酵
条件进行了正交优化 , PH B的产量达到 0 85 g /L。
关键词: 聚 羟基丁酸酯 尼罗蓝 筛选 发酵
Screening of Strains for Accumulating Polyhydroxybutyrate
and Studying on Its Fermentation Conditions
Cui Zhifang JiA iyun L iChunlu
(The College of Chem ical Eng ineering, Shandong University of Science and Technology, Q ingdao 266510)
Abstrac:t A s a new kind o f po lym er m ater ia l expec ted to rep lace the traditiona l plastics, po lyhydroxybuty rate ( PH B) a rose
g row ing attention in recent yea rs. In th is pape r, strains produc ing PHB we re screened from the sludge by N ile b lue fluorescence. A strain
w ith h igh PH B content was nam ed AE13. Furtherm ore, the optim ization of fe rmentation condition was stud ied by orthogona l experim ent.
Under the optima l condition, PHB content o f AE13 could be reached 085g /L.
Key words: Po lyhydroxybu ty ra te( PHB ) N ile b lue Screen ing Ferm enta tion
收稿日期: 20091102
基金项目:山东科技大学科学发展基金 ( 065400532)
作者简介:崔志芳,女,副教授,博士,主要从事生物化工相关研究; Em ai:l cu izf 01@ s ina. com
塑料从诞生之日起, 以其质轻、强度高、耐腐蚀
等优良特性及低廉的价格迅速进入人类生活及工农
业生产,并获得了广泛的应用, 但同时暴露出填埋、
焚烧塑料垃圾时的种种弊端。数量巨大的塑料垃圾
对生态环境造成了严重的影响,因此发展可降解塑
料十分必要 [ 1]。在众多的生物可降解材料中, 采用
微生物发酵法生产的聚羟基脂肪酸酯 ( po lyhydroxya l
kanoates, PHAs)是应用环境生物技术领域的一个研
究热点。PHA s是微生物在碳、氮营养失衡的情况
下 (培养基中高碳源而低氮源 ), 作为碳源和能源贮
存而合成的热塑性聚酯。目前已经发现, PHA s至
少具有 150种不同的单体结构, 并且还在不断地发
掘新的单体结构。其中, 聚 羟基丁酸酯 ( po ly
hydroxybutyrate, PHB )是发现最早、研究最多、应用
最成熟的一种。目前从自然界中筛选产 PHB菌株
的文献较少,且初筛大多采用苏丹黑染色法,即平板
分离单菌落后需对每株进行菌苏丹黑 B染色。苏
丹黑 B是一种脂溶性染料, 可以使胞质中的中性脂
肪、磷脂、类固醇等脂类物质呈棕黑色或深黑色颗
粒 [ 2]。筛选及染色工作量很大, 且假阳性较多, 因
此急需建立一种快捷、简便的产 PHB菌株初筛
方法。
本研究从污水中采样, 初次尝试采用尼罗蓝荧
光法结合苏丹黑染色初筛得到具有产 PHB能力的
细菌,并对其发酵条件进行初步优化, 旨在为将来
PHB的微生物法生产奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
111 样品及主要试剂 污水样取自尼布湾污水
处理厂、山东科技大学南门门前小河。PHB标准品
购自 S igm aA ldrich公司,尼罗蓝购自 Akeaibao,其它
试剂均为国产生化试剂或国产分析纯。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
112 培养基 ( 1)富氮培养基 [ 2] ( g /L ) :酵母浸
粉 100,蛋白胨 100, 牛肉浸粉 50, 葡萄糖 200,
硫酸铵 50。 ( 2 )贫氮培养基 [ 3] ( g /L ) : 葡萄糖
200, NH 4C l 30, K2HPO4 100, M gSO 4 7H2O 02,
微量元素 1mL,包括: CuSO4 5H2O 048, ZnSO4
6H2O 24, M nSO4 4H 2O 193, CrC l3 6H2O 03,
N iC l3 6H 2O 01。 ( 3)筛选培养基 ( g /L ) :贫氮培
养基 +尼罗蓝溶液,培养基中尼罗蓝的终浓度为 50
g /mL。
12 方法
121 菌种的初筛 将污水处理厂的 3个污水样
稀释 104、105、106倍, 小河污水稀释 103、104、105倍
并接种到筛选培养基上, 28 培养 36 h后, 在 365
nm紫外灯下观察, 挑取发荧光的单菌落, 接于富氮
培养基上,冰箱斜面保存。
122 菌种的复筛 初筛获得的菌种重新接入
富氮培养基中,培养 24 h, 取样测定细胞干重 (发
酵液 5 mL, 5 000 r /m in离心 20 m in, 75 烘箱中
烘干至恒重 ) , 然后无菌离心接入贫氮培养基, 培
养 36 h后, 取样测定 PHB含量, 以筛选出高产
菌株 [ 4]。
123 细胞破壁预处理方法 [ 5, 6] 5 mL发酵液,
5 000 r/m in离心 20m in,蒸馏水洗涤,离心。离心后
的湿菌体,加入 5 mL的 SDS溶液, 30 水浴处理 10
m in,处理后的菌液以 12 000 r/m in离心 15 m in,弃
去上清夜,加入 pH980的次氯酸钠溶液, 30 水浴
处理 5m in,沉淀用蒸馏水洗涤 1次, 再用丙酮洗涤
1次,于烘箱中 75 烘干,备用。
124 PHB含量测定 [ 7, 8] 采用紫外分光光度法
测定 PHB含量。 PHB在浓硫酸中加热时可以定量
地转化为巴豆酸 (反 2丁烯酸 ) ,巴豆酸在 235 nm
处有一最大吸收峰值, 而其它含碳化合物在同样
条件下的吸收峰与 PHB有很大的差别。将经过细
胞壁处理并烘干的菌体, 加入 5 mL氯仿溶液,
60 抽提 1 h, 获得含 PHB的氯仿溶液。测定时吸
取 05mL含 PHB的氯仿溶液于磨口试管中, 加热
70 以上除去氯仿,然后加入 10mL浓硫酸,盖上玻
璃塞, 100 水浴加热 10m in,冷却至室温并混匀,在
235 nm处测定含有 PHB硫酸溶液的吸光值。
2 结果与讨论
21 菌种筛选
211 菌种初筛 新鲜污水经稀释涂布在筛选培
养基上培养 36 h后, 将平板移至紫外灯下观察, 挑
取发橙红色荧光较强的菌落,共得到 44菌株, 对其
进行苏丹黑 B染色, 发现 44株菌均呈阳性,尼罗蓝
荧光及苏丹黑 B染色结果如图 1和图 2所示。
筛选培养基中含有的尼罗蓝是一种荧光染料,
能特异性地对聚羟基脂肪酸酯进行荧光染色, 原先
仅仅用作 PHA s镜检的染色液使用。它的荧光最大
激发波长是 365 nm,加入培养基后, 能透过细胞壁
很容易以悬液的形式渗入细胞中并能特异性结合细
胞内的聚羟基脂肪酸酯产生荧光,与 PHB结合则呈
橙红色。因此,在细胞生长的同时就能依据荧光现
象, 方便地判断出 PHB的出现, 而且尼罗蓝对细菌
的生长和 PHB的累积都不产生负面影响,具有简单
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2010年第 1期 崔志芳等:产聚 羟基丁酸酯菌株的筛选及发酵条件的优化
快速的特点。
将这 44株菌接到富氮培养基上, 28 培养24 h,
淘汰掉生长速度慢和细胞干重较小的菌株, 得到 15
株生长力旺盛且细胞干重较大的菌株。
212 菌种复筛 将上面筛到的 15株菌株接种到
富氮培养基上, 28 培养 24 h, 无菌离心后, 将菌体
沉淀全部接入到贫氮培养基, 28 培养 36 h后, 紫
外法测定细胞内 PHB含量, 试验结果如图 3所示。
其中 13号菌的 PHB含量最高,说明该菌合成 PHB
的能力最强,对其进行 5次传代稳定性试验, 表面该
菌产 PHB含量基本稳定, 故以此作为进一步研究的
出发菌株,命名为 AE13。
图 3 产 PHB菌株的复筛
213 菌株初步鉴定 结合伯杰细菌鉴定手册,对
于 AE13的细胞和结构、培养特征及生理生化特性
等方面对其进行了研究。AE13为短杆状, 革兰氏
阴性菌,在固体富氮培养基上的菌落形态:菌落呈圆
形,表面光滑,大小均一, 边缘整齐,菌落显淡黄色。
在贫氮培养基上的菌落形态:圆形光滑菌落,在紫外
灯照射下有橙红色荧光产生。生理生化指标以及菌
落形态的初步鉴定表明该菌为球衣菌属。
22 发酵条件的优化
尽管 PHB的产生是在贫氮条件下、由过多的碳
源累积而成,在 PHB的生产过程中, 通常需要先将
菌种在碳源、氮源均衡的培养基中 (即富氮培养基 )
培养, 以获取尽可能多的菌体。因此, 对 AE13进行
富氮发酵条件优化是 PHB生产的首要步骤。
221 富氮发酵条件优化 挑取一环 AE13菌接
种于 30mL富氮培养基中, 28 、160 r/m in振荡培
养 24 h,得到种子液。以葡萄糖浓度、硫酸铵浓度、
pH和接种量 (培养基中其它成分及浓度与 112富
氮培养基相同 )进行四因素三水平的正交试验, 正
交设计表试验结果见表 1。试验结果表明,编号为 8
的细胞干重最大。菌体干重随葡萄糖浓度增加而增
加,但是糖浓度过高, 残糖浓度也越高,不经济;菌体
干重随 (NH4 ) 2 SO 4浓度增加呈现先增加后减少的趋
势; 接种量对细胞干重影响不大; pH对富氮发酵影
响较大。确定最佳的富氮发酵培养条件为: 葡萄糖
3% ( w /v ), ( NH 4 ) 2 SO 4浓度 05% (w /v ), 接种量
4%,培养基 pH80,细胞干重为 613 g /L, 是优化前
的 2倍,优化效果较为明显。
表 1 富氮正交试验结果
试验编号 葡萄糖
(% , w /v)
硫酸铵
(% , w /v )
接种量
(% )
pH
细胞干重
( g /L )
1 1 03 4 70 325
2 1 05 6 75 409
3 1 08 8 80 502
4 2 03 6 80 490
5 2 05 8 70 402
6 2 08 4 75 540
7 3 03 8 75 527
8 3 05 4 80 613
9 3 08 6 70 528
K1 4120 4473 4927 41813
K2 4773 5013 4457 4920
K3 5560 4803 477 535
R 1440 0540 0470 1167
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
222 贫氮发酵条件优化 贫氮发酵条件优化是
为了获得高产量的 PHB。将经过种子液培养的
AE13接入上述确定的最佳富氮培养基上, 28 、160
r /m in振荡培养 24 h, 无菌离心, 将菌体转接入贫氮
培养基。接种量为 1!2,即离心的富氮发酵液与贫
氮培养液的体积比值为 1!2。以葡萄糖浓度、NH 4C l
浓度、pH 和装液量 (培养基中其它成分及浓度与
112贫氮培养基相同 )进行四因素三水平的正交
试验验及试验结果见表 2。
表 2 贫氮正交试验结果
试验
编号
葡萄糖
(% , w /v )
氯化铵
(% , w /v )
pH
装液量
(m l)
PH B含量
( g /L)
1 1 02 70 30 062
2 1 04 75 45 052
3 1 06 80 60 051
4 2 02 75 60 050
5 2 04 80 30 085
6 2 06 70 45 060
7 3 02 80 45 025
8 3 04 70 60 042
9 3 06 75 30 036
K1 0550 0457 0447 0610
K2 0650 0597 0460 0457
K3 0343 0490 0537 0477
R 0307 0140 009 0153
葡萄糖浓度对 PHB积累影响较大, 培养基的
pH对 PHB的积累影响较小, pH70 - 75时, PHB
含量变化平缓, pH 大于 75后, PHB含量有所上
升;装液量对 PHB积累影响最大。确定最佳的贫氮
发酵培养条件为: 葡萄糖浓度 2% (w /v ) , NH 4C l浓
度 04% (w /v ), pH 80, 装液量为 30 mL /250 mL。
即实验 5条件, PHB含量达到 085g /L, 是优化前
( 112中贫氮培养基, pH 75, 装液量 45 mL /250
mL)的 39倍。
3 结论与建议
本研究通过尼罗蓝荧光法快速有效地筛选出了
产 PHB的细菌, 并通过复筛得到一株 PHB产量较
高的菌株 AE13。对 AE13生理生化指标进行了一
系列鉴定,表明该菌为球衣菌属。通过对 AE13进
行富氮和贫氮发酵条件的优化,使菌体量和 PHB产
量有了较大提高。
从提高 PHB产量的角度出发, 今后可尝试在本
实验所得 AE13的基础上构建基因工程菌, 同时在
合理有效地控制微生物的生长速率、PHB的合成速
度和累积的最大限度及提高 PHB提取的经济性方
面还有很多工作要做。
参 考 文 献
[ 1] 王熺.国内外降解塑料的现状及发展方向. 现代塑料加工应用,
2002, 14 ( 4) : 6164.
[ 2] 王武,陈富强,李礼尧.羟基脂肪酸聚酯产生菌选育.无锡轻工大
学学报, 1995, 15 ( 4 ) : 303307.
[ 3] 郦和生,张春元,张伟, 等.生产聚羟基丁酸酯 ( PHB )的菌种选
育及发酵条件.石化技术, 1997, 4 ( 4) : 212215.
[ 4] 黄海东,赵良启,李晓燕.筛选聚羟基烷酸产生菌的一种方法.生
物技术, 2004, 14 ( 2 ) : 2930.
[ 5] 尹进,于慧敏,李红旗,等.用 SDSNaC lO从重组大肠杆菌中分离
聚 羟基丁酸酯.生物工程学报, 1998, 14 ( 3 ) : 342344.
[ 6] Tam er IM, M oo YM, Ch istiY. Op tim izat ion of po ly(hydroxybu tyric
acid) recovery from A lcaligenes la tu s: com b ined m ech an ical and
chem ical tream en ts. B ioprocess Eng ineering, 1998, 51: 459468.
[ 7] 陈接峰.产聚 羟基丁酸球衣菌分离筛选及发酵和提取条件的
研究 [D ] .福州:福建师范大学, 2003.
[ 8] Y ilm azM, Soran H, B eyat li Y. Determ ination of polyhydroxybu
tyrate ( PH B) produ ct ion by som e Baci llu s spp. W orld Jou rnal ofM i
crob iology & B iotechnology, 2005, 21: 56556.
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