全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
尼罗蓝在筛选 PHB高产菌株中的应用研究
薛林贵 赵旭 景春娥 常思静
(兰州交通大学化学与生物工程学院,兰州 730070 )
摘 要: 建立一种简便、高效、可靠的初筛方法是 PHB高产菌株筛选的关键。以芽孢杆菌 (Bacillus P9)为试验材料,对
各种 PHB产生菌筛选方法进行了比较,最终确定尼罗蓝染色法为一种最佳方法。并且对试验程序进行了优化,确定尼罗蓝染
液的最佳浓度为 0 225 m g /L, 菌株的最佳染色时间为培养后 96 h。进一步证实了尼罗蓝染色法为一种值得推广的 PH B产生
菌初筛方法。
关键词: 尼罗蓝 聚 羟基丁酸 高产菌 筛选 荧光
Study on the Application of N ile Blue in Selecting ofH igh
Y ielding PHB Strain
Xue L ingu i Zhao Xu Jing Chune Chang S ijing
(College of Chem ical and B iology Eng ineering, Lanzhoujiaotong University, Lanzhou 730070)
Abstrac:t It was to establish a simp le, effic ient and reliable screen ingm ethod is a key for se lecting high y ie ld ing stra ins o f PH B.
Bacillus P9 was used as the experim enta lm ater ia,l and N ile blue sta in ing m ethod w as as the best w ay compare ing o f v arious screen ing
m ethods o f PHB produc ing stra ins. The procedure o f testing was optim ized and determ ined that the bestN ile blue dye concentration w as
0 225 mg /L, and the best culture time o f stra in for dye w as 96 h. The N ile blue sta ining me thod has been further confirmed tha t it
should be promo ted as a satisfactorym ethod fo r the screen ing of PH B produc ing stra in.
Key words: N ile bu le Po lyhydroxybu ty ra te H igh y ie ld ing strain Selecting F luorescence
收稿日期: 20091210
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30870384) , 甘肃省科技支撑计划项目 ( 090NKCA079 )
作者简介:薛林贵,男,博士,教授,研究生导师,主要从事微生物生理、微生物工程方面的研究工作; Em ai:l xuelg@ m ail lzjtu cn
聚 羟基丁酸 ( PHB)是微生物在营养不平衡
的条件下贮存的内源性高分子聚合物,能被酶降解,
不仅具有与化学合成塑料相似的性质, 而且具有生
物可降解性和生物相容性, 有着广阔的应用前
景 [ 1]。能合成 PHB的微生物分布极广, 包括自养和
异养、光能和化能菌共计 65个属中的许多种, 其中
既有革兰氏阴性菌也有革兰氏阳性菌 [ 2]。但由于
这些菌种的合成效率较低,生产 PHB的成本较化学
合成高分子材料要高得多, 所以到目前为止, PHB
的大规模工业化生产还未能实现。因此, 分离和诱
变选育能够利用廉价碳源、氮源高效率生产 PHB的
菌种, 成为能否大规模工业化生产 PHB的关键。初
筛是从大量分离到的微生物或诱变菌株中将具有合
成目的产物的微生物筛选出来的过程。突变是随机
不定向的,但筛选是定向的 [ 3]。初筛方法的好坏直
接关系到诱变选育的结果,然而目前筛选 PHB高产
菌株所用方法的灵敏度较差,操作过程繁琐,很大程
度上限制了 PHB高产菌株的筛选。尼罗蓝是一种
荧光染料,能特异性地对 PHB进行染色, 通过在荧
光显微镜下观察荧光的强弱,就能判断 PHB含量的
多少。本研究拟对尼罗蓝染色初筛 PHB高产菌株
的方法进行研究, 以期建立一种简便、高效、可靠的
PHB高产菌初筛方法。
1 材料和方法
11 菌种、仪器及培养基
芽孢杆菌 (Bacillus P9), 由本校微生物工程研
究室提供。落射荧光显微镜 (宁波永新光学股份有
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
限公司 ) ,傅立叶红外 ( FTIR )光谱仪 ( VERTEX 70,
Germany),紫外分光光度仪 UV2100(尤尼柯仪器有
限公司 )
斜面培养基 ( g /L ) :蛋白胨 50, 酵母膏 10,甘
油 10, pH70, 121 灭菌 20 m in。种子培养基
( g /L ) :蛋白胨 50,酵母膏 10,甘油 100, pH70,
121 灭菌 20m in。基础发酵培养基 ( g /L ): 蛋白胨
50,酵母膏 10,甘油 50,葡萄糖 50, pH70, 121
灭菌 20m in。
12 培养方法
121 发酵培养 从活化的斜面培养基上挑取两
环菌种接种到种子培养基中, 29 , 150 r/m in摇瓶
振荡 24 h, 进行种子培养。在 50mL发酵培养基中,
以体积百分数为 5%的接种量接入液体种子, 29 ,
150 r /m in摇瓶振荡 144 h, 进行发酵培养。
122 平板培养 将活化好的菌株斜面用生理盐
水制成 5 mL菌液, 再用生理盐水稀释至 105倍, 吸
取 01mL涂布平板, 29 培养 144 h。
13 菌株生长曲线和 PHB积累曲线测定
采用血球计数板法进行生长曲线测定 [ 4 ] , 采
用硫酸法测定 PHB含量。浓硫酸在 100 加热条
件下会将菌体内的 PHB降解为巴豆酸, 巴豆酸在
235 nm紫外光谱区有吸收峰,通过紫外分光光度仪
测定其吸收值,对照 PHB标准曲线计算 PHB含量。
14 尼罗蓝溶液的配制及细胞染色
将 10mg尼罗蓝试剂溶于 05mL丙酮中,然后
用蒸馏水稀释至 20 mL。得到浓度为 05mg /mL的
溶液。贮存备用由于尼罗蓝在水中溶解度很低,为
了防止结晶,其在使用前才稀释。用水将尼罗蓝的
丙酮溶液稀释至 005、01、015、02、025、03和
035mg /L尼罗蓝的 7种浓度的溶液, 以确定染色
剂尼罗蓝最佳浓度。将细胞涂于载玻片上, 用火焰
固定。冷却后加入一滴尼罗蓝溶液,放入 50 烘箱
中,待烘干后用 8%冰醋酸脱色 1 m in, 然后用蒸馏
水清洗,加盖玻片后置于荧光显微镜下观察,每种浓
度梯度做 3次重复。
15 PHB含量的测定
采用分光光度法测定 PHB的含量: 取 5 mL菌
液 8 000 r/m in离心 10m in。离心后去上清液,沉淀
物分别用 5mL的无水乙醇和丙酮清洗并离心,再用
蒸馏水清洗, 离心后,将沉淀物用 5 mL 30%的次氯
酸钠转入 50mL的烧杯中,于 35 在磁力搅拌器上
搅拌 20m in,然后转入离心管中于 8 000 r /m in离心
10m in,再用蒸馏水清洗离心后,放入烘箱于 50 下
烘干。向烘干后的沉淀物中加入 5 mL氯仿于 50
水浴下进行抽提 1 h, 然后过滤,将滤液转入试管于
60 烘干后, 每个试管中加入 10 mL浓硫酸, 100
水浴加热 10 m in。冷却至室温后, 用紫外分光光度
计于 235 nm处测量 PHB的含量, 浓硫酸做参照。
做 3组平行试验,取平均值, 对照 PHB标准曲线, 根
据试验测得的样品吸光度计算得出样品中 PHB的
含量。
16 胞内聚合物颗粒成分分析
将 PHB从细胞中提取出来,用红外光谱法 [ 5 ]检
测其纯度。
2 结果和讨论
21 Bacillus P9菌的生长规律
采用发酵培养基摇瓶培养, 每 12 h取样, 测定
细胞量和 PHB的量, 重复 3次取平均值, 制作 Bacil
lus P9菌的生长曲线与 PHB积累曲线 (图 1)。结
果表明, 该菌株在 24 h前处于延迟期, 24 h后进入
生长对数期,同时 PHB开始积累, 84 h细胞进入稳
定生长期,稳定期细胞量和 PHB积累为最大, 即该
菌的 PHB积累与菌体细胞的生长是同步的, 属于一
步发酵类型 [ 6]。 108 h时 Bacillus P9的细胞量为
2408 108个 /mL, PHB产量为 125 g /L。
图 1 Bacillus P9生长和 PHB产量曲线
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2010年第 3期 薛林贵等 :尼罗蓝在筛选 PHB高产菌株中的应用研究
22 细胞染色及最佳尼罗蓝浓度的确定
221 发酵菌液制片观察 从培养了 96 h发酵液
中挑取菌液,分别用不同的尼罗蓝溶液染色,制成多
组装片,通过多次在荧光显微镜下观察,发现在不同
浓度尼罗蓝溶液染色中, 02 mg /L和 025 mg /L两
个浓度为最佳 (图 2A, C )。由于是肉眼观察,所以
很难观察到这两个浓度梯度照片的区别,所以选择
了这两个浓度的中间值 0225mg /L作为最佳浓度
(图 2B)。当浓度低于 02 mg /mL时荧光较弱, 而
高于 025 mg /L时细胞中的多余染料洗脱不干净,
影响了细胞内 PHB的观察, 而且不易分辨 PHB颗
粒的边缘及颗粒之间的界限。
图 2 最佳浓度尼罗蓝溶液染色照片 ( 400 )
222 平板菌落菌株制片观察 从培养了 96 h
平板菌落中挑取少量细胞, 分别用不同浓度的尼
罗蓝溶液染色,制成多组装片, 通过多次重复在荧
光显微镜下观察,发现用 02 mg /L和 025 mg /L
两个浓度的尼罗蓝溶液制成的装片观察效果为最
佳 (图 3A, C ) , 与用发酵菌液制成的装片观察到
的结果相同,同样也确定 0225 mg /L作为最佳浓
度 (图 3B )。
图 3 最佳浓度尼罗蓝溶液染色照片 ( 400 )
23 PHB的测定
分别取培养了 48、72、96、120 h的菌液测定其
PHB含量, 结果如图 4。由图 4可以看出,随着培养
时间的增加,细胞内 PHB的含量也在逐渐增加,但
在 96 h以后 PHB的积累达到最大值,不再增加。
24 红外光谱分析
红外光谱的测定由波数 4 000- 500 / cm扫描。
样品的红外光谱图与标准样品的相似 (图 5)。样品
图在波数 1 723 /cm处有一强烈峰值,此为羧酸中羰
基的吸收峰, 波数 3 436 /cm处存在含 0H 伸缩振
动, 波数 2 976 /cm、2 935 /cm、2 874 /cm 处存在
CH3、CH 2、CH振动,这些都是 PHB的特征峰;此外
在波数 1 058- 1 287 /cm间存在大量 CO振动, 为
聚酯的特征峰,红外光谱测定结果说明胞内聚合物
为 PHB。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
图 4 培养时间对 PHB积累量的影响
图 5 红外吸收光谱
25 最佳浓度尼罗蓝染液对不同培养时期菌落的
染色观察
在平板上分别挑取少量培养了 36、72、96、120 h
的细菌,用浓度为 0225mg /L的尼罗蓝溶液染色制
成装片,在荧光显微镜下观察, 结果显示, 随着培养
时间的延长和 PHB积累量的增加,细胞发出的荧光
强度也在增加 (图 6)。研究结果表明, 尼罗蓝染液
的浓度为 0225 mg /L时 Bacillus P9菌的染色效果
良好, 能够反映细胞内 PHB积累量的差异,可以用
来初步判断细胞内 PHB含量的多少, 从而应用于
PHB产生菌的初筛研究中。
3 结论
关于 PHB高产菌株初筛,至今仍被认为是一项
难度较大的工作,其成败的关键在于建立一种简便
可行、重复性好, 而且可靠的初筛方法。前期研究试
验了 PHB筛选的各种方法, 包括苏丹黑染色法,尼
罗蓝平板菌落观察法等,但试验结果表明,应用尼罗
蓝染色法进行 PHB产生菌初筛均优于其它方法,是
一种值得推广的最佳方法。此次试验确定了尼罗蓝
染色的最佳浓度为 0225 mg /L, Bacillus P9最佳细
胞染色时间为培养后 96 h, 而且对试验操作的过程
进行了详细比较,总结出了适合于该菌株的完整操
作程序。然而,尼罗蓝染色不能精确的反映细胞内
PHB的含量, 只能在胞内 PHB含量差别较大的情况
下用于菌种的初筛,且需在其它菌种中进一步试验,
能否作为一种快速、高效、可靠的 PHB高产菌株筛
选方法还有待于进一步的研究完善。
A - D分别为培养 36、72、96、及 120 h培养细胞染色
图 6 不同培养时间细菌染色照片比较 ( 400 )
参 考 文 献
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