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技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
微卫星 DNA标记在蚌科生物多样性保护中的应用
欧阳解秀  吴小平  欧阳珊  李绍波
(南昌大学生命科学与食品工程学院,南昌 330031 )
  摘  要:  蚌科动物是世界上最濒危的动物类群之一, 对该类动物的生物多样性保护是非常有意义的。微卫星 DNA标记
的发展和利用将有利于蚌科动物的遗传多样性保护。从微卫星标记的特点、研究方法、研究结果等方面综述了微卫星 DNA标
记在蚌科动物中的研究进展, 并展望了中国蚌科微卫星 DNA标记的研究方向。
关键词:  微卫星标记  蚌科  生物多样性保护
Application ofM icrosatellite DNAM arkers for
Unionidae B iodiversity Conservation
Ouyang Jiexiu Wu X iaoping Ouyang Shan L i Shaobo
( School of Life Sciences and Food Engineering, N anchang University, N anchang 330031)
  Abstrac:t  Un ionids are one o f the m ost endangered organ ism s in thew or ld. It is necessary to take action to conserve biodive rs ity
o f these anim a ls. The deve lopm ent and applica tion of m icro sate llitem arkersw ould be he lpful for g enetic diversity research in Un ion ids.
The pape r described the pr inc iples, application m ethods o fm icrosate llitem arkers, and po inted out the sta tus and prospects of m icro sat

e llite ma rkers research for union idae in China.
Key words:  M icro sate llitem arkers Un ionidae B iodiversity conservation
收稿日期: 2010
06
01
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30860045)
作者简介:欧阳解秀,女,博士研究生,研究方向:蚌类分子系统学; E
m ai:l ouyangjiexiu@ 126. com
通讯作者:吴小平, E
m ai:l xpw u@ ncu. edu. cn
生物多样性保护三个水平包括遗传多样性、
物种多样性和生态系统多样性。遗传多样性被认
为是降低群体灭绝可能性和确保受威胁物种幸存
的最关键因素 [ 1]。蚌科动物是淡水底栖动物的重
要类群, 是淡水贝类最大的科, 包括 674个物
种 [ 2, 3 ]。由于其生态学意义、经济上的重要性、资
源丰富、复杂的生活史和最近数量上的急剧下降,
已经引起了很多研究者的关注 [ 4 ]。很多物种已被
世界自然保护联盟 ( internationa l un ion for conserva

t ion of nature, IUCN )列为频危物种、受危物种或需
要特别关注。因此, 利用先进的分子生物学技术,
如微卫星标记研究蚌科动物的遗传多样性具有重
要的生态学意义。
1 微卫星 DNA标记的特点
微卫星又称小串联重复 ( short tandem repeats ,
STRs) , 它们广泛分布在各种真核生物基因组中,
微卫星 DNA标记的重复单位在 1- 6 bp, 每一重复
单位发生若干次重复,整个重复序列可达几十至几
百个碱基对,大多分布在非编码区 [ 5]。微卫星 DNA
标记是共显性的,包含有双或多个等位基因,具有丰
富的多态性,很容易被扩增出来, 且突变率快。在生
物遗传作图、群体遗传研究、个体间亲缘关系鉴定等
方面已得到广泛应用 [ 6 ]。与 RFLP相比, 二者都是
鉴定遗传多样性的有利工具, 但微卫星分子标记很
少应用于高阶元的分类, 最适合用于种的鉴定和系
谱分析 [ 7]。
2 微卫星 DNA标记的研究方法
21 基因组 DNA的提取
在微卫星分子标记分析中,模板 DNA的要求较
低。仅需要几百个碱基对, 因此有时部分降解的
2010年第 12期       欧阳解秀等:微卫星 DNA标记在蚌科生物多样性保护中的应用
DNA都可以进行有效地分析,因而增加了微卫星分
析在生物多样性研究中的应用,特别是对那些濒危
动物遗传关系信息的分析是非常适用的。蚌类动物
的基因组 DNA提取按照通常的苯酚抽提法 [ 8]和
CTAB法 [ 9]都可以满足试验的要求。
22 微卫星 DNA标记引物筛选
物种在第一次开展微卫星研究时首先需要分离
微卫星序列,开发特异性扩增引物。目前,微卫星分
离方法可分为经典法、富集法、筛选基因组文库法、
ISSR片段扩增法和数据库检索法 5种 [ 10]。目前淡
水蚌开发的微卫星 DNA标记序列不是很多 [ 11 - 15]
(表 1)。包括 5个物种,即 Ep ioblasma cap saeform is、
Anodonta cygnea、Ep ioblasma toru losa rangiana、H yri

op sis cum ingii和 Lamp silis abrup ta,共 50对引物。
表 1 淡水蚌微卫星引物序列信息
位点 引物序列 ( 5 - 3 ) G enBank登录号 物种
Ecap1
TGCATCATATGAAATGTGTTCG
TCAGCATATTTCAAAGCAAACA
AY650389- AY650398 Epioblasm a capsaeform is
Ecap2
ATCCTCAGGTTGGTGGTCAG
TTTGAAAACCTTGTGATTGGC
Ecap3
GGATGATGGGGAAAATAGATG
TGCAACATTACCTGCCTTCCA
Ecap4
ATGCCCCAGTGCTAGACATT
AGAACAAAACACCCGTGTCC
Ecap5
TTTGAACACATTCGCCTCAG
GAATTTGCCTCATCAGCCAC
Ecap6
GATTTTGATTTTACGCTCCTGG
GGTTAGTGTTAGGAGTGACCGG
Ecap7
ACGAAAAATGTTGTCATCCATT
GCCTAGACGACAAGCAAACC
Ecap8
TGCAGACATCGTAGCGATATG
ATTTCCAGTTGCAAGTCTCATT
Ecap9
AAAAAGGTGTGGAGAGAGATGG
CCACTCTGCAGATATCGTATCG
Ecap10
ACACTGCAGACATCGTAGCG
TCACATACTTTGGGGACTTTCA
AnoCy0668
GATCAATTAATGATACAGATTTTAAG
TTCAAATTTCTAAGGCATATCG
FJ756400- FJ756408 An od on ta cygnea
AnoCy0975
TGACAACTCGTCAGACTAAACA
GCGAGCAGAGGAATTATAACA
AnoCy0992
CACGAGTGAAATGCAAACAT
TTCCTTATTTATTTTCTTCTTCTGC
AnoCy1526
TCAATGACCAGTATTTTGCAG
TTCAGAAAGGAGAGTATCAGTCC
AnoCy1541
ACTGCGTATAAGACACAATTCA
AGAACGTTTGGAATGTCAGG
AnoCy1588
AATGCCAAGTAAACTGAATGC
TCAAATACCTCGATGATTGAATA
AnoCy1612
TAGACCGATGAATTGTGACG
GTATTGCCCACACAGTAGCA
79
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
续表
位点 引物序列 ( 5 - 3 ) G enBank登录号 物种
AnoCy1886
CATATGGAATAGGCCCAGTG
CGGAGTATAAGACGAAGACCTGA
AnoCy2199
TGAGGTAATGCGAGAGCAGA
GAATCTTGCCATGCCTCAAC
E tr90
TGTAAAACGACGGCCAGTCCATTCTATAAATTTTTCCACCA
CGGACTAGTTTCCCGATCCT
DQ396403- DQ396408 Ep iobla sma torulosa rangiana
E tr114
TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGTCTTTTCCCAATTGCT
GGCAAAACATCATACTCTGCAA
E tr124
TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTTGTACGTTATAGTTGCACGA
GGCATTGCACACAAAACAGT
E tr140
TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTGGAGCTAGTGCCTCT
CAGCTCAAAGTAAAGGAATACGC
E tr145
TGTAAAACGACGGCCAGTAACTCGCTTTTAGTTTATGTGTCA
CAAAGAAAGACTTGATGCTTGAAA
E tr187
TGTAAAACGACGGCCAGTCAGTAGCAAC

CAGAACTTTTATATCG
AACGTGGGTGTTTCTTCAGG
H cu01
CCACGCACAAATGAAACTCAA
TGGGACAGCAGTGCATTACAG
EF450098- EF4500107 H yriop sis cum ing ii
H cu02
ACACAGACACTCACAGACACA
CACGCCAGCATAAAAACT
H cu06
AGCAAGGGGAAAATTGAGATG
TGATGAGGGCTCGTATAGATTTAC
H cu09
GCTCGTCGTGATCAAAATGAAA
CAATATGAAAAGAAATGGCAAGAA
H cu10
GTGTTTGGTGAAAATGTGGAGAGT
TGTTAAAGCACCATTCGATACAAA
H cu15
TTAATGCCCACACCTTTTGTTTC
CTTGGGGAGATGCACTCTGG
H cu17
AGAAAATAAAACTAAACGGGGATTTA
CTCCGAGAATACTGAACATGACTTTAT
H cu18
TTGGCGCTCGGCATTTGTTAG
AAGCTGCCGTTCAATCAATGTCA
H cu19
ATCCGCCGAATTATCAAACCT
TTTCGTCCTGTCTGCCACTTTA
LabC2
ATGGACACCAGAAAGAAAAGG
GAAGTCACAAGGTCAGGATCTC
AF12384- AF12398 Lampsilis abrup ta
LabC23
CAGTTGTTCCACTGTCGTAAAG
TGGGACTAACATGGTGGTTAAG
LabC24
TGGACCTATTCTTGCTTGTTG
GTTCTTTCGCCTCCATGTATAG
LabC67
AGTCTCTGGCTCAACCAACTC
CAAATCAATTACTGCCTTTTC
80
2010年第 12期       欧阳解秀等:微卫星 DNA标记在蚌科生物多样性保护中的应用
续表
位点 引物序列 ( 5 - 3 ) G enBank登录号 物种
LabD10
TTGTATAAACGGTCATGGAAAAC
CCGTGACCACTTCTTCTAAAAC
LabD29
TGTTCTTAGTTTATATTTATGGTTTGC
GCAGAAAATCTCCAGTTTATGG
LabD31
CTGCAGAACATCGAATGC
AAATGACAACAAAGTGAGGTTATATG
LabD70
GACCGCCTCTTCTAAAACTCTC
AACATCGCTTTCCATTAATCAC
LabD71
GAAGGACATCAAGGTCAATCAG
GGACACGGTCAAGTACAAAATAC
LabD92
GCCTGAAAGACATCGATAAAAG
ACCTCACTGTAATGTTGAAACG
LabD99
TTGAATGAGTCACGAGTATTTAATG
TTAAGAATCGAAAATGCTCAATC
LabD111
TGCATCAACTCTATTCACAACC
CAATGATAATGTAAATGTAAGCCTATC
LabD187
TCAAGTCTGCAATTTATTTTATGC
TGATTCTTTCCCTAGAAAATACAAG
LabD206
AAGTGTAGAGGCAGAGAACTGAC
TCACTGATACAGCATACATAATATAC
LabD213
ATACACAGGGTGCTCTAAATGC
TTGCCAAAACAACATAGTTCC
23 微卫星 DNA扩增及产物的检测
微卫星 DNA扩增方法与其他分子标记的 PCR
方法基本一致,反应体系一般为 25
L , 模板 DNA
所需量较少, 50 ng左右就够了。 PCR产物的检测
主要有以琼脂糖凝胶电泳 EB显色, 聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测法,多重 PCR微卫星荧光标记全自动基
因组扫描等。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法的应
用最普遍 [ 16]。
24 数据分析
随着生物学应用软件的发展, 如 ONEDscan软
件和 Ge l
Pro 45( E ) DNA与蛋白质分析软件可对
微卫星条带进行分析和确定片段大小。POPGEN软
件和 M icrosate llite
too lkit软件可计算等位基因频率
(P )、期望杂合度 (H e )和多态信息含量 ( P IC)、有效
等位基因数 (N e ); 用 Fstat293软件可计算各个微卫
星座位的群体内遗传多样性 ( Gd )、总近交系数
( F it)、群体内近交系数 ( F is)、群体分化系数 ( Fst)、
基因流 (Nm )和 Hardy
W einberg平衡检验。
3 微卫星标记在蚌类生物多样性研究中的
应用
Therriault等 [ 17]选用已有的 6个微卫星分子标
记对东欧海域 D reissena rostriform is bugensis的 12个
不同水域的遗传多样性进行了研究,结果表明,不同
水域间群体基因流动多,具有较高的遗传多样性,栖
息地的不同可加大遗传距离。 Carmen等 [ 18]选用
Ge ist等 [ 12]报道的 10个微卫星分子标记对分散分
布在伊比利亚半岛水域 6条河流, 7个采样点 Mar

garitif era margaritif era珍珠蚌的遗传多样性进行了
分析,结果表明,该蚌分散分布在欧洲南部这些水域
的遗传多样性比欧洲集中分布水域要低很多,同时,
南部的蚌还表现为高度的遗传分化。这些信息对这
些物种在南欧区域的保种和遗传资源的保护较重
要。E lizabeth等 [ 19]对新西兰的 P erna canaliculus蚌
开发出来了 40个微卫星位点,其中 10个微卫星位
81
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
点可用于系谱、个体鉴别和杂交系数的分析。用微
卫星分子标记的方法可鉴定欧洲海生蚌 Ostrea edu

lis的钩介幼虫, 能开发出物种新的微卫星位点, 微
卫星分子标记具有高度敏感性,可作为物种鉴定的
分子标记 [ 20]。 C lara等 [ 21]通过微卫星标记对墨西
哥 6个水域的 C rassostrea virg inica的遗传多样性进
行了分析,通过 5个微卫星位点分析的结果表明,动
物群体间在不同水域没有因为距离原因而出现遗传
隔离, 但相邻水域间有明显的杂交现象,这可能归咎
于地理因素和群体数量减少的缘故。 Ji等 [ 22 ]借助
北美 Ep ioblasma cap saeform is 和中欧 Margaritif era
margaritif era L.两种淡水双壳类的 20对微卫星引物
对江西青岚湖 5种淡水蚌群体进行了 PCR扩增,选
出了 8对多态性较高的引物,分别对三角帆蚌、褶纹
冠蚌、洞穴丽蚌、射线裂脊蚌和中国尖嵴蚌 5种蚌类
群体进行了遗传多样性分析。结果表明, 5个群体
间有较高的遗传多样性。W ang等 [ 23]利用太平洋牡
蛎的 32对微卫星引物在三角帆蚌基因组 DNA中进
行 PCR扩增,筛选出了 13对引物可在三角帆蚌基
因组中扩增出特异性条带, 表明部分太平洋牡蛎的
微卫星引物可以用于三角帆蚌基因组的分析, 这将
为其它贝类微卫星标记的开发提供了参考依据。
Dav id等 [ 24]用 10个微卫星标记分析了 Lamp silis fas

ciola群体的遗传结构, 基因流动情况, 结果表明,加
拿大 Ontario流域 Lamp silis fascio la群体不是随机交
配的, 而有着显著的群体遗传结构, 且基因流动明
显。L i等 [ 25]对三角帆蚌的两个养殖群体和来自鄱
阳湖的四个野生群体用 8个微卫星位点分析了它们
的遗传特征。结果表明, 野生群体的等位基因数要
比养殖群体多,且野生群体间没有明显的遗传分化,
说明鄱阳湖的这 4个群体可归为一个群体。虽然两
个养殖群体含有较多的等位基因, 但遗传的随机漂
变和近交已引起了遗传多样性的降低, 我们应该采
取措施阻止这种遗传多样性的退化, 微卫星标记技
术可用于检测这些群体的遗传分化, 对三角帆蚌的
生物多样性进行保护。
4 中国蚌类微卫星标记研究展望
我国蚌科有一百多种,是蚌科物种多样性丰富
的地区之一 [ 26 ]。随着湖泊、河流等内陆水域污染
程度加剧、对蚌科栖息地的人为干预和资源的过度
开发利用,在一定程度上对蚌类的种质资源造成破
坏, 使该类动物的生物多样性受到了极大的影响,因
此对该类动物的保护已经刻不容缓。对蚌的保护策
略来说,不仅要保护蚌类及其宿主鱼的多样性,也要
保护其遗传的多样性 [ 27 ]。微卫星标记是一种 DNA
分析手段,是群体遗传学研究中普遍使用的分子遗
传标记,可广泛应用于蚌类遗传多样性的研究,为我
国蚌类动物生物多样性的保护提供基础的分子生物
学信息。近年来, 淡水蚌类微卫星的研究报道日益
增多。而我国蚌类动物微卫星方面的研究还很少,
因此,通过开发研究微卫星 DNA标记, 探讨中国蚌
科的系统发育,遗传多样性分布情况等,可为进一步
研究中国淡水贝类的生物多样性, 为保种工作提供
理论依据。
参 考 文 献
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