全 文 ：第 29 卷 第 5 期
2010 年　10 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of Huazhong Agricultural Univer sity
Vol.29　No.5
Oct.2010 , 629 ～ 633
收稿日期:2010-03-17;修回日期:2010-06-10
＊中国科学院知识创新工程重要方向项目(KSCXZ-YW-N-032)资助
＊＊通讯作者.E-mail:yangb o@w bg cas.cn
胡　磊 ,男 , 1984年生 ,硕士研究生.研究方向:植物生物技术.E-mail:hulei@w bgcas.cn
利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物＊
胡　磊1 , 2 　高　丽1 　杨　波1＊＊
1.中国科学院武汉植物园 , 武汉 430074;2.中国科学院研究生院 , 北京 100049
摘要　将花榈木(Ormosia henry i P rain)基因组 DNA 用 MseⅠ 酶切后 , 连接相应的接头 , PC R扩增后回收
500～ 1 000 bp 片段 ,与用生物素标记的微卫星探针(GA)12 ,(AAG)8杂交后 ,运用磁珠富集含有微卫星序列的
DNA 片段。获得的序列经 PCR扩增 ,连接载体 pM D19-T ,构建富含微卫星序列的小片段插入文库;用 PCR 法
筛选文库 , 获得 78 个阳性克隆 , 经测序分析得到 24 个微卫星序列 , 成功设计出 9 对引物。
关键词　花榈木;微卫星标记;磁珠富集;多态性
中图分类号　Q 346+.5　　文献标识码　A　　文章编号　1000-2421(2010)05-0629-05
　　微卫星标记又称为简单序列重复(simple se-
quence repeats ,SSR),是广泛分布于真核生物基因
组中 ,由 1 ～ 6个碱基串联 、重复组成的 DNA 序列 ,
序列因重复单元与重复次数的不同而表现出高度的
多态性[ 1] 。由于微卫星序列的两端多是保守的单拷
贝序列 ,因此 ,可以根据两端序列设计特异性引物 ,
经 PCR扩增出微卫星序列 ,其长度多态性可以作为
DNA 分子标记 。微卫星分子标记具有需要 DNA
样品量少 、广泛分布在真核基因组中 、多态性高 、重
复性好 、共显性遗传等优点 ,已被广泛应用于遗传多
样性研究 、分子辅助育种 、遗传图谱的构建 、基因定
位 、品种指纹图谱构建等领域;缺点是使用微卫星标
记之前必须要知道两端的保守序列 ,设计出引物。
目前 ,开发微卫星分子标记引物的方法主要有:从已
知的表达序列标签(EST)序列中查找 ,构建富含微
卫星位点的基因组文库 ,从近缘物种已开发出的
SSR引物中寻找合适的引物[ 2] ;其中 ,以构建富含
微卫星的基因组文库 ,用磁珠富集特异性片段的方
法效率最高。
花榈木(Ormosia henry i Prain),为豆科红豆树
属常绿乔木 ,属国家二级重点保护树种 ,主要分布于
我国亚热带地区 ,生长在 100 ～ 1 300 m 的山地 、溪
边 ,是制作高档家具的用料 ,也是优良的园林绿化观
赏树木 ,还是一种重要的中药材[ 3] 。目前 ,对花榈木
还没有进行分子水平上的研究 ,本试验首次开发花
榈木 SSR引物 ,旨在为后续花榈木的遗传多样性的
研究及种质资源的保护等打下基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
DNA 提取材料为花榈木试管苗 ,来源于中国科
学院武汉植物园组织培养室 。用于引物多态性分析
的材料为分别采自湖北省咸宁市和恩施地区的 8个
不同表型的花榈木叶片 。
1.2　试验方法
1)花榈木基因组 DNA 的提取。采用改良的
CTA B法[ 4] 提取花榈木基因组 DNA , Brim- IOA-
0004型紫外分光光度计测定 260 和 280 nm 处
的吸光值 , D26 0和 D 280 ;根据 D2 60/D 280的比值计
算 DNA 的质量浓度 ,并将其调整为 0.050 g/L
备用 。
2)基因组 DNA 的酶切与接头连接 。用 Mse Ⅰ
(105 U/ L)在 37 ℃下酶切 3 h , 65 ℃下 , 20 min灭活
内切酶;反应体系 25 μL ,包括 2.5 μL 的 10 × NE
Buf fer 2 ,0.25 uL 的 100 ×BSA , 0.5μL 的MseⅠ
内切酶 ,10 μL 的 DNA , 11.75 μL 的灭菌双蒸水。
酶切后的基因组 DNA 与相应的接头连接 ,Mse Ⅰ的
接头分别由 14 bp 的寡核苷酸链 5′-TACTCAG-
DOI :10.13300/j.cnki.hnlkxb.2010.05.021
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 29 卷　
GACTCAT-3′和 16 bp 的寡 核 苷酸 序列 5′-
GACGA TGACCTGAG-3′组成;反应体系 30μL ,包
括 T4 DNA Ligase(4×104 U/L)0.1 μL ,1μL 的上
下接头 ,3 μL 的 10 ×T4 Buffer ,酶切后的 DNA 15
μL ,灭菌双蒸水 10.9μL ,16 ℃过夜连接;连接后的
混合物在 65 ℃反应 20 min ,灭活连接酶。
3)连接产物的扩增 。过夜连接后的混合物以由
17 bp组成的MseⅠ -N 兼并引物进行 PCR扩增 ,
PCR程序为:94 ℃预变性 5 min , 94 ℃ 30 s , 53 ℃
60 s ,72 ℃60 s ,30个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。
Mse Ⅰ -N 碱基序列为 5′-GA TGAG TCCTGAG-
TAAN-3′。
4)生物素探针杂交与磁珠富集 。以(AAG)8 ,
(GA)12为生物素探针 , 95 ℃变性 5 min ,(AAG)8探
针杂交温度为 48 ℃,(GA)12探针杂交温度 55 ℃。
250μL 杂交体系中包括 20 μL 的 DNA , 52.5 μL 的
20×SSC(3 mol/L NaCl ,0.3 mo l/L C6H 5Na3O 7),
1.75 μL 的 10%SDS ,4.5μL 的 50 pmo l/L 的生物
素探针及 171.25 μL 的双蒸水 。磁珠富集采用
Promega 的 MagneSphere 磁珠 ,将与生物素探针杂
交好的 DNA 与处理好的磁珠悬浮液混合 ,室温放
置 30 min并混匀;在磁场中吸附磁珠 ,吸取上清;低
严谨洗脱时采用 500 μL 的 TEN1000 (10 mmo l/L
Tris-HCL , 1 mmol/L EDTA , 1 mo l/L NaCl , pH
7.5)在室温下冲洗磁珠 ,重复 2 次 ,每次 8 min。高
严谨洗脱时采用高严谨洗脱液(10 μL 的 20 ×
SSC+10 μL 10% SDS +980 μL 的双蒸水),每次
500μL ,在 42 ℃(AAG 探针)/50 ℃(GA探针)下冲
洗磁珠 2次 ,每次8 min ,然后室温下冲洗磁珠 4次 ,
每次 8 min。磁场中吸附 ,吸取上清液后 ,加入 50
μL TE ,95 ℃变性 5 min ,使目的片段从杂交复合物
上解离下来 ,磁珠吸附收集上清液。
5)富集 DNA 片断的克隆与测序。取富集回收
产物5μL ,以MseⅠ -N 简并引物PCR扩增 ,1.5%
凝胶电泳检测 ,发现高严谨洗脱液中条带越来越淡 ,
表明非特异性吸附产物已基本洗脱下来。切胶回收
500 ～ 1 000 bp 的条带 ,连接到载体 pMD19-T 上 ,
然后转化到大肠杆菌(DH 5α)感受态细胞中 ,涂布
于含有 100 mg/L 的氨苄青霉素的 LB 固体培养基
上 ,37 ℃过夜培养 ,挑取阳性克隆 ,在含有氨苄青霉
素的 LB 液体培养基中 ,摇床上 37 ℃, 225 r/min培
养过夜 。用 M13引物进行 PCR扩增检测 ,选取 500
bp左右的片段送至上海英骏生物技术有限公司测
序 。
6)引物设计及多态性分析。测序所得结果用
Vecto rscreen(ht tp://www .ncbi.nlm .nih.gov/
VecScreen/VecScreen.htm l)和 SSR Hunter 1.3软
件分析 , 找出含有重复单元的序列 , 用 Primer
Premie r 5软件设计引物 ,以 8个不同表型的花榈木
基因组 DNA 为材料检测引物多态性 。PCR扩增体
系为 10 μL ,包括 4.5 μL 的灭菌双蒸水 , 1 μL 的
10×Taq buf fer ,0.6μL 的 Mg 2+(25 mmol/L),0.2
μL 的 dNTPs(10 mmol/L), 0.1 μL 的 Taq 酶
(5 U/μL),前后引物各 0.3 、3μL 的 DNA 。PCR反
应程序为 94 ℃预变性 5 m in , 94 ℃ 30 s ,各引物的
退火温度(见表 2)60 s , 72 ℃90 s ,35个循环 ,最后
72 ℃延伸 10 min。PCR产物在 95 ℃变性 5 min
后 ,放置在冰上 ,取 3 μL 在变性聚丙烯酰胺凝胶上
电泳 ,电泳缓冲液 1×TBE ,在 Sequi-Gen G T sys-
tem(BIORAD ,USA)电泳仪上 , 75 W 电压下 ,电泳
约 1 h ,银染后检测多态性。根据 Nei[ 5] 和 Bostein
等[ 6] 公式计算有效等位基因数(Ne),群体遗传杂合
度(H)和多态信息含量(P IC)。
2　结果与分析
2.1　阳性克隆检测
以菌液为模板 , PCR扩增 ,筛选重组克隆。选
取片段长度在 500 bp 左右的 78个阳性克隆测序 ,
经 Vecto rscreen , SSR Hunter 软件分析测序结果 ,
其中 23个含有微卫星序列 ,成功设计出 9对表现出
多态性的引物 ,已在 GeneBank 中登记(GeneBank
Accession Numbe r为 GU270298-GU270321)。
M.Maker;1～ 12:阳性克隆 Posi tive clones.
图 1　PCR筛选花榈木基因组阳性克隆电泳检测结果
Fig.1　Screening of positive clones from Ormosia henryi
Praingenome by PCR amplification
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　第 5 期 胡　磊 等:利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物 　
2.2　花榈木微卫星特征分析
根据Weber[ 7] 提出的微卫星分类标准 ,将所获
得的微卫星序列分为完美型(重复序列中没有间隔
或是其他类型的重复序列),非完美型(重复序列中
存在其他碱基)和复合型(由不同碱基核心序列串联
重复组成);从表 1 中可以看出完美型的微卫星有
21个 ,非完美型的有 2个 ,复合型的有 1 个 ,其中可
以发现 GA 、CT 居多 ,也有 TCC 、TCT 、GAA 等重
复单位 。
表 1　花榈木 DNA富集文库中的微卫星序列特征1)
Table 1　Characters of microsatelli te sequences from
an enriched DNA library in Ormosia henryi Prain
位点 Locu s 重复序列 Repeat region 重复类型 Repeat ty pe
A01
A02
(GA)17
(AG)14
P
P
A05 (GT)6(GA)13 C
A06 (GA)11 P
A07 (TC)10 P
A08 (AG)13 P
B01 (TC)6 T 2(T C)5 I
B02-1 (CT)15 P
B02-2 (TG)9 P
D01 (GAA)5 P
E06 (AG)12 P
E07 (TCT)6 P
E08 (AG)11 P
E09 (GA)14 P
E10 (GA)15 P
E11 (GA)14 P
E12 (TCC)5 P
F05 (TCT)8 P
F07 (CT)8C2(CT)7 I
F10 (GA)11 P
F11 (AG)20 P
G06 (TC)11 P
G07 (CT)13 P
G10 (GAA)8 P
　1)P.完美型 Perfect;I.非完美型 Im perfect;C.混合型 Com-
pound.
2.3　花榈木微卫星引物的初步筛选及多态性分析
以采自湖北省咸宁市和恩施地区的 8个不同表
型的花榈木基因组 DNA 为材料 ,采用变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳筛选微卫星引物。在 24对引物中 ,有
9对表现出多态性 ,可用于后续研究 。图 2 为花榈
木微卫星引物 E10的扩增结果 ,该引物在 6 个花榈
木基因型中扩增出 2条谱带 ,另 2 个中检测出 1条
谱带 ,但各条谱带分子量大小不一样 ,说明 E10为
高多态性引物。各微卫星引物序列及多态性分析结
果见表 2。
　M.Maker;1～ 4.采集自咸宁的花榈木 Ormosia henryi Prain col-
lected f rom Xianning in Hubei Province;5～ 8.采集自恩施的花榈木
Ormosia henryi Prain collected f rom Enshi in Hubei Province.
图 2　花榈木微卫星引物 E10 初步筛选扩增结果
Fig.2　The screening resul ts of E10 microsatellite
marker of Ormosia henryi Prain
3　讨　论
试验采用磁珠富集法开发花榈木微卫星分子标
记 ,安全 、快速 、高效 ,避免了传统的 SSR开发策略
中用到的同位素标记。从 78个阳性克隆中筛选得
到 24个富含微卫星的序列 ,效率达到 30.7%,远高
于传统方法的 2%～ 3%的微卫星获得率[ 2] 。
从表 1中可以看出 ,所获得的微卫星序列中以
完美型为主 , 有 21 个 , 占到整个微卫星序列的
87.5%,非完美型与混合型较少。重复碱基数以双
核苷酸居多 ,其中以(GA)n/(CT)n最多 ,与报道的
豆科模式植物蒺藜苜蓿的 ES T —SSRs中的重复碱
基的类型有一致性[ 8] 。
Weber[ 7]认为只有核心序列的重复次数高时 ,
才能表现出较高的多态性信息含量—PIC(poly-
morphic informa tion content)值 ,前人的研究[ 9-10] 表
明重复次数低于 5的微卫星序列 ,几乎检测不出多
态性 ,重复次数多的微卫星序列既能在种间又能在
种内产生多态性 ,但重复次数少的微卫星序列仅能
在种内产生多态性。本次试验所得微卫星的核心序
列重复次数在 10以上的有 18个 ,占所得微卫星序列
的 75%,有利于后期筛选多态性信息含量高的分子
标记 ,进行花榈木的遗传多样性分析和遗传图谱的构
建。
在运用磁珠富集法分离微卫星序列时 ,影响微
卫星序列富集的主要因素是富集回收阶段洗脱的效
率 。洗脱的目的是为了洗去非特异性结合的序列。
631
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 29 卷　
Refseth 等[ 11]发现这些非特异性结合的片段在经过
非严谨洗脱与严谨洗脱后依然难以完全洗脱。高国
庆等[ 12] 认为磁珠富集法最大的障碍是 DNA 与磁珠
表面的非特异性结合。在使用磁珠富集产物回收阶
段 ,洗涤的温度是影响磁珠富集效率的重要因素。
试验发现在洗涤液浓度不变的情况下 ,洗涤的温度
与洗脱的效率成正比 ,但当洗脱的温度过高时 ,洗脱
效率反而下降 ,与之前的报道[ 13-14] 略有不同 。试验
中 ,以(GA)12 ,(AAG)8为探针 ,当杂交温度分别为
48 、55 ℃,洗脱温度分别为 42 、50 ℃时 ,富集效果比
较理想 。洗脱温度超过这个温度时 ,富集效率反而
下降。
表 2　花榈木微卫星位点分析及其引物序列1)
Table 2　Characteristics and primer sequences of nine microsatellite loci in Ormos ia henryi Prain
位点
Locu s
重复序列
Repeat region
引物序列
Primer sequen ces(5′～ 3′) t/ ℃
片段大小/ bp
S ize range
N A Ne H P IC
登录号
Acces sion N o.
A01 (GA)17 TG TGGGGATGAAGAAGAAGC
CCCCAT T TTG TCT TGGT TAC
56 161～ 210 4 2.40 0.583 3 0.529 5 G U270298
A05 (GT)6(GA)13 AATGGGGAG TTCATAGACGC
AT TT TGGGGACAGCA TACGG
56 223～ 268 3 2.90 0.656 2 0.581 5 G U270300
B02-1 (CT)15 GAG TCCTGAGT AACCATCCA
CT TCTT TAT GTGGTGT TCCC
52 133～ 163 4 3.77 0.735 0 0.685 4 G U270305
E06 (AG)12 GTCA TTGCTGT TGAAGA TTG
T TGGATAGAACT CACCT TAG
52 184～ 217 3 2.31 0.567 9 0.489 0 G U270308
E08 (AG)11 GTAGAGCAACCCCACCGAT
ACCCCGACAAAGTCCACA
55 215～ 225 2 1.69 0.408 1 0.324 9 G U270310
E09 (GA)14 TCCCAATCAAACCCCTAA
ATCCT TGTGAAATCATAGACGA
54 137～ 165 3 2.78 0.640 0 0.563 2 G U270311
E10 (GA)15 CCTGAGT AAACGGCAAAA
CATGAGT ATCGCCTTGAA
52 200～ 220 5 3.50 0.714 3 0.665 7 G U270312
F05 (T CT)8 TCGCTCCCT T TCT TGTCT
CAT T TCCCCAT TCACGGT
54 205～ 250 3 2.12 0.528 9 0.473 2 G U270315
F11 (AG)20 AACATGAAGATG ATGGAAAG R
CCTGAGT AAT TAGTAGCACC
54 153～ 195 3 1.95 0.486 1 0.423 5 G U270318
　1)t:退火温度 Annealing tem peratu re;N A:等位基因数 Number of alleles revealed;H :位点杂合度 H eteroz ygosity;Ne:有效等位基
因数 Effective number of alleles;P IC:多态信息含量 Polym orphic information content.
　　花榈木为国家二级重点保护野生植物 、优良的
园林绿化树种 、制作高档家具的用料和重要的中药
材 ,但关于花榈木遗传多样性的研究还未见报道 ,而
微卫星分子标记是构建遗传图谱 ,分析遗传多样性
的理想工具 ,试验开发的 9对 SSR引物 ,在 8个不
同表型的花榈木基因组 DNA 中表现出多态性 ,可
以应用于后续研究 。
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henryi Prain by Magnetic Beads Enrichment
H U Lei 1 , 2 　GAO Li1 　YANG Bo1
1.Wuhan Botanical Garden ,Chinese Academy o f S ciences ,Wuhan 430074 ,China;
2.GraduateUniversity of Chinese Academy o f Sciences ,Bei j ing 100049 ,China
Abstract　The genomic DNA of Ormosia henry i Prain w as dig ested by MseⅠ and lig ated w ith adapt-
ers.After PCR amplification , the f ragments ranging f rom 500 to 1 000 bp w ere isolated ,purif ied and hy-
bridized w i th biot in-labeled probes (GA)12 and(AAG)8 .Fragments containing simple sequence repeats
(SSR)were enriched using magnetic beads coated wi th streptavidin , then cloned into pMD19-T vectors
and transformed into E.col i to const ruct SSR genomic DNA library .78 po sitive clones we re screened
w ith PCR method.After sequenced ,24 microsatellite sequences w ere identified and 9 pairs of SSR prim-
ers of Ormosia henry i Prain w ere developed successfully .
Key words　Ormosia henry i Prain;microsa tellite ma rkers;magnetic beads enrichment;po lymo r-
phic
(责任编辑:陆文昌)
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