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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
玉米核糖体失活蛋白基因 z108在烟草
原生质体中的转化及其表达
周颖 姜国勇
(青岛农业大学植物基因工程研究所,青岛 266109 )
  摘  要:  利用与根癌农杆菌共培养的方法将玉米核糖体失活蛋白基因 z108及其融合基因 GUS导入烟草叶肉原生质体
细胞。试验结果表明, 烟草叶片在含有 1. 0%纤维素酶和 0. 5%离析酶的裂解液中, 以 0. 5 M甘露醇、5 000. 0 m g /L CaC l2为渗
透压调节剂, 25 保温 12- 14 h,可获得纯化的原生质体细胞;纯化的叶肉原生质体细胞与根癌农杆菌菌株 pC am1301 / 91
108
共培养 30 m in, 经 25 mg /L潮霉素筛选,转化率可达 17. 84%。转化体细胞经 X
G luc染色、PCR和 RT
PCR检测证明玉米核糖
体失活蛋白基因 z108已整合到烟草原生质体细胞的核基因组中并获得表达。
关键词:  玉米核糖体失活蛋白 烟草原生质体 转化
Transformation and Expression ofMaize R ibosome
inactivating
Protein Gene z108 in Tobacco Protoplasts
Zhou Y ing JiangGuoyong
( Institute of P lant Genetic Engineering, Q ingdaoAgricultural University, Q ingdao 266109)
  Abstrac:t  In th is study, m a ize ribosome
inac tivating prote in gene z108 and its fusion geneGUS w ere introduced into tobaccom es

ophy ll pro top lasts mediated byA. tum efaciens. The results show ed tha t, through the treatments using enzym e
regen tm ixture o f 1. 0% ce l

lu lase, 0. 5% m acero zym e, 0. 5 m o l/L mann ito l and 5 000. 0 m g /L CaC l2 incubated a t 25 for 12- 14 h, high purified tobacco proto

p lasts w ere obta ined. The pro top lasts we re co
cu ltured w ith A. tum efaciens pCam1301 / 91
108 for 30m in and then screened unde r 25
m g /L hygrom ycin. The transfo rm ation ra tio cou ld reach to 17. 84% . Furtherm ore, by X
G luc Sta in ing, PCR de tecting and RT
PCR ana l

ys is, it confirmed that z108 had been integrated into tobacco genom e o f pro top lasts and expressed in vivo.
Key words:  M aize r ibosom e
inactivating prote in gene Tobacco pro toplast T ransfo rma tion
收稿日期: 2010
01
11
基金项目:国家自然科学基金 ( 30771440 ),青岛市科技攻关计划
作者简介:周颖,女,硕士研究生,研究方向:植物基因工程; E
m ai:l yingying198398@ yahoo. com. cn
通讯作者:姜国勇,男,教授,从事植物分子生物学和植物分子病理学研究; E
m ai:l jiangguoyong99@ yahoo. com. cn
以原生质体为受体实施农杆菌共培养转化目
标基因并使之表达, 在研究功能基因的细胞定位
和生物学机制方面是一种行之有效的方法 [ 1]。罗
建平等 [ 2]用根癌农杆菌菌株与云南红豆杉原生质
体克隆共培养,转化体经过高压纸电泳和 HPLC分
别检测冠瘿碱和紫衫醇的合成。T ripp等 [ 3]用建
立起来的番茄原生质体瞬间表达系统验证了热激
转录因子 H sfs与热激蛋白 H sps过量表达时 sH sp、
H sp70及 Hsp100等热激伴侣蛋白家族的功能和表
达规律。
玉米核糖体失活蛋白 ( ma ize r ibosome
inactiva

ting pro te in, M a ize RIP )是在玉米胚乳中产生的一种
具有 N
糖苷酶活性的单链蛋白,经水解酶的作用可
转变成有活性的!型双链核糖体失活蛋白 [ 4] , 该蛋
白对植物病毒和真菌病害具有广谱抗性。前期研究
已经获得玉米核糖体失活蛋白基因 z108的烟草转
化体,通过组织化学染色发现在叶片、维管束以及表
皮毛中具有高丰度的基因表达 [ 5]。本研究将含有
z108基因的农杆菌菌株 pC am1301 / 91
108转化烟
草叶肉原生质体细胞,并对其转化细胞进行分子生
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
物学和细胞学验证,获得了 z108基因表达的烟草原
生质体。这项研究目的在于通过建立普通烟草的瞬
间表达转化体系,获得目标基因表达的转化体,为研
究基因编码蛋白的功能和互作机制奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为普通烟草 (N. tabacum L. ) K326无
菌苗叶片。根癌农杆菌 (A. tum efaciens )转化菌株
pCam1301 /91
108由本实验室构建。
1. 2 原生质体的分离
取两月龄的烟草无菌苗叶片 0. 2 g, 切成细丝,
置于 13%甘露醇中质壁分离 1. 5 h, 然后置于 2mL
酶液中进行酶解。裂解液组成为 CPW 盐溶液
(KH 2PO4 27. 2mg /L、KNO3 101. 0mg /L、CaC l2
2H 2O
05%、MgSO 4
7H2O 246. 0 mg /L、K I 0. 16 mg /L、
CuSO4
5H 2O 0. 025mg /L ) , 0. 5mo l/L甘露醇, 10%
纤维素酶 ( Cellulase R
10, Onzuka)和 0. 5%离析酶
(M acerozym e R
10, Onzuka), 裂解液经 022
m微
孔滤膜过滤除菌, pH 5. 8。在 25 恒温培养箱中黑
暗静置 12- 14 h进行酶解。
1. 3 原生质体的纯化
原生质体经 0. 08mm孔径尼龙网过滤, 900 r /m in
离心 7m in。吸去上清,向所得沉淀中加入 0. 6 mL的
甘露醇,轻轻吸打, 300 r /m in离心 10 m in。含 10%
甘露醇的 CPW 10溶液洗涤 2次, M S液体培养基洗
涤 1次, 随后, 加入 1 - 2 mL液体培养基悬浮原
生质体。
1. 4 原生质体细胞的转化与转化体筛选
将农杆菌转化菌株 pC am1301 /91
108接种于
YEB液体培养基 (含 50 mg /L R if和 50 mg /L Kan)
中, 28 , 180 r/m in,培养至 O D600 = 0. 6- 0. 8。取 1
mL菌液, 6 000 r /m in离心 5 m in,弃上清。用 1mL
YEB液体培养基悬浮菌体,离心弃上清。加入 1mL
M S液体培养基 (含乙酰丁香酮 25mg /L ) , 28 低速
振荡培养 1- 2 h。加入 1 mL原生质体悬浮菌体,
25 培养 30m in。离心弃上清。液体培养基重新悬
浮后加入头孢氨苄 ( Ce f)和潮霉素 (H yg) , 25 再培
养 24 h。取共培养细胞, 离心弃上清, 加入 DAB染
色液筛选转化体细胞, 37 染色 30 m in,镜检。
1. 5 GU S酶活性检测
转化后的原生质体细胞加入 X
G luc染色液,
37 染色 30 m in。离心弃上清, 加入少量脱色剂悬
浮原生质体细胞,镜检。
1. 6 PCR检测
采用 CTAB法提取转化的和非转化的烟草原生
质体细胞总 DNA。分别以 Tz1、Tz2和 Tz2a、TG为
目标基因和报告基因的引物。引物 T z1∀5#
ATGGC

CGAGATAACCCTAGAGCC GAG
3#; 引物 Tz2: 5#

GGCCTCGTCGTCGTCGTTGTC
3#; 引物 Tz2a: 5#
GA

CAACGACGA CGACGAGGCC
3#; 引 物 TG: 5#

AGAAATCATGGAAGTAAGACTG
3#。
PCR体系总体积为 50
L; 程序为 95 , 10m in;
95 , 30 s; 55 , 30 s; 72 , 1. 5 m in; 35个循环;
72 ,延伸 10 m in。用 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检
测结果。
1. 7 RT
PCR检测
对原生质体提取总 RNA, 利用 AMV Sing le Step
RT
PCR K it(大连宝生物 )反转录。PCR程序为 95 ,
10m in; 95 , 30 s; 55 , 30 s; 72 , 1 m in; 35个循环;
72 ,延伸 10m in。1. 0%琼脂糖凝胶电泳分析。
2 结果与分析
2. 1 烟草原生质体的制备
将质壁分离后的烟草叶片放入含 1. 0%纤维素酶
和 0. 5%离析酶中,以 0. 5mol /L甘露醇、5 0000mg /L
CaC l2为渗透压调节剂, 25 保温 12- 14 h,可解离出
大量原生质体细胞 (图 1)。随后,采用蔗糖 - 甘露
醇界面法进行纯化,通过离心使形态均匀、大小基本
一致的原生质体处于等渗液 ( 0. 5mo l /L甘露醇 )和
分离液 ( 23%蔗糖 )的分界面上, 将细胞碎片去除,
以获得纯净的原生质体细胞 (图 2) , 纯净原生质体
细胞的产量可达 10. 6 ∃ 106个 /mL。
图 1 酶解后的烟草
原生质体细胞
图 2 纯化后的烟草
原生质体细胞
100
2010年第 4期 周颖等:玉米核糖体失活蛋白基因 z108在烟草原生质体中的转化及其表达
22 烟草原生质体的转化
将制备好的 K326烟草叶肉原生质体细胞与含
有目标基因 z108 的农杆菌 pCam1301 / 91
108菌液
25 混合培养 30 m in, 重新悬浮后加入头孢氨苄
( C ef)和潮霉素 (Hyg) ,在 25 条件下再培养 24 h。
这些原生质体的转化体细胞在 25mg /L潮霉素的环
境下具有活性,经 DAB染色后,依然呈现绿色, 且叶
绿体分布均匀。非转化体因没有潮霉素抗性被杀
死,细胞经 DAB染色后呈褐色 (图 3)。
图 3 潮霉素筛选和 DAB染色后的烟草原生质体细胞
通过 DAB染色、计数来计算原生质体细胞的转
化率。统计结果表明, 在潮霉素浓度为 25 mg /L的
条件下, 具有潮霉素抗性的绿色细胞的比例达到
17. 84% ;当潮霉素浓度为 50 mg /L时, 具有潮霉素
抗性的绿色细胞达到 15. 40%; 当潮霉素浓度为 100
mg /L,具有潮霉素抗性的绿色细胞仅有 6. 82%。
23 转化体的细胞学验证
原生质体细胞转化 24 h后再经过 X
Gluc染色
后发现, 具有潮霉素抗性的细胞在显微镜下呈现出
GUS基因表达的蓝色,表明 z108及其报告基因 GUS
已经在烟草原生质体细胞中双双获得表达 (图 4)。
图 4 X
G luc染色后的烟草原生质体细胞
2. 4 转化体的分子生物学验证
分别以 Tz1、Tz2和 T z2a、TG为引物,以非转化
的原生质体为对照进行具有潮霉素 ( 25 mg /L、50
mg /L和 100mg /L 3个浓度 )抗性的原生质体细胞
实施 PCR检测。结果显示, 引物 Tz1- Tz2的扩增
产物均为 903 bp(图 5) ,引物 Tz2a、TG的扩增产物
均为 746 bp(图 6)。表明具有潮霉素抗性的原生质
体细胞核基因组中同时包含有玉米核糖体失活蛋白
基因 z108及其报告基因 GUS。
M. G ene Ru ler 100 bp DNA LadderM arker; 1.质粒
(阳性对照 ) ; 2.非转化体细胞; 3- 7.转化体细胞
图 5 烟草转化体细胞的 PCR扩增产物 ( Tz1
Tz2)
M. G ene Ru ler 100 bp DNA LadderM arker; 1.质粒
(阳性对照 ) ; 2.非转化体细胞; 3- 7.转化体细胞
图 6 烟草转化体细胞的 PCR扩增产物 ( Tz2a
TG)
RT
PCR扩增结果显示, 以 Tz1、T z2为引物的扩
增产物为 903 bp, 分别用 H in d !、N co I酶切 RT

PCR的扩增产物, H ind !的酶切片段为 790 bp和
113 bp, N co I的酶切片段为 428 bp和 475 bp (图
7)。表明玉米核糖体失活蛋白基因 z108已在烟草
原生质体细胞中转录和表达。
M. G ene Ru ler 100 bp DNA LadderM arker; 1.转
化体细胞; 2.H ind !酶切产物; 3. N co I酶切产物
图 7 烟草转化体细胞的 RT
PCR扩增产物与酶切鉴定
101
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
3 讨论
31 原生质体的制备
烟草原生质体的制备受基因型、酶的种类和浓
度、渗透压、纯化方法等因素的影响 [ 6, 7] , 其纯度、整
齐度以及质膜的通透性对于基因转化的效率和结果
极其重要。解离后的原生质体细胞极易受渗透压变
化的影响而导致质膜破裂, 影响转化效率。为了防
止原生质体破裂,酶解液中通常需要保持一定浓度
的甘露醇、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖硫酸钾等试剂来稳
定渗透压 [ 8- 10]。因此,用于基因转化的烟草原生质
体细胞的培养就要最大程度地满足转化效率的提
高,并且通过增加质膜的通透性、细胞的稳定性来提
高转化率。基于这样的要求, 用 1. 0%纤维素酶和
0. 5%离析酶组合以及加入 0. 5 mo l/L甘露醇, 不仅
可以彻底去除细胞壁纤维素残留物, 也减少了对叶
肉细胞原生质体的损伤。在离心洗涤过程中原生质
体细胞保持稳定完好,破损少, 分离出的原生质体细
胞看起来形态完整、饱满。同时,在原生质体的制备
过程中,酶解液中添加 5 000. 0mg /L的 CaC l2, 便可
起到较好的稳定质膜、减少破损的作用,有利于原生
质体细胞的转化。
3. 2 原生质体的遗传转化
以原生质体细胞来获得转化体的方法重在提高
原生质体的转化率。 Shillito等 [ 11 ]为了提高转化率,
将 PEG、热激及电激法结合起来,使烟草原生质体的
转化率达到 2%, 比单独使用 PEG效率提高了许多。
本试验是将 CPW盐溶液中的 Ca2+浓度由1 480. 0mg /L
增加到 5 000. 0mg /L,转化率可达 682% - 1784%。
这一方法的改进就是通过提高 Ca2 +的浓度造成细胞
内外跨膜电势、增大受体细胞内外压差促使外源
DNA更容易地摄入到原生质体中。PCR检测显示,
用大于 25mg /L潮霉素筛选的转化体都含有目标基
因的插入序列,表明 25 mg /L以上的潮霉素筛选对
消除转化体的假阳性、提高转化率较为有效。
参 考 文 献
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