全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 597
收稿 2009-12-10 修定 　2010-03-22
资助 国家自然科学基金(30 6 71 0 8 2)。
* 通讯作者(E-mail: jiajf38@nwu.edu.cn; Tel: 029-88303484)。
紫外辐射诱导烟草原生质体中 DNA 损伤的彗星电泳检测
张来军 1, 2, 郝建国 1, 贾敬芬 1,*
1西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 西安 710069; 2甘肃省陇东学院生命科学系, 甘肃庆阳 745000
提要: 以烟草原生质体为材料, 采用彗星电泳检测用0.5 W·m-2 紫外线以不同时间(0、5、10、30、60和120 s)诱导的烟草原
生质体中DNA的损伤。结果表明, 在 0~10 s的时间内代表DNA损伤程度的尾矩、Olive尾矩等参数与紫外线照射时间具
有良好的时间依赖关系。本文建立的烟草原生质体体系采用彗星电泳技术, 可以快速而灵敏地检测紫外线对植物细胞的损
伤程度。
关键词: 彗星电泳; DNA损伤; UV-B辐射; 烟草原生质体
Comet Assay on DNA Damage Induced by UV-B Radiation in Tobacco Proto-
plasts
ZHANG Lai-Jun1,2, HAO Jian-Guo1, JIA Jing-Fen1,*
1Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Northwest University, Xi’an
710069, China; 2Department of Life Science, Longdong College, Qingyang, Gansu 745000, China
Abstract: Protoplasts of Nicotiana sylvestris was used for experimental material to investigate DNA damage in
protoplast which was induced by 0.5 W·cm-2 UV-B for different time (0, 5, 10, 30, 60, and 120 s) by using
comet assay. The results showed that the indexes of tail moment and olive tail moment etc which detected the
DNA damage had statistically dose effect relationships with the time of UV-B radiation from 0 to 10 s. Comet
assay detected the degree of DNA damage of tobacco protoplast induced by UV-B radiation rapidly and sensitively.
Key words: comet assay; DNA damage; UV-B radiation; tobacco protoplast
大气平流层臭氧层减薄, 并导致到达地表紫外
线 B (UV-B, 280~320 nm)辐射增强, 对生态系统和
动植物生长造成了深远的影响。报道表明增强
UV-B辐射会引起细胞DNA的损伤, 形成环丁烷嘧
啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimer, CPD), 影响
细胞正常代谢和分裂, 细胞分裂速度减慢, 影响基
因的表达, 改变细胞蛋白质组成和含量(Hollósy
2002), 这与DNA受到损伤、DNA复制受到抑制
有关。
彗星电泳(comet assay)又名单细胞凝胶电泳
(single cell gel electrophoresis, SCGE), 各种理化因
子作用细胞后引起的DNA链断裂可用这一方法检
测, 并在统计学基础上评估损伤程度(Fairbairn等
1995)。此法由Ostling和 Johanson于 1984年发明,
后来 Singh等在此基础上引入碱性环境, 得到进一
步发展。其基本原理是DNA超螺旋与其赖以附着
的核骨架或核基质经高盐及去污剂裂解后, 再在碱
性(pH>12.3)环境中进行解旋和电泳, 断裂的DNA
碎片就会释放并向阳极泳动, 荧光染色后在显微镜
下观察呈 “彗星 ”状(Fairbairn等 1995; McKelvey-
Martin等 1993)。过去 20年的研究表明, 慧星电泳
是一种可靠的定量DNA损伤和修复的方法, 因其简
单、快速、灵敏的特点, 被广泛应用于毒理学、
生物学、医学和环境生物监测等领域。
应用彗星电泳技术检测动物细胞中DNA损伤
已经非常广泛, 技术也极为成熟, 但应用于植物细
胞中DNA损伤研究尚不广泛。Gichner等(2001,
2007, 2008)用机械游离植物细胞核的方法, 结合碱
技术与方法 Techniques and Methods
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性彗星电泳检测重金属、辐射及一些毒性化合物
对植物细胞DNA的损伤, 但国内类似报道并不多
见。近年来林爱军等(2005, 2006)以多种植物材料
为对象, 采用细胞核分离方法, 运用彗星电泳检测
植物的DNA损伤。蒋磊等(2006)和王静等(2007)
对植物材料进行整体紫外辐射, 再借助彗星电泳对
植物细胞中 D N A 损伤进行了检测。聂志刚等
(2009)曾用彗星电泳检测重金属诱导的拟南芥原生
质体中DNA的损伤。而用彗星电泳检测UV-B辐射
对烟草原生质体中DNA损伤至今还未见报道。
本文以酶解法获得烟草原生质体, 对其以一定
辐射剂量的UV-B进行不同时间处理后, 采用碱性
彗星电泳检测DNA的损伤, 为推广其在植物科学中
的应用范围和增强植物对UV-B辐射抗性的研究提
供参考。
材料与方法
1 试剂和仪器
试剂有低熔点琼脂糖(Amresco分装)、常熔
点琼脂糖(Spanish原装)、Triton X-100 (Roth产
品)、二甲基亚砜(DMSO, Amresco原装)、肌苷
酸钠(Sigma分装); 其余生化试剂均为分析纯。仪
器有 Tanon HE120 (Amersham Biosciences)电泳槽;
Leica DMLB 2 (Leica公司)荧光显微镜; 佳能A650
数码相机。彗星图像分析软件为CASP软件(casp-
1.2.2, http://casp.sourceforge.net/index.php)。
2 实验方法
2.1 烟草原生质体的游离 材料为林烟草(Nicotiana
sylvestris Speg. et Comes)的无菌苗。取充分展开
的叶子, 剪去叶片, 留叶脉, 撕去叶脉表皮, 再斜切
成段, 加入酶液(2%纤维素酶Onozuka R-10、0.5%
半纤维素酶、0.5%果胶酶Y-23、0.5%离析酶 R-
10、0.16 mol·L-1 CaCl2、0.1% MES和 0.4 mol·L-1
甘露醇, pH 5.8~6.2)于 28 ℃黑暗中酶解 6~12 h。
将酶解后的原生质体悬浮液用 200目不锈钢筛过
滤, 80×g离心 5 min。沉淀的原生质体悬浮在2 mL
0.16 mol·L-1的 CaCl2·2H2O (pH 5.8~6.2)中, 用注射
器(装上长针头)向离心管底部缓缓注入 6 mL 20%
蔗糖溶液, 60×g离心 5 min。在两相溶液的界面
之间分出一层纯净的原生质体带, 以吸管收集后再
用 8 mL 0.16 mol·L-1 CaCl2·2H2O (pH 5.8~6.2)悬浮备
用。
2.2 原生质体活性检测 原生质体用0.5%台盼蓝染
液染色 1 min, 然后在光学显微镜下观察。死的原
生质体被染成蓝色, 活的原生质体不被染色。随机
选取若干个视野, 统计总原生质体数和死原生质体
数, 计算细胞活力。
2.3 实验分组及 UV 处理 收集到的原生质体用
0.16 mol·L-1 CaCl2·2H2O (pH 5.8~6.2)调整细胞密度
至 1×105 mL-1, 接种于细胞培养板中(φ=20 mm, 500
μL·孔 -1) , 然后进行紫外线照射。紫外光源经过
cellulose diacetate滤膜(截止型长通滤光片, 292 nm
以下被滤除)获得UV-B光源, UV-B辐射处理的辐照
度为0.5 W·m-2 (秦牌紫外灯管, 30 W, 波长峰值305
nm, 宝鸡光源研究所生产)。实验以不经紫外线照
射为对照, 设定 5个照射时间, 分别为 5、10、30、
60和 120 s。之后同时上样进行电泳。
2.4 彗星电泳 (1)镀膜法制备底胶, 将洁净的载玻片
在 0.6%常熔点琼脂糖中浸没 1 min后, 置 37 ℃保
温箱中烘烤过夜。实验时将细胞悬液与低熔点琼脂
糖(37 ℃)以 1:1的比例在离心管中混匀, 用剪去尖
部的枪头将混合液滴在镀膜后的载玻片上, 盖上盖
玻片, 4 ℃下静置 3 min后取下盖玻片, 制得含细胞
胶层。(2)载玻片置于溶液(2.5 mol·L-1氯化钠、100
mmol·L-1 Na2EDTA、10 mmol·L-1 Tris和 1%肌苷酸
钠, pH 10, 用前加 1% Triton X-100和 10% DMSO)
中 4 ℃下裂解 1 h。 (3)用三蒸水于 4 ℃下水洗 3次,
每次 5 min。 (4)载玻片置于电泳缓冲液(1 mmol·L-1
Na2EDTA和300 mmol·L-1 NaOH, pH 13)中于4 ℃下
解旋15 min。(5) 4 ℃电泳15 min, 0.74 V·cm-1 (26 V,
300 mA)。(6) 400 mmol·L-1 Tris缓冲液(pH 7.5)中
和 3次, 每次 5 min。 (7)以冰冷的无水乙醇脱水 10
min, 室温晾干。(8) EB (20 μg·mL-1, 20 mL)染色, 镜
检, 照相, 每个处理随机取 50个细胞, 用 CASP分
析软件进行分析。试验重复 2 次。
2.5 彗星电泳数据的统计分析 选取彗星头部DNA
百分比(HDNA)、尾部DNA百分比(TDNA)、彗
星全长(comet length, CL)、尾长(tail length, TL)、
尾矩(tail moment, TM)和Olive尾矩(Olive tail moment,
OTM)作为分析指标。
用SPSS 13.0统计软件对上述指标进行单因素
方差分析和组间两两对比。
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结果与讨论
1 原生质体活性
酶解法获得的林烟草叶脉原生质体经20%蔗
糖漂浮后, 大小均匀, 纯度高, 用台盼蓝染色法测定
细胞死亡率, 细胞活力大于(95±5.6) % (图 1), 可继
续下一步试验。
2 彗星电泳检测
UV-B照射林烟草叶脉原生质体的DNA损伤程
度由表 1可知, 照射 5 和 10 s的尾部DNA百分比、
尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩均大于不做处
理的, 头部DNA百分比则相反。UV-B照射时间延
长到 30 s时, 除头部DNA百分比之外, 各参数不再
增加。从照射 0到 10 s的检测参数均表现出时间
依赖效应(图 2)。
表 1 UV-B诱导的林烟草原生质体中DNA损伤
Table 1 DNA damage of N. sylvestris protoplasts induced by UV-B radiation
照射时间 /s 头部 DNA/% 尾部 DNA/% 尾长 /μm 彗星全长 /μm 尾矩 /μm Olive尾矩 /μm
0 (对照) 86.4±9.62 13.6±9.62 19.2±7.74 56.9±9.89 3.21±3.27 3.11±2.31
5 83.6±11.10 16.4±11.10 19.8±7.20 57.6±9.35 3.92±3.81 3.61±2.72
1 0 79.7±9.82* 20.3±9.80* 22.2±6.03* 61.6±6.44* 4.98±3.64* 4.37±2.21*
3 0 82.9±11.70* 17.1±11.70* 20.1±6.90 56.4±7.54 4.06±3.89 3.60±2.75
6 0 87.3±8.45 12.7±8.45 18.0±6.02 54.4±8.74 2.68±2.39 2.62±1.81
120 85.2±9.34 14.8±9.34 20.0±7.81 64.1±9.73* 3.56±3.53 3.51±2.33
　　*表示同列数据中与对照相比差异显著(P<0 .05 )。
图 1 林烟草叶脉细胞原生质体(200×)
Fig.1 Protoplasts of vein cell of N. sylvestris
图 2 UV-B诱导的林烟草原生质体DNA损伤的慧星电泳(400×)
Fig.2 Comet assay of DNA damage in N. sylvestris protoplasts induced by UV-B radiation (400×)
A: 对照(不做UV-B处理); B: UV-B照射 5 s; C: UV-B照射 10 s; A1: A经 CASP软件分析的图像; B1: B经 CASP软件分析的图像;
C1: C 经 CASP软件分析的图像。
当照射时间增加到 30 s, 除头部DNA百分比
之外各分析指标有下降的趋势, 揭示处理时间过长
时形成的DNA-DNA、DNA-蛋白质交联在电泳时
抑制了DNA的迁移(Woźniak和Blasiak 2003), 这种
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现象在其它类似试验中也出现过(Gichner等 2008;
Rucińska等 2004; Woźniak和Blasiak 2003; 罗明志
等 2006)。而蒋磊等(2006)和王静等(2007)为了确
定嘧啶二聚体形成的量, 提高彗星电泳检测的阈值,
用核酸内切酶 T4 Endonuclease V特异性识别并酶
切DNA链上的嘧啶二聚体。在研究中还发现这一
阈值受植物的种类、以及取材的部位等多方面的
影响, 会发生相应的变化。
参考文献
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