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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
R-2-卤代酸脱卤酶的同源模建及底物对映体选择性研究
林春娇 杨立荣 徐刚 吴坚平
(浙江大学化学工程与生物工程学系，杭州 310027)
摘 要: 对来自假单胞菌 ZJU26中的 R-2-卤代酸脱卤酶(DehI-R)进行同源模建，分析其与底物的相互作用，为解析酶的
底物对映体选择性提供理论依据。采用 Sybyl 中的 APM模块首次构建并优化了 R-2-卤代酸脱卤酶的三维结构，并用 Procheck
验证结构模型的合理性。使用 Surflex-Docking模块将结构模型与底物分别进行对接，分析相互之间的作用。序列比对结果显
示，R-2-卤代酸脱卤酶与恶臭假单胞菌 PP3中 DehI的相似性达 23. 71%。Deh-R模建后的结构与模板很好的吻合。模型比对分
析 DehI-R中参与催化的残基，除 Asn203外大部分都比较保守。分子对接结果表明，R-2-氯丙酸和 S-2-氯丙酸都可以结合到活
性位点上，决定其选择性的是位点 Asn203，在 RS-2-卤代酸脱卤酶所对应位点的残基为 Ala，相比之下，Asn具备较大的空间位阻，
从而阻止了 S-2-氯丙酸的反应。利用 Sybyl中的 Biopolymer模块对 R-2-卤代酸脱卤酶中的 Asn203 突变成具有不同空间位阻的
Ala、Gly和 Gln。突变酶与底物对接结果进一步证实了 Asn203位点对 R-2-卤代酸脱卤酶的底物对映体选择性作用。
关键词: R-2-卤代酸脱卤酶 同源模建 分子对接 假单胞菌 ZJU26 对映体选择性
Homology Modeling and Substrate Enantioselectivity for
R-2-haloacid Dehalogenase
Lin Chunjiao Yang Lirong Xu Gang Wu Jianping
(Department of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027)
Abstract: A model of R-2-haloacid dehalogenase(DehI-R)from Pseudomonas sp． ZJU26，built by homology modeling，was docked
with substrates to analyze the interaction between them，for the purpose of providing the theoretical basis of the enzyme’s enantioselec-
tivity． The three dimensional structure of the DehI-R was constructed by APM in Sybyl． The reliability of the model was assessed by Pro-
check． The interaction of the enzyme and substrate was analyzed by Surflex-Docking． Sequence alignment indicated that the dehI-R from
Pseudomonas sp． ZJU26 had 23. 71% identity with the DehI from Pseudomonas putida PP3． The constructed 3D model of the R-2-haloa-
cid dehalogenase adopted a similar folding pattern to the template and the two matched well． Structure alignment displayed that most res-
idues for catalytic site or substrate binding site were conserve except Asn203． Molecular docking results indicated that both of the sub-
strates could bind to the enzyme． The residue dictating the enzyme’s selectivity was Asn203 in R-2-haloacid dehalogenases，while it was
Ala in RS-2-haloacid dehalogenases． Compared with the Ala in RS-2-haloacid dehalogenases． Comparatively，the Asn203 in the DehI-
R，with huger steric hindrance，inhibited the dehalogenation of the S-2-chloropropionate(S-2-CPA)． The Asn203 was mutated to resi-
dues with various steric hindrance，such as Ala，Gly and Gln，by Biopolymer in Sybyl． The docking results of the mutants and the sub-
strates proved the function of Asn203 in the substrate enantioselectivity for R-2-haloacid dehalogenases． The model can be used as a
starting point for the direct evolution for the enzyme in future．
Key words: R-2-haloacid dehalogenase Homology modeling Molecular docking Pseudomonas sp． ZJU26 Enantioselectivity
收稿日期:2011-03-29
基金项目:国家自然科学基金重点项目(20936002) ，国家高技术研究发展计划“863”计划(2010AA101502) ，国家重点基础研究发展计划“973”
计划(2011CB710800) ，国家科技支撑计划重点项目(2008BAI63B07)
作者简介:林春娇，女，博士，研究方向:生物催化与转化;E-mail:run@ zju． edu． cn
通讯作者:吴坚平，男，博士，副教授，研究方向:生物催化与转化;E-mail:wjp@ zju． edu． cn
2-卤代酸脱卤酶(EC 3. 8. 1. 2)根据其同源性及
底物类型的差异可以分为 S-2-卤代酸脱卤酶，R-2-卤
代酸脱卤酶，RS-2-卤代酸脱卤酶和氟乙酸脱卤酶等，
根据遗传同源性又可分为 2-卤代酸脱卤酶 Group I和
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Group II［1］。其中 Group II的脱卤酶专一催化 S-2-卤
代酸脱卤酶，其基因、结构及催化机理研究较为透彻。
而 Group I的脱卤酶根据催化底物的差异分为具有底
物选择性的 R-2-卤代酸脱卤酶和不具有底物选择性
的 RS-2-卤代酸脱卤酶。RS-2-卤代酸脱卤酶已经在
假单胞菌 113、恶臭假单胞菌 PP3、甲基杆菌属 CPA1
和洋葱伯克霍尔德菌 KY等菌中发现［2 － 5］，但是 R-2-
卤代酸脱卤酶仅在恶臭假单胞菌 AJ1 /23、根瘤菌属
和土壤杆菌属 NH3 中发现［6 － 8］。基于序列的遗传进
化树分析推测，R-2-卤代酸脱卤酶可能源于 RS-2-卤
代酸脱卤酶的一个保守氨基酸 Ala(如来自 dehI 的
Ala187)突变成 Asn［9］，是生物适应环境的突变。
Schmidberger［10］基于 RS-2-卤代酸脱卤酶的晶体结
构，推测在 R-2-卤代酸脱卤酶中严格保守的 Asn，占
据卤素与甲基的空间位点，限制 S-2-卤代酸脱卤形成
产物进程中的 C-H，C-CH3键的旋转。然而 R-2-卤代
酸脱卤酶底物对映体选择性的解释还需要基于 R-2-
卤代酸脱卤酶晶体与底物的相互作用来进行。
R-2-卤代酸脱卤酶专一性脱卤 R-2-卤代酸(R-
2-CPA) ，可用于消旋 2-氯丙酸的拆分，制备手性医
药、农药重要中间体 S-2-氯丙酸(S-2-CPA)而倍受
关注。现有的 R-2-卤代酸脱卤酶热稳定性和活力
还不能满足工业的需求，需要发现新的酶或对现有
酶进行定向改造。另外，R-2-卤代酸脱卤酶至今没
有晶体结构的报道，无法从晶体结构分析研究该蛋
白与底物的作用和基于结构对蛋白进行定向进化。
近年来从蛋白质的一维结构来预测其三维结构的方
法有较多报道，特别是蛋白质同源模建已经比较成
熟，为研究未知蛋白空间结构提供了可行方法［11］。
利用分子对接的手段来研究酶与底物的作用关
系，特别是酶的对映体选择性，是目前的一个研究热
点。分子动力学方法模拟过渡态体系在研究酶和底
物的作用关系比较准确［12］，但由于其耗时较长，且
对计算机硬件要求较高，故应用范围有限。分子对
接法则运行速度快，对接准确度高［13，14］，可以通过
考虑诱导契合作用来对受体侧链进行柔性处理［15］;
或者以共价键的形式来定位配体与受体的结合位
点［16］，因此近年来分子对接被广泛用于研究脂肪酶
与底物相互作用［17］。
针对实验室自行筛选获得假单胞菌 ZJU26 所
产的 R-2-卤代酸脱卤酶，进行同源模建研究，并根
据此模型通过分子对接来研究该酶及突变酶与底物
的作用，进而为后续酶的定向改造提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 计算结构预测和分子模拟
分子模拟、计算和结构比对由 SYBYL(Tripos
Inc．)进行，所有蛋白结构的图形显示由 SYBYL 制
作，模型评价用 Swiss-Model平台的蛋白评估模块的
ProCheck进行［17］。
1. 2 同源建模方法
通过 SYBYL-X 1. 1软件中的 Fugue 模块进行同
源性搜索，得到模板按照 ZSORE排列，选择适合模板
对 DehI-R(NCBI 登录号 HM770743)进行同源建模，
经由 ORCHESTRAR构建保守区，loop 区及对侧链进
行优化。检查键长和键角、二面角及侧链有无碰撞，
优化不合理的残基，模型完成后进行加氢，并对结构
进行阶段能量最小化，力场为 Kollman all，迭代 1 000
次。300 K下对不合理残基进行局部动力学优化。
1. 3 分子对接
1. 3. 1 蛋白的准备 本研究所采用的晶体结构数据
取自 Protein Data Bank(www． rcsb． org)或者由 SYBYL
同源建模得到。由 PDB中获得的晶体结果除水时保留
与催化有关的结合水［18］。因为参与催化过程的水分
子在已报道的 dehI结构中保守，因此在对同源建模的
蛋白进行对接时考虑结合水分子的参与，参考 dehI 中
的结合水分子位置，将水分子先行合并到活性部位上。
由加氢功能添加氢键，并调节活性位点附近 Asp 残基
的质子化状态及旋转状态。最后，进行阶段能量最小
化(Tripos force field，Powell gradient glorithm，root mean
square(rms)gradient:0. 05，no charges)。
1. 3. 2 配体的准备 配体 R-2-氯丙酸和 S-2-氯丙
酸通过 SYBYL软件包中的 SKETCH中绘制，羧基氧
的原子形态设置成 OCo2 型，加氢后，两个分子都进
行分子力学优化(最陡下降法—共轭梯度法各 200
步)。优化过程采用 tripos力场，Gasteiger-Hückel电
荷，距离超过 8  的原子间不考虑氢键相互作用。
经过优化得到两个分子的初始三维构象。为了消除
初始构象对分子对接过程的影响，先对配体分子在
水溶液中的构象进行分析。利用 SYBYL 中的 Sol-
vate功能对配体分子进行 H2O 的溶剂化，能量最小
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2011 年第 10 期 林春娇等:R-2-卤代酸脱卤酶的同源模建及底物对映体选择性研究
化 1 000 步，从水溶液中抽出 20 个低能配体构象进
行动力学优化，动力学优化温度为 298. 15 K。
1. 3. 3 精确分子对接 在进行对接的同时，通过比
较对接结果和实际情况中分子的作用方式来评价对
接方法的可靠性，并采用精确对接模式 Surflex-Dock
GeomX(SFXC)进行对接。对接时的原型分子由指
定活性残基的方式生成。设定 Threshold 值为 0. 5，
Bloat值为 1。
对接充分考虑了配体和受体分子的柔性，在对
接过程中，配体分子的所有非环单键和受体上的所
有氨基酸残基侧链均可自由旋转。考虑了静电场作
用，受体蛋白不添加电荷，配体分子添加 Gasteiger-
Hückel 电荷。
1. 3. 4 结合能及对映体选择性的理论计算 Sur-
flex-docking对接后的分数(D)是配体与酶解离常数
(Kd)的函数，即 － log10Kd
［19］。因此结合能可通过以
下公式获得:
ΔG = RT logeKd = － RTD / log10e = － 1. 3585D
其中，ΔG 为结合自由能，RT = 0. 59 Kcal /mol。
另外，ΔΔG = － RTlnER/S可用来表示酶对底物的对映
体选择性 E 值和催化过程中底物异构体活化自由
能差之间的关系［16］。该方程表示酶优先反应的异
构体需要的活化能更低，即该异构体与酶的结合自
由能更低，较大的活化自由能差表示酶对底物有更
高的对映体选择性。
1. 4 突变酶的构建
采用 Sybyl平台下的 Biopolymer 模块中的氨基
酸突变功能，直接选取突变位点 Asn203，分别突变
成 Ala、Gly和 Glu。然后局部对突变区域进行动力
学能量的优化及蛋白的包括检查键长和键角、二面
角及侧链的全局优化。
2 结果与分析
2. 1 三维结构的建立及评价
同源建模通过 SYBYL中的 APM(Advanced Pro-
tein Modeling)模块实现，经过 FUGUE 搜索，得到模
板按照 Zscore排列，选择相似度最高且来自同一家
族的恶臭假单胞菌 PP3 的 DehI(PDB:3BJX)为模
板。DehI-R与 3BJX的序列相似性为 23. 71%，打分
值(Z-Score)为 21. 52，其可信度(confidence)是可靠
的(certain) ，序列比对结果如图 1 所示。从图 1 可
模板中实线方框为 α螺旋，虚线方框为 310螺旋;大写字母(X)表示的残基为溶剂不可到达的区域，加粗显示的
是主链酰胺上的氢键;下划线显示的是主链羰基上的氢键;斜体显示的是正 Ψ角
图 1 R-2-卤代酸脱卤酶的序列比对
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得出，该蛋白主要由 α 螺旋和 310螺旋组成，其二级
结构与 3BJX 的二级结构相似度较高，因此获得模
型的可信度也较高。DehI(3BJX)的结构是在 2. 3 
分辨率下用 X 射线衍射测定的，为同源二聚体形
式，本模拟自动以 a链为模板，进行模型构建。对所
得结果优化后，得到模型结构用 Procheck(图 2)进
行评价，从拉氏图(Ramachandran)中可见模建结构
蛋白的主链结构合理:主链二面角 Φ -Ψ 落于中心
区域和“可接受区域”的残基占 98. 5%，绝大多数
Φ -Ψ角在正常范围内，落在不允许区域内的两个
残基均远离结合位点。因此该模型可用于后续的研
究。一般来说，同源模建所需模板的序列相似度超
过 30%，模型可靠性较高［20］。但是也有文献表明，
序列相似度较低的蛋白有可能具有较高相似性的结
构，因此序列相似度低于 30%也可能获得较好的模
型［17］。在同源模建中，序列比对是技术的关键，
APM模块采用 FUGUE模块充分利用序列相似性的
同时，还考虑二级结构的相似性。另外，基于片段组
装法的 ORCHESTRAR可以克服空间限制满足法的
缺陷，即虽然可以得到完整的模板，但是不同区域质
量不一，因此 ORCHESTRAR 在低序列一致性时，也
可以改善基于片段装配法同源模建的性能［21］。
图 2 假单胞菌 ZJU26 R-2-卤代酸脱卤酶的模建结构的拉氏图
2. 2 R-2-卤代酸脱卤酶的结构特征
2. 2. 1 R-2-卤代酸脱卤酶的结构总特征 如图 3-A所
示，来自假单胞菌 ZJU26的 R-2-卤代酸脱卤酶的模建
结构是全部由 α-螺旋组成的假二聚体。假二聚体的形
成有助于形成更强的偶极，形成的强正电势更易于带
负电的底物进入底物结合空腔。如图 3-B 所示，假单
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胞菌 ZJU26 的R-2-卤代酸脱卤酶模建结构可以很好地
与恶臭假单胞菌 PP3的 dehI的晶体结构进行叠合，两
者主链原子叠合的 RMSD大约为 6. 328 。除 N端叠
合的不是很紧密外，其余部分都叠合的较好。
A． DehI-R功能域结构示意图(显示方式为实带模式，重要催化残基，底物结合位点和 N，C端残基用棍棒显示模式) ;
B． DehI-R与 DehI(蛋白质结构数据库编号为 3BJX)的结构比对图(DehI-R显示为浅色条带，DehI显示为深色条带)
图 3 模建的假单胞菌 ZJU26 R-2-卤代酸脱卤酶模型及结构比对
2. 2. 2 R-2-卤代酸脱卤酶的重要催化位点及残基
基于 3BJX 结构中的重要残基位点 Trp34、Gly36、
Asn114、Tyr117、Ala187、Ser188 和 Asp189;卤素结合
位点为 Val37、Tyr 266、Phe268和 Ile269。通过序列比
对及结构对比发现，在 dehI 中的重要催化残基除
Ala187外(被 Asn203取代) ，大部分位点保守。重要
催化残基位点分别为 Trp48、Gly50、Asn131、Tyr134、
Asn203、Ser204和 Asp205;卤素结合位点有较大的变
动，分别为 Val51、Phe281、Leu284和 Leu285。
2. 2. 3 静电及疏水分析 蛋白质表面的静电分布
情况(图 4-A)表明，该蛋白存在明显的正电荷区
和负电荷区，带有强正电荷区正是底物被强电场
吸引到酶活性位点的通道。蛋白质表面的疏水分
布情况(图 4-B)表明，该蛋白表面的疏亲水分布较
为均匀，且蛋白表面的亲水性较高，有利于极性底
物的接触。
A． DehI-R表面的电荷分布;B． DehI-R表面的疏水分布
图 4 假单胞菌 ZJU26 R-2-卤代酸脱卤酶表面的电荷分布和疏水分布
2. 3 R-2-卤代酸脱卤酶与底物 R-2-氯丙酸及 S-2-
氯丙酸的分子对接
选择 R-2-卤代酸脱卤酶为受体，分别与配体
分子 R-2-CPA和 S-2-CPA 进行对接。与 R-2-CPA
的对接结果显示，最高打分(C score)为 5. 28，但是
其氯离子的位点与 Asp205 进攻位点同向，不利于
其活化的水分子进攻 C2 原子，较合理的进攻位点
的打分为 4. 700，酶分子参与结合底物的羧基形成
氢键的残基有 Trp48 和 Ser204，参与卤素结合的位
点有 Val51、Leu284 和 Leu285。酶分子与 S-2-CPA
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的对接结果显示，最高打分为 5. 92，但是底物的氯
离子位点与 Asp205 进攻位点同向，合理的进攻位
点的打分为 3. 440，此分子与酶的 Ser204、Asn131
和 Val51 形成氢键。从对接结果来看，R-2-CPA 和
S-2-CPA都可以结合到活性位点上，但是与 R-2-
CPA的结合分数更高些，结合分数之差为 1. 260，
对应的结合能之差为 1. 71 kcal /mol，计算出的 E
值为 18. 1，虽然比试验结果略差，但是基本可以预
测该酶的底物选择性。如图 5 所示，R-2-CPA 的
甲基处于远离 Asn203 的位置，而 S-2-CPA 的甲基
处于近 Asn203 的位置，所以当 R-2-CPA 与酶反应
时，Asp205 活化的水分子进攻 C2 时，C-H 发生旋
转，由于 C-H 键较小，Asn203 不会阻碍其旋转，但
当与 S-2-CPA 发生反应时，Asn203 占据甲基与
Cl －的空间位点，限制 C-CH3旋转从而限制了反应
的进行。
A． DehI-R与底物 R-2-CPA的结合模型;B． DehI-R 与底物 S-2-CPA 的结合模型;
采用棍棒显示模式，中间棍棒为底物，周围棍棒为与底物结合的残基
图 4 假单胞菌 ZJU26 R-2-卤代酸脱卤酶与底物的结合模型
2. 4 R-2-卤代酸脱卤酶突变酶与底物 R-2-氯丙酸
和 S-2-氯丙酸的分子对接
通过 Sybyl 的 Biopolymer 模块的氨基酸突变
功能将 R-2-卤代酸脱卤酶的 203 位点残基突变
成具有不同空间位阻的残基，考察突变酶的底物
对映体选择性。突变酶的突变位点的空间构象
如图 5-A 所示，可见空间位阻较少的 Ala 和 Gly
的侧链与 Asn 同侧，而空间位阻较大的 Gln 的侧
链，与左侧蛋白的柔性片段发生碰撞，从而转向
空间较大的右侧。突变酶分别与底物 R-2-氯丙
酸和 S-2-氯丙酸对接结果如表 1 所示。可见当
R-2-卤代酸脱卤酶中的 Asn203 突变成空间位阻
小的氨基酸 Gly 或 Ala 后，对于底物 R-2-氯丙酸和
S-2-氯丙酸的亲和力都有不同程度的提高，且对 S-
2-氯丙酸的亲和力稍大于 R-2-氯丙酸。Asn203 突
变成空间位阻较大的氨基酸 Gln后，由于空间位阻的
关系，占据了酶与底物的结合位点，因此对底物的结
合力都下降。另外，选择性也有一定的下降，可能的
原因是 Gln侧链上的羧基转向一侧，与底物 S-2-氯
丙酸结合时形成氢键(图 5-B) ，增加了与 S-2-氯丙
酸的结合力。
3 结论
利用同源模建构建了 R-2-卤代酸脱卤酶的
三维结构，并将底物 R-2-氯丙酸和 S-2-氯丙酸对
接到模建的 R-2-卤代酸脱卤酶及突变酶中，得到
该酶与两种对映体底物相互作用的详细理论信
息，在分子水平上揭示了该酶的对映体选择性机
理，一方面为直接从 R-2-卤代酸脱卤酶出发，对
Asn203 位点进行饱和突变提供依据，另一方面
为从种类较多的 RS-2-卤代酸脱卤酶的 Ala 位点
进行饱和突变获得多样的 R-2-卤代酸脱卤酶提
供依据。
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2011 年第 10 期 林春娇等:R-2-卤代酸脱卤酶的同源模建及底物对映体选择性研究
A．突变氨基酸的空间构象;B． Asn203 /Gln203 与 S-2-氯丙酸的结合构象
图 5 突变氨基酸的空间构象
表 1 突变酶的对接结果
酶 底物 对接分数 ER/S
Wild enzyme
R-2-CPA 4. 700
S-2-CPA 3. 440
18. 1
Asn203 /Ala203
R-2-CPA 4. 880
S-2-CPA 4. 900
0. 95
Asn203 /Gly203
R-2-CPA 5. 960
S-2-CPA 6. 570
0. 24
Asn203 /Gln203
R-2-CPA 3. 430
S-2-CPA 2. 790
4. 37
Asn203 /Ala203 指将 Asn203 位点突变成 Ala203，其他突变酶以此类
推;R-2-CPA是 R-2-氯丙酸的缩写，S-2-CPA为 S-2-氯丙酸的缩写
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