全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jun．2O15，35(3)：393—400 http：／／journa1．gxzw．gxib．cn
DOI：10．11931／guih~ gxzw201501024
尹立伟，杨春成，朱玉，等．紫孢侧耳 Ps—mnp1基因克隆与蛋白结构预测r-J]．广西植物，2015，35(3)：393—400
Yin Lw，Yang CC，Zhu Y，et a1．Cloning and protein structure prediction of Ps—mnpl from Pleurotus sapidus[J]．Guihaia，2015，35(3)：393—400
紫孢侧耳 Ps—mnp 1基因克隆与蛋白结构预测
尹立伟 ，杨春成 ，朱 玉 ，伦志明 ，张 静
(1．安庆师范学院 生命科学学院，安徽 安庆 246011；2．黑龙江农业经济职业学院 ，黑龙江 牡丹江 1 57041)
摘 要：克隆紫孢侧耳 PSI菌株锰过氧化物酶基因 Ps mnp1，具有生物降解木质素的活性 ，可用于分析锰过
氧化物酶的蛋白功能 与结构 ，并对深入了解紫孢侧耳 Ps—mnp1基 因功能和转录调控具 有重要 意义。基于
ITS序列分析 ，明确了该菌株的分类地位 。根据 GenBank中白腐菌 MnPs保守序列设计引物，采用染色体步
移法和逆转录 PCR法获得 Ps—mnp1基因，GenBank登录号为(KP189358．1)。在克隆 Ps—mnp1基因并分析
蛋白结构时，采用多种现代生物信息学技术 ，经染色体步移法克隆的 DNA全长序列后，利用 contigexpress拼
接软件预测 Ps—mnP1基因的 cDNA全长序列 ；使用 BioEdit分析软件对 DNA 和 cDNA核苷酸序列 比对 ；通
过 Augustus网站预测 RNA 的剪接位点并在 NCBI上进行同源序列比对校正 ；采用基因结构软件对比了解 白
腐菌 MnPs基因的内含子／#b显子的组成。序列分析表明 Ps—mnp1的 DNA全长序列 1 854 bp，具有外显子
14条和内含子 13条。从 Ps—mnp1与其它白腐菌M Ps基因的内含子／外显子组成分析来看，紫孢侧耳和糙
皮侧耳同属于侧耳属 ，但它们之间的 MnPs基 因结构完全不同。Ps—mnpl开放阅读框为 1 095 bp，起始密码
子 ATG，终止密码子 TAA，编码 364 aa，含有 20 aa残基构成的信号肽序列。采用 MEGA 5．1软件构建的蛋
白系统进化树表明 Ps—mnpl与 6株 白腐菌蛋 白聚类在短枝 MnPs，区分了含有 5个二硫键组成的长枝 MnPs
组群 ；此外 ，构建的蛋 白同源模型表明，与刺芹侧耳多功能过氧化物酶相似度为 72．51 ，蛋 白配体中结合位点
有 1个含铁血红素、2个钙离子、1个锰离子等，这些结合位点为不守恒。该研究为紫孢侧耳锰过氧化物酶 的
结构 ，蛋白功能 Ps—mnpl奠定了基础 ，并进一步为 Ps—mnpl的蛋白质工程改造提供借鉴作用。
关键词：紫孢侧耳 ；锰过氧化物酶 ；蛋 白结构；生物信息学；同源模建
中图分类号：$718．81 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2015)03—0393—08
Cloning and protein structure prediction of
Ps-·mnp 1 from Pleurotus sapidus
YIN Li—Wei ，YANG Chun-Cheng ，ZHU Yu ，LUN Zhi—Ming ，ZHANG Jing。
(1．School of L Sciences，Anqing Teachers College，Anqing 246011，China；2。Heilong Jiang
Agricultural Eco,~omy Vocational Colege，Mudanjiang 157041，China)
Abstract：To clone the manganese peroxidase gene Ps mnp 1 from Pleurotus sapidus PS1 contributing a lot to the
lignin biodegradation activity is important for the analysis of protein structure and functions of MnP and the under
standing of manganese peroxidase gene function and transcriptional regulation of Pleurotus sapidus．Based on the
analysis of ribosomal rDNA Intenal Transcribed Spacer(ITS)sequences，the classification status of the strain PS1
was defined．Ps—mnp 1 was cloned by using the methods of Genome Walking-PCR and Reverse transcription-PCR
with primers designed from some white—rot fungi which contains the conserved sequences of the known manganese
peroxidase genes(GenBank No．KP189358．1)．We used a variety of modern bioinformatics technology softwares to
收稿日期：2015一O1 20 修回日期：2015-03—26
基金项 目：安徽省自然科学基金(AQKJ2ol4B0O8)；安庆师范学院科研启动项目(044一K05000130030)。
作者简介：尹立伟 (1981一)，女 ，黑龙江双鸭山人，博士，讲师 ，主要从事植物病理学 ，分子真菌学等教学与研究，(E—mail)kaixinliwei@163．corn。
通讯作者
394 广 西 植 物 35卷
clone the manganese peroxidase gene and analyze the protein structure of Ps—mnp1．For example，after the cloning
ful length DNA sequence of genome walking method，prediction of the ful eDNA sequence of manganese peroxidase
gene by using contigexpress splicing software；comparison the DNA and cDNA nucleotide sequences alignment analy
sis by using BioEdit software：prediction the RNA splice site through Augustus website，folowing the comparison
and correction of Ps-mnp 1 sequences by using the the NCBI database；understanding the compositions of the intron
and exon by using online software Gene Structure Display Server contrast of white rot fungus manganese peroxidase
gene．The results obtained in the sequence analysis of Ps mnp 1 from Pleurotus sapidus indicated that the full length
of the DNA was 1 854 bp containing 14 exons and 13 introns．Meanwhile，exons and introns composition analysis of
the genes Ps-mnp 1 from Pleurotus sapidus，compared to other white-rot fungi manganese peroxidase genes，sug
gested that P．ostreatus and P．sapidus belonged to the same genus Pleurotus，but the manganese peroxidase gene
structures between them were entirely different．The Ps—mnp 1 gene included a signal peptide of 20 amino acids and
held Open Reading Frame of 1 095 bp，with start codon ATG and stop codon TAA ，encoding 364 amino acids．The
results of protein phylogenetic analysis by MEGA 5．1 software revealed that Ps mnpl and 6 strains of white rot fun—
gus protein clustered on short branches M nPs，and differentiated 5 long branches of MnPs group formed by disulphide
bond．In addition，the 3D structures of Ps—mnpl were built using homology modelling technique，and the results
showed that the binding sites of the protein Iigand included 1 Fe heme，2 Ca ions and 1 Mn(II)，and the those sites
were non-conservation．The results also suggested that the modeling similarity was 72．51 compared with P．eryn—
gii VPs．This paper could establish the basis of the study in the structure and function of the P~nmp1．It is further
helpful to ofer reference on the variation of protein engineering of the Ps-mnp1．
Key words：Pleurotus sapidus；manganese peroxidase；protein structure；bioinformatics；homology modeling
锰过氧化物酶(Manganese peroxidases／MnPs；
EC1．11．1．13)通过高效的降解木质素 中芳香高分子
聚合物 ，以多种复合 的形式产生含亚铁血红素的糖
蛋白，广泛应用于纸浆漂白与生物降解，以及污水处
理行业的染料脱色工艺等 。锰过氧化物酶(MnPs)
基因家族在 弯孢拟 蜡孔 菌 (Ceriporiopsis subver一
ispora)中最 多 可 分 泌 l1种 的 MnPs同 工 酶
(Urzfa et a1．，1995；Ryu et a1．，2013)。侧耳属隶属
于担子菌门(Basidiomycota)、蘑菇 目(Agaricales)、
侧 耳 科 (Pleurotaceae)，侧 耳 属 中 紫 孢 侧 耳
(Pleurotus 8(Jpidus)，又是人们所俗名 的美味侧耳，
为一类适应性强 、栽培广泛且具有食、药用价值的木
腐真菌(Thorn et a1．，2000)。在其属内种的鉴定存
在严重的同物异名或异物同名现象(刘宇等 ，2012；
王呈玉等，2006)，尤其是形态相近品种之间，常给科
学研究带来诸多不便 。
白腐菌 (white rot fungi)分泌的胞外降解木质
素系统 除锰 过 氧化 物 酶 (MnPs)外 ，还 包 括漆 酶
(Laccases)和 木 质 素 过 氧 化 物 酶 (Lignin
peroxidases／LiPs)和多功能过氧化 物酶 (Versatile
peroxidases／VPs)等 (董秀芹等 ，2014)，由于木质
素降解酶的协同作用 ，使 白腐菌对木质素具有很强
的降解能力 ，但 MnPs在降解木质素的非特异性胞
外氧化还原酶过程 中，起着 至关重要 的作 用(Nou—
siainen et a1．，2014)。Janusza et a1．(2013)的研究
实现了真菌 MnP、Laccase和 LiP基 因功 能和转 录
表达 调控 。Cohen et a1．(2001)研 究 了平 菇 侧耳
(P．ostreatus)木 质 素 降 解 酶 的 MnP和 VPs受
Mn 。的影响，分析 了降解 木质素酶活性 和转 录水
平 。Ruiz—Dueflas et a1．(1999)的研究克隆了刺芹侧
耳(P．eryngii)MnPL1和 MnPL2的核苷酸和氨基
酸序列 ，建立了蛋白质 MnPL1和 MnPL2的分子模
型 ，与真 菌黄 孢原 毛平革 菌 (Phanero~ haete chry
sosporium )LiP(Du et a1．，1992)和 P．chrysospo—
rium MnP(Johnson et a1．，1994)进行同源建模 ，揭
示了木质素降解酶之 间多价的催化性能、结构和氨
基酸残基 的空间排列 。目前 ，关 于紫孢侧耳 MnP1
蛋白酶基因克隆和蛋白质结构的预测还未见报道，
侧耳属下种问不同菌株问 MnPs酶基因是否存在着
差异，且这种差异是否与其降解木质素有着相互关
系还有待进一步的研究 。
本研究克隆了紫孢侧耳 PS1菌株 的 Ps一铆nP1
基 因并进行了蛋 白序列 的同源性分析以及系统进化
树的构建，并在此基础上，建立了 Ps mnpl成熟蛋
白的三维 结构模 型 ，本 研究 结果 为今 后 解析 Ps
mnpl蛋 白的功能提供了理论基础。
3期 尹立伟等 ：紫孢侧耳 Ps mnp1基因克隆与蛋 白结构预测 395
1 材料与方法
1．1菌种来源
紫孢侧耳 菌株 PSI(Pleurotus sapidus PSI)，
购 自河北省微生物研究所 ，现保藏于安庆师范学 院
生命科学学院微生物实验室。
1．2菌丝体制备及 DNA的提取
切取紫孢侧耳菌落边缘菌丝 5 mm。的小块 ，将
菌丝接种在马铃薯 (PDA)加 富平 皿培养基 中央进
行纯培养，24℃黑暗培养 5 d左右 ，待菌丝接近生
长到培养皿边缘 ，刮取菌落边缘的新 鲜菌丝用 于基
因组 DNA 的提取 ，采用 TIANGEN公 司 的 DNA
基因组提取试剂盒提取总 DNA。
1．3紫孢侧耳 ITS序列扩增
采用 真 菌 ITS区域 扩 增 的通 用 引 物 ITS1／
ITS4进行 PCR的扩增 (郑 和斌等 ，2006；Gardesm
et a1．，1993)。ITS—PCR 反应 体 系 (50 L)：10×
PCR Buffer 5 I ，dNTP(2．5 mmol／I )4 I ，ITS1一
F和 ITS4一R 引物 (10 gmol·I 。)各 1 L，rTaq
DNA聚合酶(5 u · L。)0．25 L，模板 DNA 1 L，
ddH：O补充 37．75 L。PCR扩增程序如下 ：94℃
预变性 5 rain，94℃变性 30 s，56℃退火 45 s，72℃
延伸 2 rain，共 30个循环 ，72℃延伸 10 min。PCR
扩增产物经 1．2 的琼脂糖凝胶 电泳进行检测 ，并
回收产物测序送往上海生工 。
1．4紫孢侧耳 Ps—mnp1的基因克隆
根据 GenBank中自腐 菌 MnPs保守序列设计
引物用于 PCR扩增 ，上游引物 PSI—F为 5 一CGCT—
TGACATTCCACGACGCTAT一3 ，下 游 引物 PS1一
R 为 5 一GATCGGCTGCAGCGATCGTGTG一3 。
利用试剂盒分别提取紫孢侧耳 的基 因组总 DNA 和
RNA，以提 取 的该 基 因组 DNA 和反 转 录获 得 的
cDNA为模板进行 Ps—mnpl DNA与 cDNA序列的
PCR扩增 。Ps—mnP1基 因 cDNA全长序列利用两
步法逆转录(RT—PCR)试剂盒 ；Ps ITITIP1基因 DNA
全长序 列 ，采 用染 色体 步 移法 (Genome Walking—
PCR)扩增基 因的侧翼序列 (吴 书景等 ，2012)，是 克
隆新基 因最为简便快捷的一种方法。根据 目的片段
设计 5 端区域和 3 端 区域各三条 引物 ，染色体步移
经过三次套式 PCR的扩增体系、温度条件、循环数、
凝胶 、回收 目的片段并测序等，以上具 体操作步骤 ，
参照各试剂说明书或克隆技术操作程序进行 。
1．5紫孢侧耳 Ps—mnp 1的生物信息学分析
在克隆 Ps—mylP1基因并分析其蛋白结构时，采
用多种现代生物信息学技术(尹立伟 ，2013；Yang et
nz．，2012)，经染色体步移法克隆 的 DNA全长序列
后 ，利用 contigexpress拼接软件 ，预测 Ps一 P 1基
因的 cDNA 全长 序 列 ；使 用 BioEdit分 析 软件 对
DNA和 cDNA核苷酸序列比对 ；通过 RNA剪接位
点(内含 子／外 显子 )Augustus预 测 网站 (http：／／
augustus．gobics．de／)预测 内含 子和外显 子的位置
和数 量，并在 NCBI上进行 同源 比对并 校正序列。
采用 ORF Finder软件查找该基 因的 ()RF，分析起
始密码 子 和 终 止 密码 子 的正确 位 置 ；采 用 Gene
Structure Display Server 2．0在线软件对比白腐菌
MnPs基因的内含子和外显子各组成分析 ；与其它
白腐菌木质素降解酶之间 的差异 ，采用 NJ法构建
出紫孢 侧 耳 Ps—mnp1的蛋 白系统 进化 树。使 用
SignalP 4．1 Server软件 (http：／／www．cbs,dtu．dk／
services／signalP／)对 Ps—mnp1的信号肽进行预测
并利用在线软件 SWISS MODEL数据库 (http：／／
swissmode1．expasy．org／)进行同源三维结构开展模
型构建工作。
2 结果与分析
2．1紫孢侧耳 ITS序列扩增及分析
紫孢侧耳 的 ITS区域 PCR扩增产物经测序获
得 679 bp 的 核 苷 酸 序 列。 将 该 序 列 提 交 到
GenBank登录号为 KP189359的鉴定结果表明，1～
31 bp为 18s rDNA基因序列 ，32～263 bp为内转录
间隔区(ITS1)序列 ，264～42l bp为 5．8S rDNA编
码序列 ，422～619 bp为内转录问隔区(ITS2)序列 ，
620～679 bp为 28S rDNA序列 。在 GenBank中，
菌株 PSI与 l株来 自中国科学院提交 的紫孢侧耳
(Pleurotus sapidus)菌株 So47亲缘关系最为密切 ，
二者提 交 的 ITS序列 覆盖 率 (query coverage)为
100 9／6，相似性达 99 。与 102个菌株的 BI AST 比
对结果表明，与 30株糙皮侧耳 (P．ostreatus)不 同
地域菌株 ，提交 的 ITS序列覆盖率为 97 ～99 ，
相似性为 98 ～99 ；与其 12株紫孢侧耳 ；12株 白
灵侧耳(P．nebrodensis)；7株佛洲侧耳 (P．flori—
danus)；15株阿魏侧耳(P．eryngii)；4株花脸香蘑
(Lepista sordida)；9株 侧 耳 属 中 不 确 定 种
(Pleurotus sp．)和 5株未 经培养纯化 的真菌 (Un—


398 广 西 植 物 35卷
图 3 系统树基于不同白腐菌锰过氧化物酶 、漆酶和
木质素过氧化物酶的蛋白遗传距离
Fig．3 Phylogenetic tree based on the genetic
distances among protein sequences of MnPs，
LiPs and Laccases from white rot fungus
与糙皮侧耳 ，虽然位于同一属 中两个菌种 ，所携带的
MnP蛋白长度相同，但它们之间同源性较低，为 58 。
2．6构建紫孢侧耳 Ps—m，lp1蛋白系统发育树
利用上述 20个白腐菌木质素降解酶蛋白序列，
首先在 ClustalX 2．0软件中进行蛋 白序列的完全 比
对 ，将 其 结 果 转 入 MEGA 5．1软 件 中，采 用
Neighbor—Jioning法构建紫孢侧耳 Ps一Ⅲ”声1蛋 白
系统发育树 。基于 MnPs、LiP和 Laccases的氨基
酸序列之间遗传距离 的远近 ，树枝状的分支类型更
能体现出白腐 菌木质素降解 酶蛋 白之 间的亲 缘关
系。图 3结果 表 明，紫孢侧 耳 Ps—MnPJ与 白腐 菌
Po—MnP3、Gf—MnP 、Pr—MnP3、3个 Tv—MnPs和
Pc—LiPA聚类接近为一组 ，此组蛋 白主要原 因是 由
4个二硫键 的 8半胱氨酸组成的短枝 MnPs。另外 ，
明显分支较 远 的白腐 菌 Fm—MnP2、Le—MnP2、Ds
MnP、4个 Cs—MnPs、3个 Pc—MnPs，此组蛋 白聚类
有 5个二硫键组成 的长枝 MnPs为一组，并且发现
白腐菌同一菌种 MnPs的同工酶或等位基 因会较 为
接近的聚类 在一起 。此外，2个变 色栓菌 Tv—Lacs
同工酶蛋 白明显远离于 MnPs和 LiPs蛋白，作为外
源群组。构建的蛋 白系统发育树 ，同时也揭示了白
腐菌 分 泌 木 质 素 降 解 酶 系 统 中 MnPs、LiP 和
Laccases之间的遗传距 离。从此发育树 中来看 ，黄
孢原毛平革菌 3个 Pc—MnPs和 Pc—LiPA；变色栓菌
3个 Tv—MnPs和 2个 Tv～Lacs同工酶蛋白之间 ，发

400 广 西 植 物 35卷
是特异性强 ，易快速克隆出新基因，但缺点在于测序
样品多 ，造成资金浪费 。
从生物信息学角度分析，以紫孢侧耳 Ps—mnp1
为主要研 究对象 ，Ps—mnP1全 长 cDNA序列 翻译
成 364 aa。从侧耳属转录间区同源性搜索来看 ，侧
耳属下种及其种间亲缘关系密切 ，易发生变种 ，但从
锰过氧化物酶蛋 白同源性搜索来看 ，侧耳属 中紫孢
侧耳与糙皮侧耳相 比，其所携带 的 MnP基 因同源
性很低 ，结合 两者来看 ，揭示 了属下种 问易发 生变
异，但种内所携带的酶基因变异却很少。若受其诱
导条件的影响，能否对基因的内部结构发生改变 ，为
基因的遗传变异带来新的挑战。在构建 Ps—mnpl
三维模型时 ，有三个相似 VPs蛋白模型同源性分别
为 72．51 、72．21 和 70．5 ，与其相似性最 高 的
P．eryngi VPL2蛋 白模 型相 比，Ps—mnpl功能位
点模拟显示除了包含一个血红素结合位点 、两个钙
结合位点 ；还 有一个独特表征的 Mn(II)结合位点 ，
成熟蛋白配体所构成的动力学特性表现于 E 43，E
47，侧链羧酸 D 188，血红素丙酸 C 13和 2个水分
子的存在来实现。相对比同源模型的不同之处除增
加 Mn(II)离子结合位点外 ，Ps—mnpl模型中还缺少
侧链 ，但增加 了极性分子 H。通过 白腐菌木质素 降
解酶蛋白系统发育树的构建，了解 Ps—mnp 1与其它
白腐菌遗传距离 的远近和亲缘关系，为紫孢侧耳锰
过氧化物酶的蛋 白结构和功能研究 奠定 了坚实基
础，同时为锰过氧化物酶 的蛋 白质工程研究提供 了
一 定的理论基础。
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