全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
链替换技术提高噬菌体抗体亲和力的研究进展
王乃东 袁安文 薛立群
(湖南农业大学动物医学院,长沙 410128)
摘 要: 高亲和力抗体基因的克隆是噬菌体抗体在基础研究、临床诊断治疗研究等重要领域中应用的基础。链替换技
术已逐步广泛用于噬菌体抗体的性能改造。该技术不仅可以促进噬菌体的体外亲和力成熟, 提高抗体亲和力 ,有助于低剂量
抗体达到实际应用所需要的抗原结合效应,拓宽抗体的应用开发前景, 而且可应用于减少抗体人抗鼠抗体反应, 分析重链或
轻链基因对抗原抗体结合的影响,有助于较好的理解免疫化学。就链替换的原理、策略及其应用进行综述。
关键词: 链替换 噬菌体展示技术 亲和力成熟
Advance in Improvement of Phage Antibody Affinity by Chain Shuffling
W angNa idong Yuan Anw en Xue L iqun
(College of Veterinary M edicine,H unan Agriculture University, Changsha 410128)
Abstrac:t The clon ing o f antibody genew ith high affin ity is the basis fo r phage antibody app lied in important research field of basic
study and clinical diagnos is and treatment. Chain shuffling is gradua lly used fo r the im prov ing prope rties of phage antibody. The techn ique
not only fac ilitates affinity ma ture of phage antibody in vitro, broaden the prospect o f app lica tion and deve lopment of antibody, but a lso re
duces hum an antimouse antibody response, analyze effec t of heavy or light cha in gene on the integ ration o f antibody and antigen, and is
helpfu l for us to understand ing imm unochem istry. The paper rev iew ed them echan ism, strategy, and application of cha in shu ffling.
Key words: Cha in shu ffling Phage d isp lay techn ique A ffin itym aturation
收稿日期: 20100304
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30901090) ,湖南省教育厅科学研究优秀青年项目 ( 09B046 ),湖南省研究生创新基金项目
作者简介:王乃东,男,博士生,主要研究方向:动物生殖医学; Em ai:l wnd0828@ 163. com
通讯作者:薛立群, Em ai:l liqun_xue@ yahoo. com. cn
噬菌体抗体库技术是噬菌体展示技术在基因工
程抗体应用上的一个成功范例。噬菌体抗体库技
术,也称抗体基因组合文库技术,它利用抗体基因噬
菌体库代替 B细胞克隆来表达抗体库。通过基因
工程技术使噬菌体不仅携带着编码外源抗体片段的
基因, 而且在成熟的噬菌体表面展示抗体片段蛋白,
得到的抗体片段蛋白称为噬菌体抗体, 主要包括两
类:抗原结合片段 ( Fab)和单链抗体 ( sing le cha in of
fragmen,t scFv )。尽管噬菌体抗体库技术已成为抗
体工程领域的关键技术之一,并在很多领域得到应
用,但筛选得到的噬菌体抗体因存在亲和力不高的
现象而限制了抗体的使用, 如由天然噬菌体抗体库
制备的抗体没有经过抗原的免疫驱动, 其亲和力水
平较低。因此在天然噬菌体抗体或已有的低亲和力
噬菌体抗体分离后, 可以结合体外亲和力成熟和筛
选的方法,模拟抗体体内亲和力成熟的过程,最终提
高抗体的亲和力,改善抗体的性能。另外,也可以在
体外修改噬菌体抗体的重要特性, 以获得满足需要
的抗体,如抗体的人源化、反应率、特异性等。
对于噬菌体抗体的亲和力成熟已经从不同的角
度开展了研究,如进行抗体重链或轻链的替换,增加
抗体库的多样性及定点或随机突变等,研究结果显
示抗体体外成熟技术都能不同程度地提高抗体亲和
力。通常体外亲和力成熟先在低亲和力抗体基因中
引入突变,构建次级突变抗体库, 然后再通过有效筛
选来获得新高亲和力抗体。引入突变可采用多种技
术途径,如链替换、错配 PCR、CDR或 DNA替换或
改组、CDR步移 ( CDR wa lk ing )、定点突变、致突变
大肠杆菌等。突变可以随机或定向的引入抗体基因
序列,其中未预测最佳突变位点的随机突变是最简
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
单的方法,而且随机突变更加接近于模拟体细胞突
变, 将突变引入到轻重链可变区 ( light and heavy
chain variab le reg ion)。由 Marks等 [ 1]提出的链替换
是一种常见的通过引入随机突变寻求更为理想的轻
重链组合的方法。链替换通过分别固定抗体两条链
中的一条链,随机组合对应链的具有足够库容的多
样性库,有可能产生最佳链组合克隆,经过噬菌体抗
体库的筛选,可以获得高亲和力的新抗体 [ 2 - 4 ]。抗
体分子进化的目的是为了获得亲和力高, 特异性不
变,稳定性好的抗体。链替换与其它几种引入突变
技术相比,不仅是一种非常简便的抗体体外亲和力
提高技术,而且替换后的抗体保留相对较多的原有
抗体性质,不增加过多的胚系基因突变,使抗体的功
能和抗原的识别位点与原有抗体保持守恒状态,从
而减少引起抗原识别位点漂移的几率 [ 5, 6]。
1 链替换的原理
体内抗体亲和力成熟需要目的抗原不断刺激 B
淋巴细胞,才能产生针对抗原的特异性抗体。在 B
淋巴细胞初次接触抗原后, 抗体轻重链的胚系基因
片段随机重排,产生超过 106的组合,细胞基因重排
被连接后常产生较低亲和力的抗体, 而在记忆细胞
随后接触抗原时,抗体可变区基因再次发生体细胞
高频突变,突变使得某些低亲和力接触残基被置换
成高亲和力接触残基, 同时轻重链的配对组合也会
发生变化,产生新变异体, 即高亲和力的抗体。基于
结合动力学优化的组合, 具有选择优势的高亲和力
抗体最终被选择出来。
体外噬菌体抗体的亲和力成熟的关键在于模拟
体内的高频突变,实现天然或初级噬菌体抗体库中
筛选出来的模板抗体的多样化,然后以由多样化抗
体基因构建的次级抗体库为基础, 从库中可以筛选
到抗原特异性的更高亲和力抗体。链替换依据抗体
可变区随机配对的原理 [ 7 ]将抗体的漂移和随机的
点突变结合在一起。首先克隆针对目的抗原的抗体
轻重链,分别构建具有足够库容与多样性的轻链库
和重链库,然后固定模板抗体的轻链可变区 ( VL )基
因或重链可变区 ( VH )基因, 与构建的重链库或轻链
库组合,建立轻链或重链替换抗体库,通过轻链或重
链替换将突变引入模板抗体基因中。结合由抗原筛
选高亲和力克隆的噬菌体循环 ( phage cycle) ,获得
无细胞体系表达的抗原特异性克隆。将此克隆的重
链基因或轻链基因,与剩下另一个链的文库组合,建
立次级替换抗体库,以同样的方法筛选出更高亲和
力的抗体,最终实现抗体的亲和力成熟的过程,成功
选择稳定性好的高亲和力抗体。
2 链替换的策略
链替换有效提高噬菌体抗体亲和力有赖于替
换轻链库和重链库的库容量大小和多样性, 同时
需要建立有效的噬菌体抗体筛选方法。通常噬菌
体抗体亲和力的水平与抗体库的库容大小呈线性
关系, 即库容越大, 抗体的亲和力就越高 [ 3- 5]。因
此通过提高噬菌体抗体分子的多样性来增加库
容,就可能获得较高亲和力的抗体。保持特异性
抗体的一条链不变, 与多样性互补链随机组合, 从
中筛选理想的互补链, 这样就增加了抗体的多样
性,重复进行链替换和亲和力筛选将产生高亲和
力的抗体。
Fab抗体的轻链或重链替换经常利用抗体基因
链和互补抗体基因库噬质粒载体的酶切位点, 通过
双酶切完成原有抗体基因链与多样性的重链库或轻
链库的重组,使所获得的酶切轻链或重链基因与对
应抗体基因载体片段进行重组, 构建次级轻链或重
链替换突变库, 并用于高亲和力抗体的筛选过程
(图 1)。 Scfv抗体的链替换除了应用上述方法将优
选克隆抗体基因 (VH或 V L )插入包含互补链基因的
载体来完成外, 还可以通过交替延伸 PCR ( overlap
extension PCR)将 VH 或 VL通过接头 ( L inks)与对应
的多样性互补基因库接合, 构建次级轻链或重链替
换突变库,但这种方法使用的接头有时会引起 Scfv
形成二聚体或多聚体 [ 4]。尽管没有明确提出先进
行轻链替换或重链替换 (顺序替换 ), 但因抗体多样
性的结构主要存在于重链, 所以一般先进行轻链替
换, 此方法不仅保留了在抗体结合中起主要作用的
抗体重链,而且更容易保证其多样性。尽量避免链
替换后所获得的抗体使抗原反应的特异性发生变
化。如果轻链替换后,亲和力仍不能满足需要,则再
进行重链替换。研究表明, 同时进行轻链和重链替
换 (平行替换 )虽然可以增加抗体基因的多样性, 但
此法因为缺乏导向,导致获得的配对抗体基因可能
并非最佳组合。
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2010年第 8期 王乃东等:链替换技术提高噬菌体抗体亲和力的研究进展
为引入限制性突变, 链替换可以与其他引导技
术结合,克服随机突变的不利因素。链替换与导向
选择 ( gu ided selection)技术配合使用,即利用已制
图 1 Fab抗体的轻链和重链替换的策略
备的特异性抗体轻或重链基因 (常为轻链基因 )来
引导替换选择互补基因,既可以提高亲和力,又能保
持抗体的抗原亲和性 [ 8 ]。 Ig分子中参与构成抗原
直接接触部位的区域是重和轻链可变区中的互补决
定区 ( CDR区 ), 尤其在重链的可变区, CDR3具有
更高的高变,是抗原特异性识别结合的部位,因而通
常 CDR3残基是决定抗体亲和力的主要因素。链替
换与 CDR3的完全随机或靶向位点突变配合使用可
借助 CDR3的多样性和链替换的导向作用,实现抗
体的体外亲和力成熟。如果引入 CDR3的靶向位点
突变。链替换获得抗体轻、重链组合的基因信息还
需要计算机的建模和抗原结合位点预测等方法的辅
助分析,如判断抗体可变区复合物的稳定性、分析抗
体可变区复合物与原有抗体识别抗原表位的差异
等,计算机可以辅助链替换更加合理、有效地完成亲
和力提高。
3 链替换的实际应用
近年来, 链替换作为一种技术方法用于提高抗
体的亲和力已有多种成功的尝试 (表 1)。由于 VH
在决定其抗体的抗原特异性中起主要作用, 所以保
留原有重链的轻链替换应用较多。根据不同的原有
抗体性能 (亲和力、特异性等 ) , 链替换所采用的噬
菌体抗体类型不同、抗原的种类不同,并且用于替换
的轻链或重链基因库又分为天然或特异性抗体基因
库,所以从亲和力提高的倍数来看,链替换后抗体亲
和力会有不同程度的提高。
表 1 链替换技术提高抗体亲和力的近期报道
抗原种类 噬菌体抗体类型 替换方法
亲和力
提高倍数
自然杀伤细胞的
激活受体 NKG2D Fab 轻重链替换 约 10倍
[ 9]
单核细胞趋化蛋
白 1 S cfv 轻链替换 15倍 [ 10]
肿瘤坏死因子受
体 Fas S cfv 轻链替换 22倍
[ 11]
人源抗乙肝表面
抗原 (H BSAg) Fab 轻链替换 约 1. 5倍
[ 12, 13]
毒素软骨藻酸偶
联牛血清蛋白 S cfv 轻链替换 约 10倍
[ 14]
人白细胞抗原
HLAA2 Scfv 轻链 300倍 [ 15]
炎症反应介质
TNF Fab 轻链替换 143- 206倍
[29]
人肿瘤坏死因子
( hTNF) Fab 轻重链替换 约 2倍 [ 30]
角蛋白 Fab 轻重链替换 23倍 [ 16]
半抗原 HER2 /neu
C6. 5
S cfv 轻重链替换 6倍 [ 17]
半抗原 Ph enylox
azolone( phox)
S cfv 轻重链替换 300倍 [ 1]
研究发现,链替换与不同突变 (错配 PCR、CDR
步移、DNA替换等 )的组合, 尤其是轻、重链间不同
突变的组合对亲和力的提高具有协同作用。 Zhu
等 [ 18] 利用 H eV attachm entenve lope g lycoprotein G
( sGH eV)作为抗原,从人天然噬菌体抗体库中筛选
出能中和 H endra virus(H eV )和 N ipah v irus( N iV)的
抗体 m102克隆, 利用轻链替换与重链使可变区基
因的随机突变组合, 产生的克隆 m102. 4对 sGHeV
亲和力高于其它的 Fab克隆,并被转化为对 N iV和
H eV具有较强的抑制率的 IgG1, 作为由 hen ipav irus
es引起疾病的预防、治疗、诊断或研究候选试剂。
Su i等 [ 19]利用抗人 SARSCoV的抗体 nAb与人天然
VL文库进行轻链替换, 然后组合 VL区的热点 CDR
突变,提高了抗体 nAb的亲和力, 并用于阻止优势
抗体驱动的 SARS冠状病毒的进化途径。Christens
en等 [ 20]对组织血型抗原 Lew is Y的人鼠嵌合抗体
进行链替换,其中 chIgG1克隆改善了对 Lew is Y抗
原的特异性,亲和力明显增强,同时分别分析了轻链
和重链对抗体特异性的影响, 认为链替换的组合方
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
法为提高抗糖类抗体的特异性和亲和力提供了技术
平台。Hu ls等 [ 21]利用链替换和 DNA替换组合的方
法对肿瘤相关的 Epcam抗原的 Scfv进行亲和力提
高,结果显示,抗体亲和力提高约 15倍。
链替换在提供了有价值的高亲和力抗体同时,
还有助于分析抗体重链或轻链基因对抗原特异性的
影响, 判断抗体重链或轻链基因在抗原抗体接合中
发挥的作用, 有助于较好理解免疫化学。 Prou lx
等 [ 22]利用轻链替换提高了人红细胞膜 D抗原单克
隆抗体 43F10的亲和力。研究先以 43F10的重链基
因与免疫后个体的外周血单个核细胞 ( PBMNCs)构
建的轻链库重组替换,利用完整的红细胞筛选后,间
接凝集反应试验显示 43F10轻链替换后克隆 p3. 17
与红细胞膜弱 D抗原的亲和力得到提高, 43F10与
p3. 17的 VL 和 J segments存在差异, 同源性仅达
86. 4% ,并进一步证实了重链基因在决定红细胞膜
D抗原特异性中起主要作用。 Suzuk i等 [ 23]对人抗
双链 DNA ( dsDNA ) Fab抗体的重链和轻链序列分析
发现,抗体的 DNA结合活性依赖于轻链。为了确定
在抗体与 DNA结合中轻链的作用, 通过在原有抗
dsDNA的 Fab克隆之间链替换构建了新的重组 Fab
克隆 (图 2) ,采用具有高 DNA结合活性的 Fab克隆
711的轻链与低 DNA结合活性的克隆 13或51的
轻链替换, 新高亲和力 Fab克隆 rH1L7和 rH5L7具
有高 DNA结合活性, rH7L1和 rH7L5具有低 DNA
结合活性,表明轻链决定了抗体的 DNA结合活性,
认为链替换可以用于分析人自身抗体的抗原抗体结
合的分子机制。Kumar等 [ 24]在研究证明抗磷脂抗体
图 2 人抗双链 DNA ( dsDNA) Fab抗体的
重链 ( Fd)和轻链结合活性分析的示意图 [ 23]
UK4的抗心磷脂活性由重链基因主导后, 发现 UK4
与血浆蛋白 2G lycopro tein I( 2GPI)有强反应性,
利用链替换和 Dock ing发现抗 p185抗体 4D5与 2
GPI没有反应性, UK4重链与 4D5轻链组合, 与 2
GPI没有反应性, UK4与 2GPI存在的心磷脂的反
应性也下降。由此证明,抗 2GPI活性由 UK4的
轻链主导,抗体活性可以借助链替换实现传递。
链替换还可用于鼠源性抗体的人源化改造, 制
备人鼠嵌合抗体或人源化抗体, 以减少或避免鼠源
抗体基因引起的不利反应。K im等 [ 25]保留鼠源肿
瘤相关糖蛋白 TAG72 Fab抗体的重链作为引导,利
用轻链替换制备的轻链完全人源化 Fab具有较好的
亲和力,并计划利用完全人源化轻链导向筛选互补
人源化重链。Kupper等 [ 26]对抗突变链球菌的鼠单
克隆抗体 Guys 13和人抗体可变区基因库进行链
替换,人源化抗体保持对口腔病原性突变链球菌表
面黏附素较好的亲和力和特异性。包国强等 [ 27]采
用导向选择链更替技术建立全人源性 Fab基因库,
筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原
HAb18G的 Fab抗体, 认为导向链替换可以减少鼠
源和人源抗体序列的差异在抗体展示和筛选过程中
对抗体构象的影响。另外, 可利用链替换配合分子
生物学技术对抗体基因的改造, 解决在细菌表达系
统不能正确表达来自真核细胞抗体基因的问题。
Ro jas等 [ 28]在利用 N g lyco ly l GM 3特异性的鼠单抗
杂交瘤细胞的可变区基因制备 Scfv中发现,不能检
测到抗体活性和表达,利用轻链替换方法成功筛选
并正确表达特异性抗体。
噬菌体抗体库技术具有直接得到抗体基因、多
样性高、技术灵活方便等优点,但提高噬菌体抗体的
亲和力仍然是抗体在实际应用中面临的问题。链替
换可以单独或组合其他亲和力成熟技术使抗体的体
外成熟研究更有效、更方便。根据实际需要设计不
同的抗体轻链 (V L )或重链 (VH )组合, 可以突破模
拟体内亲和力成熟的界限, 制备体内不能自然产生
的特异性高亲和力新抗体 [ 20] , 如自身抗原或弱抗原
的抗体等,实现体外控制抗体的性能。随着噬菌体
抗体库和体外亲和力成熟技术的进步和发展, 一定
会有新的方法和技术平台不断出现, 将会使抗原抗
体结合的信息更加详尽, 以满足抗体结构与功能研
究和应用的需要。
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2010年第 8期 王乃东等:链替换技术提高噬菌体抗体亲和力的研究进展
参 考 文 献
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