全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2008-01-22
基金项目:辽宁省教育厅科研项目(批准号:20060187)和辽宁省教育厅青年基金项目(2004F101)
作者简介:杜爽(1982-),女,在读研究生,研究方向:水产动物繁育
通讯作者:仇雪梅(1964-),女,博士,教授,研究方向:水产动物分子遗传学;E-mail:xmqiu@dlfu.edu.cn
微卫星 DNA(microsateliteDNA)又称简单序列重复(SimpleSequenceRepeats,SSR),一般以 1～6个碱
基为核心序列,经过多次的串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列[1]。与其它分子标记相比,微卫星标
记具有的优点:微卫星标记具有座位数目巨大并随机分布于基因组中(内含子、外显子、基因间序列)、多态
性丰富、共显性遗传方式、分析方法简单、重复性好和近缘种中引物通用性高等优点,在动物的群体遗传分
析、亲子鉴定、基因组作图和遗传育种中得到了广泛的应用[2,3]。
微卫星 DNA的 PCR产物检测方法主要有荧光标记引物的测序法、同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳
法,以及银染聚丙烯酰胺 PAGE(polyacrylamidegelelectrophoresis)方法。由于 PAGE-银染法操作简单、分辨
率高、灵敏度高等特点,目前很多国内外的实验室都是通过这种方法来鉴定微卫星产物。在鱼类微卫星
PCR产物的鉴定中,变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶方法都有所报道[4,5]。
在应用微卫星标记对牙鲆群体的检测工作中,对银染聚丙烯胺凝胶电泳技术的最适条件进行了探索。
经过多次实验,找到了 PAGE电泳的最适条件,可以对动物个体或群体微卫星 DNA扩增产物进行更为准
确、可靠的鉴定分析。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样本 实验样本采自大连海域牙鲆群体共 30尾,取其适量肌肉组织加入 95%乙醇后,放入-20℃保
存备用。
1.1.2 微卫星引物 从 NCBI的 GenBank数据库中下载牙鲆微卫星序列,经软件 PrimerPremier5.0设计引
微卫星DNA检测方法的研究
杜爽 仇雪梅
(大连水产学院生命科学与技术学院,大连 116023)
摘 要: 在检测牙鲆的微卫星变异时,对聚丙烯酰胺凝胶的种类、浓度及其银染方法进行了优化。实验总结了一套
适用于微卫星检测的方法。该方法具有灵敏度高、凝胶透明度高、对环境污染小、条带清晰和染色时间短等特点,能显著
提高检测分辨率,具有广泛的推广价值。
关键词: 微卫星 聚丙烯酰胺凝胶电泳 银染 牙鲆
MethodsforDetectingofMicrosateliteDNA
DuShuang QiuXuemei
(ColegeofLifeScienceandBiotechnology,DalianFisheriesUniversity,Dalian116023)
Abstract: Inthisstudy,theselectionsofpolyacrylamidegeltypesandsilverstainingmethodswereoptimizedwhen
theSSR variationsweredetectedinJapaneseflounder.Asetofexperimentstofloundermicrosatelitedetectionmethod
weresummedup.ThemicrosateliteDNA bandsareclearlydiscerniblewithsatisfactoryresult.Themethodsare
characterizedassimplesteps,highsensitivity,brightbackground,litlepolution,whicharevaluableforpracticalapplication.
Keywords: MicrosateliteDNA PolyacrylamidegelelectrophoresisSilverstaining Japaneseflounder
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物。由上海生物工程技术服务公司合成引物,并按照说明溶解引物。引物序列为
F:5′atgaggagggaagcagg3′;R:5′tggagcagaaggtagcc3′
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA的提取 采用分子克隆实验指南中[6]的酚、氯仿法抽提牙鲆的基因组 DNA,得到的
DNA加 TE溶解后置-20℃冰箱中备用。
1.2.2 PCR反应体系 PCR反应体系为 25μl,内含约 100ng的模板 DNA,0.4!mol/L的 dNTPs,1.5mmol/L
的 Mg2+,1×PCR反应缓冲液,0.25μlTaqDNA聚合酶(Promega公司)。反应在 EppendorfMastercyclerPCR扩
增仪上进行。反应程序为 94℃预变性 5min,然后进行如下条件的 30个循环:94℃变性 35s,退火 55℃30s,
72℃延伸 35s,最后 72℃延伸 5min。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶的配制 按照表 1、表 2聚丙烯酰胺凝胶的配方配制常用浓度的变性和非变性聚
丙烯酰胺凝胶。
表 2 不同浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方表 1 不同浓度变性聚丙烯酰胺凝胶的配方
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 吸取 1μl的 PCR产物和 6μl的上样缓冲液,充分混匀,然后用微量加样器吸
取加样。上样完毕后 140V电压电泳,当溴酚蓝指示剂距电泳板底边 1cm～2cm时结束电泳。
1.2.5 银染 电泳结束后,移走上层玻璃板,将凝胶轻轻地取下放入装有固定液(10%的乙醇溶液)的白瓷
盘中,在摇床上缓缓摇动 10min;倒掉瓷盘中的固定
液,用双蒸水洗 2次,每次 30s;倒掉瓷盘中的水,加
入染色液 (0.1%AgNO3溶液或 0.2%AgNO3溶液对比
效果),在摇床上缓缓摇动染色 15min;倒掉瓷盘中的
染色液,用双蒸水洗 3次,每次 30s;再加一定体积显
色液 (配方见表 3),轻摇瓷盘直到显现出清晰的条
带,即可终止。
2 结果
2.1 基因组 DNA的检测
取溶解的牙鲆基因组在含 EB的 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为 130V,35min。在凝胶成像仪
上观察结果并照相,结果见图 1。与 λ-HindⅢ marker对照可知,DNA浓度约为 50ng/μl,可用于 PCR反应。
2.2 PCR扩增结果检测
取经过检测的牙鲆基因组,进行 PCR扩增。PCR产物在含 EB的 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,在凝胶成
像仪上观察结果并照相,结果见图 2。
2.3 非变性 PAGE与变性 PAGE的效果比较
按照聚丙烯酰胺凝胶的配方,配制变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶。将经过检测的 PCR产物用变性和
非变性 PAGE胶进行检测。结果见图 3和图 4。
表 3 显色液的配方
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从图 3和图 4中可以看出,非变性 PAGE和变性 PAGE都能清楚的显示目标带,但 SSR在非变性
PAGE上的带型要比变性 PAGE的带型好,更清楚。
2.4 不同浓度的非变性 PAGE胶的对比
按照表 2分别配制 8%和 12%的非变性 PAGE胶,用相同的 PCR扩增产物分别点到两板不同浓度的
PAGE上,上样量为 6μl,1×TBE,140V恒压电泳 5h(图 5、图 6)。
图 1 牙鲆基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳
图 2 牙鲆微卫星 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
M:DL2000DNAmarker 1~3:不
同个体的牙鲆 PCR扩增产物
M:λ-HindⅢ marker
1~7:不同个体的牙鲆基因组
图 3 10%非变性 PAGE胶
M:Φx174-HaeⅢ marker 1~4:同一
引物不同个体的 PCR扩增产物
图 4 6%变性 PAGE胶
M:Φx174-HaeⅢ marker 1~4:同一引
物不同个体的 PCR扩增产物
图 5 8%非变性 PAGE胶 图 6 12%非变性 PAGE胶
M:Φx174-HaeⅢ marker 1~6:同一
引物不同个体的 PCR扩增产物
M:Φx174-HaeⅢ marker 1~6:同一
引物不同个体的 PCR扩增产物
从图 5和图 6中可以看出浓度为 12%的 PAGE上的带型较 8%的清楚,所以选择浓度为 12%的
PAGE。
2.5 银染方法的比较
2.5.1 染色液的选择 将一板聚丙烯酰胺胶的点样孔左右 2部分别点上相同的 PCR扩增产物,固定后将
胶一分为二,分别放入 0.1%和 0.2%的 AgNO3溶液中,染色 15min,加入相同显色液后,观察其结果。结果显
示,0.2%的 AgNO3溶液反应灵敏,5min就会显现条带,但是背景较深,略带墨绿色;0.1%的 AgNO3溶液
12min显带,虽然显色时间比 0.2%的 AgNO3溶液长,但背景较浅,呈现淡黄色。
2.5.2 显色液的选择 将一板聚丙烯酰胺胶的点样孔左右两部分分别点上相同的 PCR扩增产物,经过固
定、染色后,将胶一分为二,分别放入 2种不同的显色液中(表 3)。经过反复的实验发现,2种显色液都能显
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现清晰的条带,但第一种染色液灵敏度高,颜色略浅一些,而且所用试剂价格比较便宜。
3 讨论
3.1 非变性 PAGE与变性 PAGE的选择
在凝胶电泳鉴定微卫星产物的过程中,变性和非变性 PAGE胶都有使用。有实验表明,两种 PAGE胶
在条带分离效果上略有区别。曲鲁江等[9]在对鸡的研究中发现,变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶对微卫星产
物进行电泳时,二者对同一微卫星 PCR产物的电泳结果有较大的差别,在非变性凝胶中条带过于复杂,出
现的非特异性条带极大的影响了分析带形的准确性,从而使实验结果的误差大大加大。但是在本研究中,
对同一微卫星 PCR产物进行了比较,并没有发现较大的差别,都存在非特异性条带。而且非变性 PAGE胶
显示条带的结果比变性 PAGE胶的效果好。
3.2 染色方法的探讨
聚丙烯酰胺凝胶电泳后,可以用溴化乙锭(EB)染色。由于 EB染色的灵敏度不够高,对微量 DNA片段
的分析不太适用。另外,EB是致癌物,给实验操作带来很多不必要的麻烦。因此,采用银染的方法。该法既
经济、简便、快速、灵敏,又具有降低污染、分辨率高、结果可永久保存等优点,是一种检测微量 DNA的理想
方法[10]。在实验中有时也会遇到条带不清楚、背景发黄,颜色过深等问题。研究结果表明用 0.1%的 AgNO3
溶液染色,NaOH、Na2CO3和甲醛配制的显色液,显色效果最好。这与 AgNO3溶液的浓度,显色液的配制,清
洗水的质量、染色时间的长短等有关。在实际进行实验时,要摸索条件,使其达到最佳状态。
3.3 对非特异性条带的分析
聚丙烯酰胺凝胶的分辨率高,理论上能分开长度相差 0.1%的 DNA分子,因此它几乎可以检测出 PCR
扩增出的所有条带。实际操作中,在银染后的凝胶上除看到主带外,还常伴随着出现一些显色较浅的非特
异性带,且不同的引物产生的非特异性带不同。这些非特异性带会影响基因型的判断。关于非特异性带产
生的机制,Muray[11]等认为是 DNA链复制过程中的滑动错配造成的。非特异性带的产生与模板和引物质
量、退火温度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶的量、循环次数等诸多因素有关。通过多方面的摸索,觉得减少循
环次数,相对升高一些退火温度和减少 TaqDNA聚合酶的量是最有效的办法。另外,通过对 PAGE和银染
方法的摸索,也可以有效的改变非特异性带的显现。通过改变这些条件,取得了良好的效果,有时非特异性
带不能完全消除,但是它不会影响等位基因的判定,因为在某特定的位点上,非特异性带的带型通常是固
定的,并且银染后主带比非特异性带清晰、易读。
参考 文献
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