全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 丑了口了百付 口尤口 年增刊
大口黑妒 的克隆和序列分析
于凌云 ‘, 白俊杰 , 叶星‘ 李胜杰 ,
中国水产科学研究院珠江水产研究所 , 中国水产科学院热带亚热带鱼类选育与
养殖重点开放实验室 , 广州 上海水产大学 生命科学与技术学院 , 上海
摘 要 基因是生肌调节因子 家族的主要成员之一 , 是脊稚动物胚胎期肌 肉发育的主导调控基
因之一 , 对骨骼肌的形成和分化起主要作用 。 采用 一 和 方法获得大口黑妒 基因的 序列长
为 巧 , 其中 ’ 非编码区为 , 开放阅读框长 , 编码 个氛基酸 。 结构分析表明该肤链无信号肤 ,
第 一 个氛基酸为 基 因的 区 碱性氨基酸区 , 第 一 个氨基酸为 基因的 结构 螺
旋环螺旋结构。 通过对比分析已知 中其它脊稚动物 基因发现 , 该基 因编码的氨基酸肤链随动物
由低等向高等进化有加长的趋势 , 且核普酸 以及推测的氛基酸同源性和动物之间的亲缘关 系相一致 大 口 黑妒
基因的克隆为研究该基 因打靶和鱼类肌 肉发育调控机理莫定基础 。
关键词 大 口黑妒 克隆 序列分析
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K e y w o rd s : 1五rg e m o u th b as s M y o D C lo n in g S e卿enee analysis
现代肌肉发育生物学的研究表明 , 脊椎动物肌
肉的生长潜力即肌纤维的数量在出生前就已决定 ,
出生后数 目不再改变 〔’,z] , 出生后肌 肉的生长主要
靠肌纤维长度和周径的增大 , 而肌纤维的增粗又会
基金项 目:国家科技支撑项 目(N O .Zo 5 D K A 2110 3) 和 国家科技基础条件平台工作项 目(Zo 5 D K A Z ll03 )及广东省 自然科学基金项 目
(N O .730 1732 )
作者简介:于凌云 (19 80一 ) ,男 , 在读硕士 , 研究方向:生物技术和动物遗传育种 ;E一 m ail : L y sn p @ 16 3 . co m , Te l : 0 2 0 一81 61 61 27
通讯作者:白俊杰 (1957 一 ) , E 一 m a i l : b a ij j Z o s @ Z l c n · e o m
生物杖术通报 B to te ch nole gy 200 8 年增刊
影响肌肉的嫩度 , 从而影响其肉用品质〔’〕。 生肌调
节因子 M R Fs(M yogenie re gulato叮 fa etors )对骨骼肌
发生起重要的调节作用. 可激活肌肉的基因转录 ,
抑制细胞生长周期 , 促进细胞分化〔‘】。 M R F , 家族
基因包括 M yoD 、 M y o G 、 M 声 和 M R F4 4 种转录调节
因子 , 它们都具有一个保守的碱性螺旋 一 环 一 螺旋
结构(bH LH )[ ’] 。 这些转录调节因子在肌肉发生过
程中具有不同的时空表达模式 , 各自发挥不同作用 ,
个体出生后 M yo D 、 M 娇5 和 M yo G 基因仅在肌卫星
细胞中表达 , 并影响肌卫星细胞的活性 。 其中的
M yo D 基因是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控
基因之一 , 对骨骼肌的形成和分化起主要作用 , 可通
过多个途径激活肌肉基因的转录 , 从而促进成肌细
胞的分化〔6 , , j 。 相对其它生肌调节因子 , M yo D 主要
在成肌过程中起作用 , 其表达对维持肌细胞分化有
重要作用 , M yo D 缺失可导致成肌细胞的增殖和分
化无法进行【‘,9] 。 相反 , M yo D 基因的过度表达会抑
制成肌细胞的增殖过程 , 并促进成肌细胞分化形成
成熟的肌纤维细胞 〔’。〕。 此外 , M yo D 基因还会通过
影响 M yo G 基因的活性来间接影响肌细胞的终端分
化过程[11]。
自从 1987 年 Devis首次发现并获得 M yoD 基因cD NA 以来 〔” 〕, 对生肌调节因子的研究越来越受到
人们的重视 , 迄今已克隆获得包括人 、鼠 、猪 、 牛 、罗
非鱼 、虹缚 、斑马鱼等多种脊椎动物在内的 M yo D 基
因 , 目前对于该基因的研究目前主要集中在家畜动
物的基因的结构 、组织表达以及功能上 , 而在水产动
物研究报道较少〔” , ’4 〕。 笔者选择我国重要的养殖
品种大 口黑妒(材艺croP te二 、al lno ides ) 作为研究对
象 , 对大口黑妒 M STN 基因进行了克隆和序列分析 ,
以期为该基因打靶和鱼类肌肉发育调控机理及肉质
改良研究奠定基础 。
1
.
1 材料
1.1.1 样品来源 试验用的大 口黑妒成鱼体重
40 摊 , 来自广州省大口黑妒良种场
1.1.2 主要试剂 Ta K aR a R N A PCR Kit (A M V )
V er.3. 0 试 剂盒 、 3 ’ F u l l R A C E C o re s e t 儿t 和
PM D ls 一 T v e e to r S y s te m 购自大连宝生生物公司;胶
回收(E .2.N .A G el Extraetion Kit)试剂盒为美国 0 -
M E GA 公司产品;Pc R 扩增引物由上海英骏生物技
术有限公司合成;大肠杆菌 D H 5a 由本实验室保存。
1
.
2 方法
1.2 .1 大口黑妒总 R N A 的提取 按照 Pro m ega 公
司 sv T otal R NA Isolation K it试剂盒的方法提取大
口黑妒肌肉总 R NA , 并用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测
其质量和浓度 。
1
.
2
.
2 M yo D 引物设计与 PCR 扩增 根据在 Gen -
Ban k 上登录的斑马鱼(ze br咖h) 、罗非鱼(Ore oc hro -m is aure。 ) 、 金 头绸 (Sp arus aura ta ) 、 虹 蹲 ( 0 .
刀理人is、) M yo D 的 cD NA 序列 , 在其同源保守区域分
别设计了一对引物(Fl 和 Rl )扩增该基因的核心序
列 , 反转录按 TakaR a RN A PCR K it(A M V )V er.3.0
试剂盒上的步骤操作 , 反应结束后进行 PCR 扩增:
先 94℃ 变性 sm in , 接着 94℃ 变性 305 , 5 0 ℃ 退火
30 , , 72 ℃延伸30 5, 共 32 个循环 , 最后一次循环结束
后 72 ℃延伸7m in 。 然后根据测得的 M yo D cDN A 核
心序列设计两条上 游引物 (咫 和 邢 )进行 3 ‘ F ul
RA
C E 扩增 , 下游引物采用 3 ’ F u l l RA C E C o re s e t K i t
试剂盒提供的引物o uter prim er和 innerpri m er。 p C R
扩增反应按照反转录试剂盒的操作说明进行 。 引物
中简并碱基分别代表:B 二 G/ O T ; Y = C / T; R 二 刀
G; K 二 G/ T 。 所合成的引物序列见表 1 。
表 1 PCR 扩增的引物序列
引物 序列 (5 ‘~ 3
F I : 5
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引物 序列(5 ’ 争3 ’ )
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退火温度
TM :54℃
T M :60 ℃
2 . 3 大口黑妒 M yo D cD NA 克隆与测序
根据美国 O M E GA 公司产品提供的方法用 E
2 .N .A G el E xtra etion K it试剂盒进行胶回收和纯化
目的扩增片段 , 插人 pM D 18 一T 载体中 , 转化大肠杆
年增刊 于凌云等:大口黑妒 M yo D cDN A 的克隆和序列分析 303
菌 D H 5a 感受态细胞 , 挑选 白斑 , 用菌落 PC R 方法
鉴定阳性克隆 , 测序由上海英骏生物技术有限公司
完成 。
1
.
2
.
4 序列分析 D NA 测序在 A BI PR ISM TM 377
全 自动荧光测序仪上进 行 , 利用 D NA 分析软件
V eetor N竹 8. 0 以及在线软件 ExPA Sy Pro teom ies
Se rv er (~
.ex Pa sy .or g)进行序列分析 , 包括核昔酸
序列中O R F 的寻找 , 编码氨基酸序列的推导及其信
号肤和蛋白质高级结构的预测 。
2 结果
2.1 大 口 黑妒 M yo D 基因的克隆
大口黑妒总 R N A 经反转录 , 用引物 Fl 和 R l
扩增 , 获得一约为750bp 的特异条带(图 la) ;用 F2
和 3 ‘ F U L L R A C E o u t e r p 找m e r 进行 3 ’ R A C E 扩增 ,
以此产物为模板 , 以 F3 和 3 ’ F U L L RA C E i n er
p ri m er 做套式扩增后获得单一的特异条带 , 大小为
70 0帅(图 lb) ,将所获得的 PC R 产物经低熔点琼脂
糖凝胶电泳回收后连接到 T 载体上 , 筛选阳性转化
子进行测序。
图 1 M yo D 基因 cD NA 的扩增结果a.M yoD 基因 CD N A 核心序列扩增;b.M yoD 基因 cD N A
3 ’ R A C E 扩增
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2 测序结果及序列分析
将 3 ’端序列和核心序列用 vec to : N TI 8.0 软件
拼接 , 获得了大口黑妒 M yo D 基因的 CD N A 核心序
列 , 长为 1157bp 。 经 ExPA Sy 软件在线分析 , M y o D
基因核心序列的 3 ’非编码区为 314 bp , 开放阅读框
长 843饰 , 编码 280 个氨基酸 , M yo D 基因编码蛋白
的分子量为 31 .09 K D , 等电点为 6.06 , 在编码的 280
个氨基酸中酸性氨基酸为 37 个 , 占全部氨基酸总数
的 13 .21 % ;碱性氨基酸为 32 个 , 占全部氨基酸总
数的 1 .43 % ;极性氨基酸为 87 个 , 占全部氨基酸
总数的31 .07 % ;疏水性氨基酸 7 个占全部氨基酸
总数的27 .50 % ;将扩增获得的大口黑妒 M yo D 基因
开放阅读框编码的氨基酸序列通过 N CBI 在线查
询 , 发现大口黑妒 M yo D 基因具有该家族基因的典
型结构域 bH LH 。 第 1 一 l ro 个氨基酸为 M yo D 基因
的 Bas ic 区(碱性氨基酸区 ) , 第 124 一 16 7 个氨基酸
为 M yo D 基因的 H LH 结构(螺旋环螺旋结构) , 序列
分析结果表明该肤链无信号肤 。
3 讨论
大口黑妒 M yo D 基因的 cD NA 保守性较高 , 与
Ge nBan k 中已登录的其它动物的 M yo D 基因相 比
(见表2 ) , 与罗非鱼及金绸绸 Myo D 基因核昔酸同
源性最高 , 达 8 % 和 84 % , 氨基酸同源性分别为
86 % 和 83 % , 与其它鱼类的同源性为 63 % 一 72 % ,
氨基酸的同源性为 6 % 一 71 % ;与两栖类爪蟾的核
昔酸同源性为 58 % , 氨基酸同源性为 62 % ;与哺乳
动物(人 、 鼠、鸡 、猪)核昔酸同源性分别为 54 % -
62% , 氨基酸同源性为 51 % 一 61 % ;对 比结果表明
M yo D 基因的保守性较高 , 且氨基酸肤链的长度随
动物由低等到高等有逐渐加长的趋势 , 有动物随低
等向高等进化 , 编码 M yo D 基因的肤链 由 276 个氨
基酸(虹蹲 、草鱼)增加到 321 个氨基酸 (人 ) , 即使
同为鱼类 ,低等鱼类和高等鱼类氨基酸肤链的长度
仍有较大的差距 , 提示 M yo D 基因的氨基酸肤链的
长度和空间结构可能与肌肉发育和进化的程度有
关 ;另外该基因核昔酸序列和氨基酸序列同源性的
高低以及氨基酸肚链长度的差异都和不同动物亲缘
关系的远近相关网 。
根据大 口黑妒 M yo D 基因的开放阅读框及其编
码的氨基酸序列对比结果 , 利用 M eg a2 .0 软件构建
氨基酸进化树 , 如图 3 所示 。 从进化树可以看到 , 这
12 个不同物种的 M yo D 基因的核昔酸及氨基酸首先
分两个大的分支 。 一枝为鱼类 M yo D , 另一枝以哺
乳动物和两栖动物为主 ;从进化树可以看出 , 同属妒
形目大 口黑妒与罗非鱼 、金头绸在同一分支 , 我们认
为这三者的亲缘关系最近 。
性物杖术通摧 刀勿翻动no勿g梦 B u肠血 2(X) 8 年增刊
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圈2 大口黑扩 M yoD 基因 cD NA 核心序列及其推测的氮基酸序列
碱基序列在下 , 氨基酸序列在上 ;终止密码子用 *表示;匣巫{为终止信号
表2 大口黑助 晰。D 基因同其它动物 M yo D 墓因的同源性比较
年增刊 于凌云等:大口黑妒 M yo D cDN A 的克隆和序列分析 305
常用名 碱基同源性(% ) 氨基酸同源性(% ) 编码氨基酸的长度
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图3 依据不同动物 M yo D 氨基酸序列构建的进化树
M R F s的氨基酸序列是有一个碱性区和一个紧
邻的 b 螺旋环螺旋 (H LH )结构组成 。 碱性区是与
D NA 结合的部位 , 该区的几个氨基酸(A rg l11 、 Al a
1 1 4
、
T h r 1 1 5
、
L y , 1 2 4 ) 是激活肌肉基因转录的关键 ,
用其他 bH LH 蛋白相应位置的氨基酸取代这些氨基
酸 , 可以灭活 M yo D 及其家族的基因转录作用 ,但不
会影响其与 DN A 结合 [’‘] 。 M R r , 中 bH LH 一 D N A 复
合物的晶体结构研究表明 , A rg 1 H 直接与主沟接
触 , 激活肌肉基因转录 , L ys 1 24 暴露于表面 , 使其容
易参于蛋白质之间的相互作用 , Al a l l4 和 Th rl 巧 位
于蛋白一 D N A 复合物的接触面 , 不直接参于蛋白质
之间的相互作用 , 可能是通过影响 A rg 的构型 间接
起作用 。 本试验所获得的大 口黑妒 M yo D 基因的
cD N A 氨基酸序列碱性区中 , 其中的精氨酸和丙氨
酸所处的位置相同 (A rg l11 、 Al a 1 14 ) , 而 1巧 处的
苏氨酸被另外一个丙氨酸所取代 , 苏氨酸所处的位
置都向后移动一位(Thr 116 ) , 根据 Davi, R L 等〔’6 ]
的研究 , 这种结构的变化可能是与动物有低等向高
等进化 , 氨基酸肤链有逐渐加长的趋势相符 。 另外 ,
该基因所编码的氨基酸肤链经 Si gna 护 3 .0 软件在
线分析发现该蛋白没有信号肤序列 , 这和该基因只
有在骨骼肌细胞特异表达的组织特异性相符 , 也和
该基因的 bH LH 结构域始于第一氨基酸的结构特点
相一致[17, 】8 ] 。
参 考 文 献
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8 8
:
5 6 7 5
一 5 6 7 9
.
( 上接第300 页)
因编码的前体蛋白经水解后产生的 。 其中gP 90 作
为病毒的囊膜外糖蛋白 , 是 R EV 的免疫显性蛋白
(Davidson et al. , 1 9 9 5 ) , 且具有病毒的型特异性
(C hen etal. , 1 9 8 7 ) ; g p 9 0 还是诱导宿主产生中和抗
体的主要蛋白质 , R E V 抗原的高度变异性主要体现
在这一蛋白上 。
据报道 ,在真核系统中表达 gP 90 的表达产物 ,
可以抵抗病毒对宿主细胞的侵害 , 但在原核系统中
表达 gP 90 功能如何 , 还未见报道 , 该研究结果为进
一步探明在原核系统中表达 gP 90 产物的功能提供
了保证 , 为准确监测 R EV 和防治 RE 奠定了坚实的
基础 :
参 考 文 献
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