全 文 ：初探异叶败酱提取物对鸡胚翅芽发生中
基因表达模式的作用
胡　燕 1 ,程卫东 1, 2＊ ,赵望泓 3 ,刘　欣 1 ,王学习 1
(1.兰州大学中西医结合研究所 ,甘肃 兰州 730000;2.北京师范大学 ,北京 100009;3.兰州大学口腔医学
院 ,甘肃 兰州 730000)
　　摘要　目的:利用鸡胚翅芽模型检测异叶败酱提取物对胚胎发育过程中基因表达模式的调控作用。方法:将
带有异叶败酱提取物的丙烯酰胺念珠植入鸡胚翅芽 , 进行原位杂交 ,观察异叶败酱提取物对基因 Myf5、Myod和 PC-
NA表达的影响。结果:异叶败酱提取物(200 mg/mL)能下调在翅芽发育过程中基因 Myf5、Myod和 PCNA表达。结
论:异叶败酱提取物能抑制细胞分化和增殖。
关键词　异叶败酱;鸡胚;Myf5;MyoD;PCNA
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)11-1764-04
EfectsofExtractsfromPatriniaheterophylaonGeneExpressionPaterns
duringMorphogenesisofChickenLimbBudsinvivo
HUYan1 , CHENGWei-dong1 , 2 , ZHAOWang-hong3 , LIUXin1 , WANGXue-xi1
(1.InstituteofIntegratedChineseandWesternMedicine, LanzhouUniversity, Gansu730000, China;2.BeijingNormalUniversity, Bei-
jing100009, China;3.SchoolofStomatology, LanzhouUniversity, Gansu730000, China)
Abstract　Objective:TostudytheeffectsoftheextractsfromPatriniaheterophylaongeneexpressionpatternsduringmorphogen-
esisofchickenlimbbudsinvivo.Methods:Implantedabeadintoanchickenembryo, whichwassoakedintheextractsfromPatrinia
heterophylla.Detectedtheextracts-inducedmorphogenesischanges(Myf5, MyodandPCNA).Results:TheextractsfromPatriniahet-
erophyla(200 mg/mL)couldaffectlimbbuddevelopment, reducegeneexpressionofMyf5, MyoDandPCNA.Conclusion:Theextracts
fromPatriniaheterophylacaninhibitcelldifferentiationandproliferation.
Keywords　PatriniaheterophylaBunge;Chickembryoinvivomodel;Myf5;MyoD;PCNA
收稿日期:2009-11-24基金项目:甘肃省国际科技合作计划(2008GS00862)作者简介:胡燕(1978-),女 ,讲师 ,在读博士 ,主要从事中西医结合治疗常见病研究;E-mail:huy@lzu.edu.cn。＊通讯作者:程卫东 , Tel:0931-8915184, E-mail:chengweidong888@sina.com。
　　异叶败酱(PatriniaheterophylaBunge)为败酱
科败酱属植物 ,常与其同属植物糙叶败酱(Patrinia
scabraBunge)混用 ,俗称墓头回 。药用其根茎和全
草 ,成分主要为挥发油和皂苷。墓头回提取物均有
一定的体内外抗肿瘤作用 〔1-3〕 ,能促进肿瘤细胞凋
亡 ,诱导肿瘤细胞分化〔4〕 ,抑制鸡胚尿囊绒毛膜新
生血管的生成 〔5〕。
发育中的鸡胚肢芽可作为一个良好的体内检测
药物作用及副作用的动物模型。本实验应用异叶败
酱提取物作用于发育鸡胚 ,观察其对胚胎发育中基
因表达的调控作用 ,以期认识异叶败酱对胚胎发生
中具有重要作用的相关基因表达的影响 ,现报道如
下:
1　材料
1.1　胚胎　受精鸡蛋(WhiteLeghorn)来自兰州市
生物制品研究所 ,常规孵化 ,选择 HH16 ～ 20期 〔6〕胚
胎进行实验。
1.2　丙烯酰胺念珠　丙烯酰胺念珠 (Sigma, Ger-
many),直径大约为 80μm左右。经检测 ,丙烯酰胺
念珠能够摄取异叶败酱提取物 ,摄取异叶败酱提取
物的量具有剂量依赖性;同时 ,异叶败酱提取物含药
念珠在 PBS中能够缓慢稳定释放 。
1.3　试剂　地高辛 RNA标记试剂盒 , Boe-hringer,
Mannheim, Germany;杂交的 RNA探针依据下列质
粒模板预备 , 质粒分别含下列基因片段:MyoD、
Myf5、PCNA,由德国弗莱堡大学解剖与细胞生物学
研究所 BeateBrand-Saberi教授惠赠 。
2　方法
2.1　异叶败酱提取物及其含药念珠的制备
2.1.1　异叶败酱提取物的制备:异叶败酱采自甘
肃庆阳地区 ,经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为
异叶败酱 (PatriniaheterophylaBunge)。按李立 〔7〕
方法制备异叶败酱提取物 , DMSO助溶 , PBS配制成
饱和溶液 , DMSO终浓度小于 0.1%。
·1764· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 11期 2010年 11月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.11.045
2.1.2　异叶败酱提取物溶液含药念珠的制备:取
PBS处理的丙烯酰胺念珠 ,浸入异叶败酱提取物
PBS饱和溶液 ,于 4 ℃下放置一夜 ,制备异叶败酱提
取物溶液含药念珠 ,待用。以 PBS代替异叶败酱提
取物制备 PBS念珠 ,作对照组植入念珠。
2.2　分组及处理 　选择发育至 HH16 ～ 20期胚
胎 ,随机分为实验组和对照组。 MyoD、Myf5、PCNA
基因在 HH16 ～ 20期胚胎表达于翅芽中央部位。进
行胚胎操作〔8〕 ,在该部位植入念珠。实验组胚胎 ,
右侧翅芽植入异叶败酱提取物含药念珠 ,左侧翅芽
不作处理 。对照组胚胎操作以 PBS念珠代替含药
念珠 。术后 ,胚胎继续孵化 24h,处死 , 4%多聚甲醛
4℃固定过夜 ,甲醇梯度脱水 , -20℃存放 。
2.3　胚胎原位杂交　收集实验胚胎 ,进行原位杂
交 ,操作均按试剂盒说明书进行 ,主要包括杂交前预
处理 、杂交 、抗地高辛抗体处理胚胎 , NBT-BCIP显
色。 3%琼脂包埋胚胎 ,切片 ,观察切片并照相。
3　结果
3.1　异叶败酱提取物对鸡胎翅芽 MyoD、Myf5基
因表达的影响　实验组植入含药念珠的胚胎右侧翅
芽背侧区域 ,与左侧翅芽和对照组相应区域比较 ,异
叶败酱提取物能明显下调 MyoD(图 1-A、C、E)和
Myf5(图 2-A、C、E)基因的表达 ,但对后者的下调程
度不如前者。对照组胚胎植入 PBS念珠右侧翅芽
背侧区域 Myf5和 MyoD基因的表达强度与其左侧
相应区域相似 ,变化不大 (图 1-H、J;图 2-F、H)。
3.2　异叶败酱提取物对鸡胎翅芽 PCNA基因表达
的影响　PCNA是 DNA复制标志基因 ,在肢芽发育
时期广泛表达 ,笔者检测了 PCNA基因对异叶败酱
提取物处理的敏感性 。结果发现 ,与左侧翅芽和对
照组相应区域比较 ,异叶败酱提取物对 PCNA基因
表达有下调作用 ,而对照组两侧胚胎翅芽 PCNA基
因表达相似 ,变化不大 。具体结果见图 3。
4　讨论
本实验结果表明 ,异叶败酱提取物对鸡胚肢芽
发生中与分化相关的转录因子基因 MyoD、Myf5及
增殖细胞核抗原 PCNA在胚胎肢芽的表达均有下调
作用 ,对 Myf5下调作用强于 MyoD。
发育中的肢芽常被用于脊椎动物胚胎发生和基
因表达调控机制研究的体内模型 ,在发育过程中有
一系列基因的时空特异性和限制性表达。 MyoD和
Myf5均为 bHLH转录因子 ,它们以特殊的方式表达
于发育的体节和肢芽成肌细胞中 ,是肌肉细胞决定
和分化所必需的 , Myf5能够激活 MyoD基因表达 。
肢芽内 Myf5和 MyoD能诱导细胞分化为肌纤
维 〔9〕。
图 1　右侧翅芽植入异叶败酱提取物念珠对 MyoD基因表达的影响
(A～ E为翅芽植入含异叶败酱提取物念珠的实验组胚胎和切片 , F～ J为翅芽植入 PBS念珠的对照组胚胎和切片)
A.胚胎背侧观 , 左侧翅芽 MyoD基因正常表达(白色箭头),植入含药念珠右侧翅芽 MyoD基因表达下调(黑色箭头)　B.左
侧翅芽侧面观 , MyoD基因正常表达于翅芽腹 、背侧　C.右侧翅芽侧面观 , 植入含药念珠翅芽背侧 MyoD基因表达下调　D.
未植入念珠左侧翅芽横切面 , MyoD基因表达正常　E.植入含药念珠右侧翅芽横切面 , MyoD基因表达下调　F.胚胎背侧观 ,
左侧翅芽 MyoD基因正常表达(白色箭头),植入 PBS念珠右侧翅芽 MyoD基因表达无影响(黑色箭头)　G.左侧翅芽侧面观 ,
正常翅芽背侧 MyoD基因表达水平　H.右侧翅芽侧面观 , 植入 PBS念珠对周围基因表达无影响　I.正常左侧翅芽横切面 ,
MyoD基因表达水平　J.植入 PBS念珠右侧翅芽横切面 , MyoD基因表达无影响(A、B、C、F、G、H×1.25;D、E、I、J×5 )
·1765·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 11期 2010年 11月
图 2　右侧翅芽植入异叶败酱提取物念珠对 Myf5基因表达的影响
(A～ D为翅芽植入异叶败酱提取物念珠的实验组胚胎及切片 , E～ H为翅芽植入 PBS念珠的对照组胚胎及切片)
A.未植入念珠的左侧翅芽侧面观 , Myf5正常表达　B.植入含药念珠右侧翅芽侧面观, Myf5基因表达水平下降　C.未植入念珠
左侧翅芽横切面 , Myf5基因正常表达　D.植入含药念珠右侧翅芽横切面 , 念珠周围 Myf5基因表达下调　E.未植入念珠的左侧
翅芽侧面观 , Myf5正常表达　F.植入 PBS念珠右侧翅芽侧面观 , Myf5基因表达未改变　G.未植入念珠的左侧翅芽横切面 , Myf5
表达水平　H.植入 PBS念珠的右侧翅芽横切面 ,念珠周围 Myf5基因表达无影响(A、B×1.25;E、F×4;C、D、G、H×5 )
图 3　右侧翅芽植入异叶败酱提取物念珠对 PCNA基因表达的影响
(A～ E为翅芽植入含异叶败酱提取物念珠的实验组胚胎和切片 , F～ J为翅芽植入 PBS念珠的对照组胚胎和切片)
A.胚胎背侧观 ,左侧翅芽 PCNA基因正常表达(白色箭头),植入含药念珠右侧翅芽 PCNA基因表达下调(黑色箭头)　B.左侧
翅芽侧面观 , PCNA基因正常表达于翅芽腹、背侧　C.右侧翅芽侧面观 , 植入含药念珠翅芽背侧 PCNA基因表达下调　D.未植
入念珠左侧翅芽横切面 , PCNA基因表达正常　E.植入含药念珠右侧翅芽横切面 , PCNA基因表达下调　F.胚胎背侧观 ,左侧翅
芽 PCNA基因正常表达(白色箭头), 植入 PBS念珠右侧翅芽 PCNA基因表达无影响(黑色箭头)　G.左侧翅芽侧面观 , 正常翅
芽背侧 PCNA基因表达水平　H.右侧翅芽侧面观, 植入 PBS念珠对周围基因表达无影响　I.正常左侧翅芽横切面, PCNA基因
表达水平　J.植入 PBS念珠右侧翅芽横切面 , PCNA基因表达无影响(A、B、C、F、G、H×1.25;D、E、I、J×5 )
如果使哺乳动物各类细胞株表达 Myf5或 MyoD,就
能诱导全部的生肌分化过程 〔10〕。 PCNA的合成和
表达与细胞增殖状态密切相关 ,它在增殖细胞周期
中的含量变化与 DNA复制的时相变化均具有明显
·1766· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 11期 2010年 11月
的周期性和一致性 ,是反映细胞增殖的主要生物学
指标 〔11〕。它不仅与细胞增殖密切相关 ,还与癌基因
蛋白 、抑癌基因蛋白及某些细胞周期蛋白有关 ,是反
映多种肿瘤恶性程度及预后的重要指标 〔12〕 ,近年被
广泛用于肿瘤的基础与临床研究。
本实验制备异叶败酱提取物含药念珠 ,植入鸡
胚翅芽 ,观察对在 HH16 ～ 20期胚胎翅芽中央部位
特异性表达基因 MyoD和 Myf5基因及在鸡胚翅芽
发育时期广泛表达的 PCNA基因表达水平的影响。
结果显示:与鸡胚翅芽发生中肌细胞分化相关基因
MyoD、Myf5及增殖细胞核抗原 PCNA表达下调 ,这
说明 ,异叶败酱提取物不仅可以抑制鸡胚翅芽细胞
的定向分化 ,而且能抑制鸡胚翅芽细胞的增殖。鸡
胚肢芽在发育过程中 ,细胞极速增殖 、分化和迁移 ,
与肿瘤细胞的表观特性具有相似性。同时 ,上述异
叶败酱提取物作用于鸡胚翅芽研究结果与文献报道
和笔者的前期报道中异叶败酱提取物作用于肿瘤细
胞的研究结果具有相似性 ,它能抑制肿瘤细胞增
殖〔13〕 ,降低肿瘤细胞 DNA、RNA含量 ,诱导肿瘤细
胞逆向分化[ 14] 。上述结果提示 ,发育的鸡胚翅芽可
以作为中药提取物抗肿瘤药物活性作用检测的体内
模型 ,可用于检验一些中药提取物对肿瘤相关基因
表达模式的调控作用。当然 ,发育的鸡胚翅芽作为
一个中药提取物抗肿瘤药物活性检测的体内模型的
实际意义还需要大量的深入研究。
参 考 文 献
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·1767·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 11期 2010年 11月