全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
脂肪酶催化合成生物柴油的研究进展
王巍杰 杨永强 吴尚卓
(河北理工大学化工与生物技术学院,唐山 063009 )
摘 要: 环保型燃料生物柴油有望解决能源短缺的问题, 脂肪酶催化动植物油脂合成生物柴油的方法具有反应条件温
和、产物易分离和不污染环境等优点。综述了酶催化法在提高脂肪酸酯产率和减少生产成本等方面的研究进展。
关键词: 生物柴油 脂肪酶 酶催化法 全细胞生物催化剂
Research Progress of Biodiesel Production Catalyzed by Lipase
W angW eijie YangYongqiang W u Shangzhuo
(Co llege of ChemicalEngineering and Biotechnology T echno logy, H ebei Poly technic University, Tangshan 063009)
Abstrac:t B iod iesel as env ironm entfriendly fue l can reso lve the prob lem o f energy sho rtag e. The re aremany advantages of b iod ie
sel produc tion cata ly zed by lipase such as m ild reaction conditions and easy separation o f products w ithout po llution to the env ironm ent.
In the paper, enzym ecata lyzed b iod iese l is reviewed from the po int of v iew o f increasing y ield o f fatty ac id ester and reduc ing production
costs.
Key words: B iodiese l L ipase Enzym aticcata lysis techno logy W holece ll biocata lyst
收稿日期: 20091109
作者简介:王巍杰,女,副教授,硕士生导师,主要从事药物分析和工艺研究工作; Em ai:l wangw eijie2000@ yahoo. com. cn
化石燃料日益枯竭, 生物质能的开发利用日益
受到人们的重视。生物柴油是利用动植物油脂和低
碳醇在催化剂的作用下经酯交换反应生成的脂肪酸
酯 [ 1] ,它作为一种环保的可再生燃料在最近十几年
成为研究热点。含硫量低、闪点和十六烷值高使它
可以替代普通柴油而无须对现有发动机做任何改
动,是极具发展前景的新型能源。
生物柴油的合成需要催化剂的参与, 分为酸、碱
和酶催化剂。酸催化法对原料油脂要求较高, 会产
生大量废酸,催化剂难以重复利用;碱催化法要求原
料酸价小于 1、含水量小于 0. 5% ,生产工艺复杂,过
程易发生皂化反应。而酶催化法反应条件温和,对
原料油脂的品质基本无要求,反应产物易分离,应用
前景良好 [ 2 ]。为将酶法制备生物柴油应用到工业
化生产中,研究者对于提高生物柴油产率和降低生
产成本进行了广泛的研究。
1 提高生物柴油产率的几种途径
1. 1 酶的优选和联合催化
在酯交换反应中脂肪酶的选取尤为关键, 不同
的油脂原料往往需要不同的脂肪酶进行催化。Ogn
janov ic等 [ 3]用脂肪酶 Novozym e 435催化向日葵油
合成生物柴油, 酰基受体为甲醇。在反应温度为
45 、3%的酶量和醇油摩尔比 3!1的无水体系下,
脂肪酸酯的产率大于 99%, 但反应时间长达 50 h,
重复利用会使酶的活性大大降低。以乙酸甲酯作为
甲醇的替代物,利用固定床生物反应器得到较好结
果: 8- 10 h脂肪酸甲酯产率为 ( 93. 6 ∀ 3. 75)%。
Matasso li等 [ 4]对比研究了固定化脂肪酶 L ipozyme
RM和 L ipo zyme TL IM催化棕榈油制备生物柴油的
反应,在反应温度 50 、乙醇和油的摩尔比 3!1, 酶
浓度为 3. 0 w %t 的条件下, 分阶段加乙醇, 可得 25
w%t 的脂肪酸酯。比较固定化酶和 KOH、MgO的催
化活性后发现, L ipozyme TL IM 的催化活性最强。
米根霉被广泛应用于发酵工业 [ 5] , 它包含细胞壁上
分子量为 34 kD的 ROL34和细胞膜上分子量为 31
kD的 ROL31两种脂肪酶。胞内甲醇分解作用活性
和细胞膜上的 ROL31脂肪酶含量有很大联系,而细
胞壁 ROL34的高含量却导致胞内出现最低的催化
2010年第 3期 王巍杰等 :脂肪酶催化合成生物柴油的研究进展
活性, 暗示 ROL31和 ROL34对催化活性的影响起
着相反作用 [ 6]。
具有不同催化活性的酶在联合使用中通常能提
高整体催化效率,机理可能是由于产生了催化互补
效应, Lee[ 7 ]用固定的米根霉和玫瑰假丝酵母脂肪酶
作为联合催化剂催化植物油脂,二者最佳混合比为
3!1,反应过程中每隔 1. 5 h分段流加甲醇, 4 h后生
物柴油的转化率可达 98% ,最适的反应温度和搅拌
速度为 45 和 300 r/m in。联合催化剂经过滤、水和
异丙醇的洗涤后用于下一次循环, 重复利用 5- 10
次后生物柴油转化率仍可达 80%。若用脂肪酶 N o
vozym 435和 Lipozyme TL IM 联合催化猪油制备生
物柴油,最佳反应条件为: 有机溶剂叔丁醇和油的体
积比为 0. 55,醇油摩尔比为 5. 12,反应 20 h后可得
97. 6%的脂肪酸酯产率。脂肪酶用有机溶剂洗涤后
能反复使用, 20次循环后联合脂肪酶的活性仍不
降低 [ 8]。
1. 2 酶的预处理
酯交换反应前若对酶做适当的预处理, 能够提
高脂肪酸酯的产率。 Samukaw a等 [ 9]研究了预处理
对固定化南极假丝酵母脂肪酶 Novo zym 435催化活
性的影响。发现酶在油酸甲酯中浸泡 0. 5 h,再浸泡
于大豆油 12m in后, 甲醇分解作用大大提高。最佳
方法是预处理脂肪酶后在 3. 5 h内每隔 0. 25 -
0. 4 h加入 0. 33mo l甲醇。超声波可以显著提高多
类化学反应的速率, 预照射洋葱假单胞菌产生的脂
肪酶后可减轻酶的钝化, 在水和有机溶剂体系下能
提高酶的活性。试验证明, 以麻疯树油作为油脂原
料,超声波对脂肪酶预处理 5 m in后使酯交换过程
维持在 40 ∀ 1 ,最后产率为 79% ,而不用超声波预
处理的仅为 34%。研究发现预照射对酶的二级结
构基本无影响,但小部分氨基酸基团有所变化,扫描
电子显微镜分析显示酶的高级结构有所改变, 表明
超声波预处理提高酶活性的机制是改变了酶的分子
结构 [ 10]。
1. 3 提高酶稳定性及优化反应条件
工业化生产需要酶的循环利用, 要求催化酶具
有良好的稳定性。Rodrigues等 [ 11]考虑多种因素对
固定化脂肪酶 Lipozym e TL IM稳定性的影响, 在反
应温度 26 , 乙醇、大豆油摩尔比 7. 5!1, 25%酶浓
度条件下加入占油量 4%的水,反应 12 h后脂肪酸
酯产率达 69%。用正己烷等不同有机溶剂洗涤, 七
次循环利用后,酶的活性可保持在 80%左右。
反应条件也是影响脂肪酸酯产率的重要因素。
Lee等 [ 12]综合考虑多种参数, 20%的南极假丝酵母
脂肪酶 B在 45 、压力 130 Bar,搅拌速率 200 r/m in
的含水条件下催化橄榄油, 可得高酯产率。进一步
研究发现, 脂肪酶 B只有在分阶段流加甲醇的条件
下才会表现出良好的酶活性, 在反应过程中每隔
1. 5 h加入 60 mmo l的甲醇, 6 h后脂肪酸甲酯的产
率可达 98. 92%, 8次循环使用后,产率仍可保持在
85%左右。
1. 4 消除甲醇等对酶的毒害
未溶解于油脂中的甲醇会在反应体系中形成微
粒, 与酶接触便引起酶的失活。动力学研究发现,醇
对酶的抑制为竞争性抑制, 不同的衬底浓度对醇抑
制酶活性强弱有很大影响 [ 13] , 甲醇、甘油等对酶的
毒害严重制约着酶法催化合成生物柴油的应用。
Kumari等 [ 14]首次利用产气肠杆菌中的脂肪酶
催化麻疯树油合成生物柴油。研究发现有机溶剂叔
丁醇可增加低碳醇与油脂的混溶性, 大大减少甲醇
及甘油对酶的毒害作用, 体系中叔丁醇和油的体积
比为 0. 8!1,每克油加 50 U的固定化脂肪酶, 醇油
摩尔比 4!1, 反应温度控制在 55 , 生物柴油最大产
率可达 94%, 7次合成后酶的活性没有明显丧失。
此外, Yang等 [ 15 ]发现一种发光细菌中的脂肪酶
M37可抵抗甲醇对其的毒害, 即便甲醇浓度达到
10% ,脂肪酶也可在 48 h内维持较高活性。M37和
脂肪酶 Novozym 435的比较试验结果表明,甲醇分 3
次均匀加入反应体系中, 二者催化生产的脂肪酸甲
酯得率接近; 甲醇一次加入反应体系, Novozym 435
几乎没有催化活性,而 M37可使脂肪酸甲酯产率达
到 70%。
2 降低酶法的生成成本
酶法制备生物柴油的成本要高于酸、碱催化法,
主要是酶制品的成本较高, 可利用全细胞生物催化
剂、廉价的脂肪酶固定载体或提高产物分离效率等
措施减少成本 [ 16]。
2. 1 全细胞生物催化剂的应用
全细胞生物催化剂省去了极耗成本的纯化阶
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
段,生产流程更为简便、经济。 Jin等 [ 17]将其用于催
化酯交换反应,考察因素为反应温度、醇量、原料油
脂种类,反应在含水体系中进行。发现全细胞酶催
化以废弃植物油脂为原料油的产率最高达 80% ,证
明了该酶在酯交换反应中的可利用性。Hama等 [ 18]
首次报道利用重组真菌全细胞酶法合成生物柴油。
将异孢镰刀菌中的异种脂肪酶编码基因重组到米曲
霉上,形成重组异孢镰刀菌脂肪酶 ( FHL) ,得到的米
曲霉作为全细胞酶催化脂肪酸酯的合成。添加 5%
的水可有效抑制甲醇对酶的毒害并利于酰基转化反
应,脂肪酸甲酯产率达到 94%, 可重复使用 10次。
对比试验表明,重组米曲霉较米根霉稳定性高,催化
活性强,这种重组真菌全细胞催化剂有望应用于生
物柴油的工业化生产中。
2. 2 廉价固定载体的应用
非均相催化剂更易于分离, 可减少反应过程中
的不确定因素,固定化酶的广泛应用已成必然趋势,
能否找到既廉价又合适的固定载体便成为固定脂肪
酶的关键问题。D izge等 [ 19]利用产自嗜热真菌的脂
肪酶催化不同植物油脂合成脂肪酸甲酯。脂肪酶固
定于一种廉价的新型微孔聚合物 MPPM 上, 考查在
反应温度 25 的条件下对向日葵油、大豆油和餐饮
废油酯交换反应的作用,酶在 10次重复反应后仍保
持较高活性。也可将该酶以共价结合的方式固定于
一种疏水微孔苯乙烯二乙烯基苯共聚物 STYDVB
上,此固定酶可保存 30 d, 重复应用 15次而活性不
降低 [ 20]。Y ing等 [ 21 ]设计出一种磁元件生物催化剂
MCB,将枯草芽孢杆菌细胞固定于网状的疏水磁性
微球体上,脂肪酶结合在微球体表面,用其催化餐饮
业废油,无溶剂体系中分段流加甲醇,脂肪酸酯产量
达到 90% ,该酶可通过磁分离回收循环利用, 具有
环保和不用纯化等优点。
2. 3 副产物的合理处理
酯交换反应的主要副产物是甘油,但很难进行
分离和回收, 可用甘油为原料发酵生产 1, 3丙二
醇 [ 22] ,有报道 [ 23]利用酪酸梭菌细胞和氢转移催化
废弃甘油转变为仲胺, 在节省成本的同时还能得到
额外利润。对于酯交换反应中未酯化的植物油,可
利用偏最小二乘法等确定其含量, 并能与脂肪酸酯
分离。麻疯树可提供丰富的油脂原料, 已广泛应用
到生物柴油的制备中。但很多脱油后的麻风树种子
残渣有毒, 虽营养丰富, 但难以充分利用。 Sudheer
等 [ 24]利用分子标记分析出在混合树种群中有毒和
无毒的麻疯树性质的差异, 利用随机扩增多态性
DNA ( RAPD ) 和扩增片段长度多态性 ( AFLP)技术,
识别到二者的性质差异, 对于树种的筛选和改良都
有很好的指导意义。
3 展望
酶法的大规模应用需要寻找性能良好的酶, 可
用微生物培养筛选不同的菌株以获得更好的脂肪
酶,也可利用基因工程改良酶的基因 [ 25]。酶法制备
生物柴油具有环保、反应条件温和以及废弃产物易
被生物降解等酸碱催化法不具有的优点,相信随着
相关分子生物技术的发展,可以设计或找到廉价、耐
醇又具高催化活性的脂肪酶, 将其广泛应用到生物
柴油的工业化生产中。
参 考 文 献
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