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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
cDNA
SCOT基因差异表达两种电泳方法的比较研究
陈香玲 1, 2, 3  李杨瑞1, 2, 3  杨丽涛 1  吴建明 1, 4  熊发前2  罗聪1
( 1广西大学农学院 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁 530004; 2广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,南宁 530007;
3中国农业科学院甘蔗研究中心,南宁 530007; 4广西农业科学院经济作物研究所,南宁 530007 )
  摘  要:  应用 cDNA
SCOT研究了低温胁迫下不同抗寒性甘蔗品种的基因差异表达, 比较了两种 PCR产物电泳方法。
结果表明, 采用琼脂糖凝胶电泳成本较低, 操作简单,省时, 其凝胶图像条带亮白, 背景为黑色, 主带明显 ,副带较模糊; 采用聚
丙烯酰胺凝胶电泳成本较高, 操作复杂, 耗时,其凝胶电泳图像条带呈黑褐色,背景为浅黄色, 主带和弱带清晰易读, 但部分引
物泳道背景深, 影响差异基因鉴别效果。根据两种电泳方法的优缺点, 提出应用 cDNA
SCOT进行基因差异表达研究时的相关
建议。
关键词:  cDNA
SCOT 基因差异表达  电泳方法  甘蔗
Comparison of Two ElectrophoresisM ethods in cDNA
SCOT
Gene D ifferential Expression
Chen X iangling
1, 2, 3  L iYangrui1, 2, 3  Yang L itao1  Wu Jianm ing1, 4  X iong Faqian2  Luo Cong1
(
1
Guangx iK ey Laboratory of SubtropicalB ioresources Conservation and Utilization /Agricultural Co llege, Guangx i University, Nanning 530004;
2
Guangx iCrop G enetic Imp rovement and Biotechno logy Lab, Nanning 530007;
3
Sugarcane Research Center, Chinese A cademy of Agricultural
Sciences, Nanning 530007;
4
Cash Crop sR esearch Institute, Guangx iA cademy of Agricultural Sciences,Nanning 530007)
  Abstrac:t  cDNA
SCOT approach w as em ployed to identify the genes differential expression in sugarcane correlated w ith d ifferent
co ld
resistance under low temperatu re stress. Two electropho res is m ethods w ere compared in th is paper. The result show ed that aga rose
ge l e lectrophoresism e thod w as sim pler, mo re econom ic, w ith c lear wh ite m a in band and less
c lear secondary bands on b lack back

g round. Polyacry lam ide gel e lectropho resis m ethod m ade it easy to d istingu ish the b lack bands of PCR am plification from ye llow back

g round, but som e pr im ers lanes w ere too dark. According to the ir advantages and disadvantages, som e suggestions w ere m ade fo r us ing
cDNA
SCOT to study genes d ifferentia l expression.
Key words:  cDNA
SCOT Genes differential expression E lectrophoresis m ethods Sugarcane
收稿日期: 2010
03
26
基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2008BADB8B00) ,广西科技攻关项目 (桂科能 0815011 ),现代农业产业技术体系建设专项资金 ( nycytx
024

01
15)
作者简介:陈香玲,女,博士研究生,研究方向:植物生理生化和生物技术; E
m ai:l gxcxl2008@ 163. com
通讯作者:李杨瑞, E
m ai:l liyr@ gxaas. net
SCOT分子标记是一种基于翻译起始位点的目
的基因标记新技术 [ 1]。 SCOT分子标记在水稻、花
生、龙眼 (待发表 )、芒果 (待发表 )遗传多样性分析
上得到较好结果 [ 2]。我们也已经把 cDNA
SCOT运
用到分析赤霉素诱导甘蔗节间伸长相关基因差异表
达 [ 3]和低温胁迫下不同抗寒性甘蔗品种的基因差
异表达上, 均得到较好结果。目前 SCOT分子标记
和 cDNA
SCOT差异显示技术的应用均只采用琼脂
糖凝胶电泳分离差异基因, 而众所周知的目前研究
植物基因差异表达的方法中, 大多都需要变性 (如
cDNA
AFLP) [ 4, 5]或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (如
cDNA
SRAP) [ 6, 7]进行差异基因的分离检测。改用
聚丙烯酰胺凝胶进行 cDNA
SCOT差异基因的分离
是否更理想未见有报道。本研究在两种电泳方法进
行比较研究的基础上,总结了它们各自的特点,旨在
为应用 cDNA
SCOT进行差异显示研究时提供参考。
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
1 材料与方法
1. 1 材料
本研究选用 2个甘蔗品种即桂糖 28号 (抗寒性
强 )和新台糖 22号 (抗寒性弱 ) ,由广西甘蔗研究所
提供。采用人工气候箱对甘蔗幼苗进行低温处理
( 5 , 72 h) ,每隔 24 h取处理和对照 (室温培养 )叶
样 1次,采样部位为正 1 - 2叶,采下叶片立即放入
液氮中, - 80 保存备用。
1. 2 总 RNA抽提、纯化及 RNA混合池构建
液氮研磨后, 利用总 RNA抽提 Trizo l试剂盒
(上海生工 ) , 提取甘蔗总 RNA。总 RNA中的痕量
DNA用 DN ase ( TaKaRa, 大连 )处理纯化, 后用无
RN ase的 ddH2O溶解总 RNA。用 1%的琼脂糖凝胶
电泳检测 RNA质量,用分光光度计检测 RNA含量,
取等量的各时段叶样的 RNA 混合, 构建相应的
RNA混合池, - 80 分装保存备用。
1. 3 第一链 cDNA的合成
采用 M
MLV ( RN ase H
)逆转录酶 ( TaKaR a,大
连 ) ,并按照其说明合成第一链 cDNA。反转录引物
为 O ligo( dT) 18 ( Inv itrogen,上海 )。第一链合成反应
体系: 6
L 无 RNase的 ddH 2O, 5
L 5 !第一链
Buffer, 4
L RNA, 2
L O ligo ( dT), 1
L dNTP, 1
L
RN asin, 1
mol/L M LV RTase均匀搅拌, 70 恒温
10 m in, 冰上放置 2 m in , 42 恒温 60 m in。于
- 20 保存备用。
1. 4 第一链 cDNA的 SCOT扩增
PCR反应体系为 10 ! buffer 2. 0
L, 1. 5 mmol /L
M gC l2, P rimer 5 nmo l/L, dNTP 2 nmo l/ L, Taq DNA
聚合酶 0. 5 U, 第一链 cDNA稀释产物 1
L,加水至
20
L。根据 Co llard and M ackil设计引物 [ 1] , 以
ATG为翻译起始位点, 侧翼区域保守性, 即以 ATG
中的 A为下游 + 1位置, + 4位置必须是 G, + 7位
置必须是 A, + 8、+ 9位置必须是 C,引物长度为 18
bp, G + C含量在 50% - 72%之间, 无兼并碱基、引
物二聚体和发夹结构形成, 引物由上海生工合成。
反应程序为 94 预变性 3 m in; 94 变性 1 m in,
50 退火 1m in, 72 延伸 2 m in, 共 35个循环; 72
最后延伸 5m in。
1. 5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测
按 1. 5%的比例制备琼脂糖凝胶,并按 0. 01%的
比例加入 EB替代染料,煮沸溶解后充分摇匀,倒入
制胶板槽,冷却凝固。取 6
L的 PCR反应产物与
2
L的 load ing buffer充分混匀后上样,以 120mA恒
流,电泳 50m in。电泳结束后, 立即放入凝胶成像仪
进行扫描拍照。
1. 6 PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
将玻璃板洗净后, 装槽夹好,用琼脂液封底。配
制 6%非变性聚丙烯酰胺溶液灌胶制胶, 配方如下:
40%丙烯酰胺 3mL, 5 !TBE 4 mL,去离子水 14mL,
10% APS 140
L, TEMED 10
L。灌胶约 40m in后,
以恒定功率 50W,电泳 1. 5 h。
电泳结束后, 进行染色:取出凝胶,用去离子水
洗两次, 转入 1% AgNO 3溶液, 染色 10 m in, 再用去
离子水洗 2次, 倒入显影液 ( 1 L中含 15 g N aOH,
0. 2 g四硼酸钠, 4 mL甲醛 )中,显色适度后, 转入去
离子水中,取出凝胶后进行扫描拍照。
2 结果与比较
2. 1 两种电泳检测方法效率和成本的比较
两种电泳方法原理不同,操作过程也相差很大。
琼脂糖凝胶电泳操作简单,步骤少, 用时短, 易于上
手; 而聚丙烯酰胺凝胶电泳程序多, 操作复杂, 制胶
和电泳都更耗时, 技术较难掌握。琼脂糖凝胶电泳
比聚丙烯酰胺凝胶电泳约节省 60 m in,因此效率较
高。在成本上,聚丙烯酰胺凝胶电泳需要更多制胶、
染色和显影等步骤用的药品,因此,琼脂糖凝胶电泳
的成本较低。
2. 2 电泳检测效果的比较
从图 1和图 2可以看出, 选用不同的 SCOT引
物进行扩增,会得到三种完全不同类型的 cDNA条
带, 第一种是单一条带型 (图 1和图 2中的 S5), 第
二种是多条带型 (图 1和图 2中的 S3、S4和 S6), 第
三种是中间带数型 (图 1和图 2中的 S1和 S2)。在
图 1琼脂糖凝胶电泳中, cDNA条带亮白, 背景为黑
色,可以看到主带明显, 副带较模糊,但均与图 2聚
丙烯酰胺凝胶电泳中的 cDNA条带一一对应。在图
2聚丙烯酰胺凝胶电泳中, cDNA条带呈黑褐色, 背
景为浅黄色,主带和弱带清晰易读,受单引物随机扩
增的影响,常出现多条带紧密排列的情况 (图 2中
S4) ,且比琼脂糖凝胶电泳清晰,但是在多条带引物
类型中,也会出现深色泳道, 影响 cDNA条带的观察
94
2010年第 10期    陈香玲等: cDNA
SCOT基因差异表达两种电泳方法的比较研究
(图 2中的 S6)。
S1- S6分别表示 scot引物 1、scot引物 2、scot引物 3、
scot引物 4、scot引物 5、scot引物 6; 1. 桂糖 28号 (低温
处理 ) ; 2.桂糖 28号 (对照 ) ; 3.新台糖 22号 (低温处
理 ) ; 4.新台糖 22号 (对照 )
图 1 用琼脂糖凝胶电泳检测 cDNA
SCOT
扩增产物的电泳效果
S1- S6分别表示 scot引物 1、scot引物 2、scot引物 3、
scot引物 4、scot引物 5、scot引物 6; 1. 桂糖 28号 (低温
处理 ) ; 2.桂糖 28号 (对照 ) ; 3.新台糖 22号 (低温处
理 ) ; 4.新台糖 22号 (对照 )
图 2 用 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 cDNA
SCOT
扩增产物的电泳效果
3 小结与讨论
两相比较,从成本和效率上看,琼脂糖凝胶电泳
成本较低,操作简单, 步骤少,用时短, 易于上手;而
聚丙烯酰胺凝胶电泳成本较高, 程序多, 操作复杂,
耗时, 技术较难掌握。从两者之间的染色差异上看,
聚丙烯酰胺凝胶电泳中, cDNA条带呈黑褐色, 背景
为浅黄色,主带和弱带清晰易读,琼脂糖凝胶条带亮
白,背景为黑色, 主带明显,副带较模糊。
综合两种电泳方法的优缺点,我们认为在应用
cDNA
SCOT进行差异显示研究时,可以首先考虑用
琼脂糖凝胶电泳。在用琼脂糖凝胶电泳检测时, 如
果能在主带上找到明显的目的差异基因时, 可直接
进行下一步回收和鉴定, 这样可以较大地缩短研究
的进程。但是,当发现琼脂糖凝胶电泳读带差异较
少时,可挑选表现为多条带型的引物扩增产物,改用
非变性聚丙烯酰胺凝胶 (如 SRAP分子标记 )进行电
泳, 从而获得更明确清晰的差异基因;当在非变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳上仍未能分离差异基因, 且出现
cDNA条带重叠或过密排列,影响回收和鉴定时, 可
选此类引物扩增产物改用变性聚丙烯酰胺凝胶 (如
AFLP分子标记 )进行电泳, 直到获得稳定清晰的目
的基因。
参 考 文 献
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