全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 1119−1126 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由广西自然科学基金重点项目(2012GXNSFDA053011), 广西壮族自治区主席科技资金项目(11166-02), 科技部国际合作项目
(2008DFA30600, 2009DFA30820 和 2013DFA31600), 广西自然科学基金创新团队项目(2011GXNSFF018002), 广西农业科学院创新团
队项目(桂农科 2011YT01), 广西自然科学基金重点项目(2012GXNSFDA053), 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科产 1123008-1
和桂科能 0815011)资助。
*通讯作者(Corresponding authors): 杨丽涛, E-mail: liyr@gxu.edu.cn, Tel: 0771-3236407; 李杨瑞, E-mail: liyr@gxaas.net, Tel: 0771-3247689
第一作者联系方式: E-mail: cmh_abc@126.com
Received(收稿日期): 2012-11-12; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1050.018.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01119
宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的 cDNA-SCoT分析
陈明辉 1 张保青 1 宋修鹏 1 陈 虎 3 杨丽涛 1,2,* 李杨瑞 1,2,* 陈保善 1
1 广西大学 / 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁 530005; 2中国农业科学院甘蔗研究中心 / 广西农业科学院
甘蔗研究所 / 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 / 农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良重
点实验室, 广西南宁 530007; 3广西林业科学院, 广西南宁 530002
摘 要: 宿根矮化病是危害严重的世界性甘蔗主要病害之一, 为了探究甘蔗在该病胁迫下的抗病分子机制, 本研究
以甘蔗品种新台糖22健康植株为材料, 利用含有宿根矮化病病原菌的蔗汁诱导其抗性, 分别在接种后 2、4、6、8和
10 d 取样, 构建宿根矮化病侵染处理与对照的 RNA 混合池, 利用 cDNA-SCoT 法进行差异显示研究。结果表明, 80
条 SCoT引物扩增出 500多条带, 长度在 100~1800 bp之间。从中筛选出 30个差异明显的条带, 测序后序列拼接, 获
得 22条高质量的 EST序列。生物信息学分析显示, 对甘蔗宿根矮化病的差异基因主要涉及能量代谢、防卫反应、信
号转导、蛋白质类代谢等方面。进一步基因功能分析显示, 油菜素内酯合成蛋白、NBS-LRR类抗性蛋白、茉莉酸诱
导蛋白、α-微管蛋白、ABA胁迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻译起始因子 eif-2b α亚族等可能参与了甘蔗宿根矮
化病病原菌互作的过程。
关键词: 甘蔗; 宿根矮化病; cDNA-SCoT; 差异基因
cDNA-SCoT Analysis of Differentially Expressed Genes in Sugarcane Induced
by Leifsonia xyli subsp. xyli
CHEN Ming-Hui 1, ZHANG Bao-Qing 1, SONG Xiu-Peng1, CHEN Hu3, YANG Li-Tao1,2,*, LI Yang-Rui1,2,*,
and CHEN Bao-Shan 1
1 Guangxi University / State Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization, Nanning 530005, China; 2 Sugarcane Re-
search Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Guangxi Crop
Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of
Agriculture / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Nanning 530007, China; 3 Guangxi Forestry Research Institute, Nanning
530002, China
Abstract: Ratoon stunting disease (RSD) is one of the major diseases, which is harmful to sugarcane in the world. To investigate
the molecular mechanism of gene differential expression in sugarcane under ratoon stunting disease stress, we inoculated the stem
of sugarcane variety ROC22 with cane juice with RSD pathogen Leifsonia xyli subsp. xyli to induce resistance, then took stem
samples at 2, 4, 6, 8, and 10 days, respectively, after inoculation, and established different cDNA mixture pools transcribed from
the stem RNA mixture pools of RSD treatment and control for cDNA-SCoT analysis to detect the gene differential expressions.
More than 500 bands with length of 100–1800 bp were obtained using 80 SCoT primers. A total of 30 differentially expressed
EST sequences were screened out, and 22 non-redundant ESTs with high quality were obtained by cluster analyses of the ESTs
sequencing. The results of BlastN showed that the differentially expressed genes of ROC22 mainly related to energy metabolism,
disease defense, signal transduction, and protein metabolism. Further analysis of gene function indicated that brassinosteroid bio-
synthesis-like proteins, NBS-LRR type disease resistance protein, jasmonic acid induced protein, α-tubulin, abscisic stress ripen-
1120 作 物 学 报 第 39卷

ing protein, proline-rich protein, and translation initiation factor eif-2b α subunit may be involved in the process of the incompati-
ble interaction between plants and Leifsonia xyli subsp. xyli.
Keywords: Sugarcane; Ratoon stunting disease; cDNA-SCoT; Differential genes
甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease, RSD)是由
Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)所引起的一种甘蔗重要细菌
性病害[1]。该病于 1944 年在澳大利亚昆士兰州甘蔗品种
Q28 上首次发现[2], 我国大陆于 1986 年首次报道此病害
的发生[3]。该菌体呈直或微弯的细长棒状, 有的中部或一
端膨大 , 是一种寄居维管束木质部的较难培养的棒状杆
菌属细菌[4-5]。宿根矮化病病菌侵染后, 感病蔗株一般表
现植株矮化、分蘖少、生长迟滞, 且蔗株矮化会随宿根年
限延长而加重, 严重影响甘蔗的产量[6]。目前对宿根矮化
病侵染甘蔗的研究主要集中于细菌培养 [7]、传播与防
治[8]、检测技术[9]等方面, 而对其分子机制研究在国内外
未见报道。
目标起始密码子多态性 (start codon targeted poly-
morphism, SCoT)分子标记是 Collard和 Mackill [10]开发的
一种目的基因分子标记技术, 是根据植物基因中 ATG 翻
译起始位点侧翼序列的保守性, 设计引物对基因组扩增。
该分子标记技术具有引物设计简单, 成本低廉, 重复性好,
能产生与性状相关联的标记等特点。目前 SCoT标记技术
已被成功应用于花生[11]、龙眼[12]、芒果[13]等植物, 2010
年, 杨翠[14]采用 20条 18 碱基的 SCoT 引物, 对 107份甘
蔗无性系进行 SCoT标记, 获得了这些甘蔗无性系的遗传
多样性信息; 陈香玲等[15]利用 120条 SCoT引物对低温胁
迫下甘蔗进行扩增, 得到了 7 条差异片段; 吴建明等[16]
用 200 mg L–1 浓度的赤霉素处理甘蔗叶片, 通过 46 条
SCoT 引物扩增出差异片段 30 条, 有 18 条基因片段受赤
霉素上调而 12 条基因片段下调。但尚未见有 SCoT 标记
技术在甘蔗与病害互作上的研究报道。本试验利用含 RSD
病原菌的蔗汁侵染甘蔗作为处理而以不含 RSD 病原菌的
蔗汁处理的同龄植株作为对照。利用 RNA混合池反转录
成 cDNA 第一链混合池, 以 cDNA 第一链进行 cDNA-
SCoT 差异研究, 获得与甘蔗抗 RSD 表达相关的基因信息,
为探索宿根矮化病胁迫下甘蔗基因表达的分子机制和甘
蔗抗病育种提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与 RSD病原菌接种
试验于2011—2012年在亚热带农业生物资源保护与
利用国家重点实验室进行。甘蔗品种新台糖22健康种苗由
广西农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中
心组织培养中心提供。选取8~10片真叶时长势一致的健康
植株40株, 于茎基部人工接种含RSD病原菌的蔗汁, 以不
含RSD病原菌的蔗汁处理的同龄植株作为对照。分别在接
种后第2、第4、第6、第8和第10天取植株基部茎节, 液氮
速冻后于–70℃保存备用。
1.2 RSD病原菌感染确认
参照应雄美等 [17]方法提取DNA, 通过PCR扩增来确
认RSD病原菌的存在。扩增所用的引物序列为F: 5-CC
GAAGTGAGCAGATTGACC-3和 R: 5-ACCCTGTGTTG
TTTTCAACG-3 [18]。PCR扩增在Biometra Tprofessional
PCR仪上进行。反应体系含50 ng模板DNA、上下游引物
各1 μL、12.5 μL高保真2×Goldstar Taq Master Mix, 补充
DEPC处理水至25 μL。PCR扩增程序为95℃预变性10 min;
95℃变性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循环40次;
72℃延伸5 min。反应结束后加4 μL溴酚蓝混匀, 取6 μL扩
增产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳, 电极缓冲液为1×TAE,
染色后显色拍照。
1.3 RNA提取及逆转录
利用TRIzol试剂提取甘蔗茎的总RNA, 1.0%的琼脂糖
凝胶电泳检测RNA完整性, 紫外分光光度计检测RNA纯
度和浓度。取等量的各时段茎样的总RNA混合, 构建相应
的RNA混合池, 参照M-MLV逆转录酶试剂盒操作说明书,
以混合池RNA为模板反转录合成第一链cDNA, 去离子水
稀释10倍, –20℃贮存备用。
1.4 cDNA-SCoT扩增及 PCR检测
按照Collard和Mackil[10]、Luo等[19]方法设计引物。根
据ATG翻译起始位点侧翼区域保守性, 即以ATG中的A为
下游+1位置, +4位置必须是G, +7位置必须是A, +8、+9位
置必须是C, 引物长度为18 bp, 引物由生工生物工程(上
海)股份有限公司合成。用SCoT分子标记引物为上游引物,
3端锚定引物 (3-GGCCACGCGTCGACTAGTAC)为下游
引物, 以处理和对照样品的混合第一链cDNA为模板进行
PCR扩增。cDNA-SCoT PCR扩增体系含高保真2×Goldstar
Taq Master Mix 12.5 μL, 10 μmol L–1上下游引物各1 μL,
cDNA模 板 为 1 μL, 补 充 DEPC处 理 水 至 25 μL。
cDNA-SCoT PCR扩增程序为95℃预变性10 min; 95℃变
性30 s, N℃退火1 min (N℃=SCoT引物Tm值减7℃), 72℃
延伸2 min, 共38个循环; 再72℃延伸8 min, cDNA-SCoT
PCR扩增实验重复3次。PCR扩增完成后用1.5%的琼脂糖
凝胶电泳检测。
1.5 差异片段的回收、克隆、测序与分析
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后 , 选择处理和对照样
品扩增条带中介于100~1800 bp、表达存在差异的条带, 利
用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。用 TaKaRa的
pMD18-T载体连接目的片段, 转化大肠杆菌DH5α感受态
菌株, 进行蓝白斑筛选。通过菌液PCR技术鉴定阳性菌液,
送阳性菌液到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。用
BioXM2.6软件对测序获得序列拼接整理 提交NCBI的
第 6期 陈明辉等: 宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的 cDNA-SCoT分析 1121


Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 搜索引擎进行同
源性检索 , 利用Amigo网站 (http://amigo.Geneontology.
org/cgi-bin/amigo/go.cgi)进行功能注释分析。
2 结果与分析
2.1 RSD病原菌的检测
提取宿根矮化病菌侵染前后甘蔗植株的 DNA, PCR
扩增宿根矮化病菌侵染后植株得到目的片段 , 而宿根矮
化病菌侵染前植株无此片段(图 1)。将目的片段回收纯化
后连接到 pMD18-T 载体上, 并转化大肠杆菌, 对菌落进
行 PCR 扩增, 确认为阳性克隆后进行双向测序, 所得序
列长度为 438 bp, 与 NCBI上公布的 RSD病原菌 rDNA的
ITS相应区段的序列 AF034641 (澳大利亚)、AE016822 (巴
西)完全匹配, 确认甘蔗感染了 RSD病原菌。


图 1 对甘蔗品种 ROC22健康茎秆和感染茎秆的 PCR检测
Fig. 1 PCR detection for healthy and infected stems of
sugarcane variety ROC22
M: DL 2000 marker; CK+: 阳性对照; CK–: 阴性对照; 2、4、6、8
和 10 d: 接种宿根矮化病病原菌后检测时间; CK2、CK4、CK6、
CK8和 CK10: 同期对照。
M: DL 2000 marker; CK+: positive control; CK–: negative control; 2,
4, 6, 8, and 10 days: sampling time after infection; CK2, CK4, CK6,
CK8, and CK10: controls at the time corresponding with sampling.

2.2 RNA的提取和逆转录
从图2可以看, 总RNA经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,
RNA的带型完整, 亮度清晰, 说明RNA质量较好。经紫外
分光光度计检测, RNA样品的OD260/OD280值在1.80~2.00
之间, 说明所提取的RNA纯度较高。从图3可以看出, 总
RNA逆转录后的产物弥散带分布均匀, 质量较好。说明提
取的总RNA和逆转录产物都符合试验要求。


图 2 甘蔗茎总 RNA的电泳图谱
Fig. 2 Eelectrophoretogram of total RNA from sugarcane stem
1: 对照总 RNA; 2: RSD处理总 RNA。
1: total RNA in control; 2: total RNA in RSD treatment.


图 3 逆转录产物 cDNA电泳图谱
Fig. 3 Eelectrophoretogram of reverse transcription products
cDNA
M: DL 2000 marker; 1: 对照 cDNA; 2: RSD处理 cDNA。
M: DL 2000 marker; 1: cDNA in control; 2: cDNA in RSD
treatment.

2.3 甘蔗被 RSD 侵染后差异表达基因的 cDNA-SCoT
分析
用80条SCoT引物对对照和RSD处理2个cDNA混合池
进行扩增, 获得长度在100~1800 bp之间的条带500多条,
其中重复稳定出现的差异条带有30条(图4, 部分SCoT引
物扩增图)。对重复扩增稳定表现的相同差异片段30条送
北京华大公司测序, 测出的序列经DNAMAN软件去除载
体冗余序列及接头序列后, 共获得25条有效EST序列。进
一步将25条EST序列的核甘酸序列提交到NCBI的Blast程
序作同源性比对分析, 根据E值确定其同源序列基因的功
能。去掉功能重复的3条EST序列后, 获得22条唯一功能的
EST序列, 其中可预测功能的有16条, 未知功能EST序列6
条(表1)。按照Bevan等[20]的植物基因功能分类标准, 与已
知功能的基因比对显示, 抗病相关基因最多, 包括油菜素
内酯合成蛋白、NBS-LRR类抗性蛋白、茉莉酸诱导蛋白、
半胱氨酸蛋白、酮脂酰辅酶A合成酶等。在22条EST中, 抗
病相关基因出现频率最高, 达7次, 免疫应答基因出现2次,
转运相关蛋白出现1次。这说明甘蔗在受到宿根矮化病病
原菌侵染后, 植物体内抗病免疫程序启动系列应答反应,
在基因上表现mRNA应答的多样性 , 同时也表明甘蔗对
宿根矮化病的抗病机制是一个由多基因协同调控的复杂
过程。如图5所示 , 涉及防卫反应的EST共4个 , 编号为
SCoT10、SCoT24、SCoT37和SCoT68; 涉及能量代谢相关
基因有3个, 编号为SCoT1、SCoT29和SCoT31; 涉及信号
转导相关基因有2个 , 编号为SCoT19和SCoT22; 免疫应
答基因出现2次, 编号为SCoT7和SCoT27; 涉及蛋白质代
谢类的EST共5个 , 编号为SCoT5、SCoT48、SCoT57、
SCoT59和SCoT76, 占差异表达基因的22.7%。另外, 编号
为CoT3、SCoT4、SCoT21、SCoT34、SCoT49和SCoT72
的6个EST功能未知。




表1 差异表达基因与GenBank中已知基因的同源性比较
Table 1 Comparison of homology between differential expression genes and the documented genes in GenBank
引物 ID
Primer ID
引物序列
Primer sequence (5–3)
长度
Length (bp)
同源序列基因
Homologous gene
基因序列号
Accession number
功能分类
Function category
E-值
E-value
SCoT1 CAACAATGGCTACCACCA 533 3-ketoacyl-COA-synthase XM003558615.1 Energy metabolism 1.00E–55
SCoT3 CAACAATGGCTACCACCG 1264 Hypothtical protein XM002453818.1 Unknown Function 0
SCoT4 CAACAATGGCTACCACCT 1214 Zea may full-length cDNA clone ZM_BFc0102G24 mRNA BT067619.1 Unknown Function 0
SCoT5 CAACAATGGCTACCACGA 1045 Cystein proteinase inhibitor EU965568.1 Protein metabolism 5.00E–137
SCoT7 CAACAATGGCTACCACGG 517 Beta-4 tubulin (tub4) L10635.1 Immune response 2.00E–179
SCoT10 CAACAATGGCTACCAGCC 1085 Nucleobase-ascorbate transporter XM003569812.1 Defense response 2.00E–108
SCoT19 ACCATGGCTACCACCGGC 566 Brassinosteroid biosynthesis-like protein NM001112090.1 Signal transduction 3.00E–88
SCoT21 ACGACATGGCGACCCACA 976 Zea may full-length cDNA clone ZM_BFc0059G16 mRNA BT055258.1 Unknown Function 1.00E–72
SCoT22 AACCATGGCTACCACCAC 272 Jasmonate induced protein X82937.1 Signal transduction 2.00E–05
SCoT24 CACCATGGCTACCACCAT 942 NBS-LRR type disease resistance protein EF155654.1 Defense response 0
SCoT27 ACCATGGCTACCACCGTG 566 Tandem genes for α1-tubulin and α2-tubulin X15704.1 Immune response 1.00E–150
SCoT29 CCATGGCTACCACCGGCC 1561 GSDL-motif lipase EU964074.1 Energy metabolism 0
SCoT31 CCATGGCTACCACCGCCT 547 Endo-1,3-beta-glucosidase XM003569714.1 Energy metabolism 3.00E–57
SCoT34 ACCATGGCTACCACCGCA 1532 Zea may cline1530024 mRNA sequence EU942688.1 Unknown Function 3.00E–112
SCoT37 CAATGGCTACCACTAGCC 680 Abscisic stress ripening protein NM001154231.1 Defense response 1.00E–169
SCoT48 ACAATGGCTACCACTGGC 968 Cyclin-like F-box NM001154502.1 Protein metabolism 0
SCoT49 ACAATGGCTACCACTGCG 851 Zea may full-length cDNA clone ZM_BFC0177I22mRNA BT086526.2 Unknown Function 0
SCoT57 ACAATGGCTACCACTACG 405 60S ribosomal protein L31 mRNA EU958292.1 Protein metabolism 2.00E–115
SCoT59 ACAATGGCTACCACCATC 291 Translation initiation factor XM003576111.1 Protein metabolism 2.00E–48
SCoT68 ACCATGGCTACCAGCGTC 934 Chitinase AJ010397.1 Defense response 7.00E–31
SCoT72 CCATGGCTACCACCGCCC 963 Zea may full-length cDNA clone ZM_BFb0162F16 mRNA BT037313.1 Unknown Function 2.00E–74
SCoT76 CCATGGCTACCACTACCG 704 Proline-rich protein gene AF331851.1 Protein metabolism 1.00E–36

第 6期 陈明辉等: 宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的 cDNA-SCoT分析 1123



图 4 对照和处理 cDNA-SCoT扩增
Fig. 4 cDNA-SCoT amplification for the control and RSD treatment
M: DL 2000 marker; 1~48: 48条 SCoT引物, 每条引物下面对应的两条泳道分别是对照和 RSD处理。
M: DL 2000 marker; 1–48: 48 SCoT primers, and the two lanes under each primer label are control and RSD treatment, respectively.


图 5 BlastX比对结果的 EST功能分类
Fig. 5 Functional category of ESTs based on the results of
BlastX
3 讨论
目前 , 研究基因的差异表达主要从mRNA转录水平
筛选差异表达基因和蛋白质翻译水平筛选差异表达蛋白
质。从翻译水平研究差异表达主要采用蛋白质双向电泳技
术; 而从转录水平研究基因差异表达的方法却有很多, 如
cDNA-AFLP [21] (cDNA-amplified fragment length poly-
morphism)、DDRT-PCR [22] (differential display reverse
transcription PCR)和DNA芯片[23] (DNA chip)等技术, 这些
技术在实践中都有较多的应用。
陈荣平等 [24]利用 cDNA-AFLP 技术分析了烟草被
TMV 侵染后基因的差异表达, 得到 12 个诱导表达片段,
其中 TIF2 为新发现的与抗 TMV 相关的基因; 阙友雄等[25]
采用 12个 3′锚锭引物和 8个 5′随机引物, 运用DDRT-PCR
差异显示方法 , 分析了甘蔗接种黑穗病菌后的基因表达
差异 , 获得 7 条真实差异表达片段 ; 阙友雄等 [26]利用
cDNA 芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表
达, 获得有效差异表达基因 101个, 其中上调 55个, 下调
46个。但上述方法各有优缺点, DDRT-PCR可同时对多个
材料进行 mRNA 水平表达差异的研究, 差异片段容易区
分 , 但假阳性高 , 有放射性污染 ; cDNA-AFLP 具有
DDRT-PCR 的优点, 还提高了反应效率, 降低了假阳性,
重复性好 , 但步骤复杂 , 对内切酶和引物有较高要求。
cDNA 芯片技术具有高通量和高敏感性特点 , 但花费较
高。SCoT 技术是一种基于翻译起始位点(translation ini-
tiation site, TIS)的目标分子标记新技术, 是以 PCR反应为
核心的分子标记技术, 其核心是引物的设计。SCoT 的引
物依据植物基因中的 ATG 翻译起始侧翼区域的保守性而
设计, 重复性和稳定性好。本研究运用 SCoT标记技术来
探究宿根矮化病与甘蔗互作过程所涉及的分子应答反应,
获得了在甘蔗中多个差异表达或优先表达的 cDNA 片段,
初步分析了宿根矮化病病原菌侵染后的调控机制。
植物机体对病原菌接触、识别、到侵染产生抗性, 是
众多抗病相关基因所形成的复杂调控交联作用的结果。这
个复杂的互作系统作用的结果将会使植物体内发生一系
列生理生化反应, 如防卫反应、信号转导、能量代谢、转
录调控等 [27], 而这些变化究其本质都是基因表达水平的
变化。植物体内富含半胱氨酸的蛋白酶(CP)是一种抑制剂,
与植物器官[28]的发育、衰老生理有关, 还可能受各种非生
物胁迫因子, 如盐碱和干旱[29]、伤害[30]等的诱导而表达。
近年来相关植物的抗病研究表明 , 诱导反应产生的氨基
酸种类与数量存在明显差异。王雪等[31]对大豆抗胞囊线
虫病的研究发现 , 精氨酸和半胱氨酸水平与病情指数呈
正相关。Liang等[32]报道消化液蛋白酶抑制剂对马铃薯甲
虫(CPB)幼虫期生长发育有抑制作用。Masoud 等[33]研究
1124 作 物 学 报 第 39卷

认为在烟草或其他植物中半胱氨酸蛋白酶抑制剂表达能
够提高植株对含有半胱氨酸蛋白酶的病原体或昆虫的抵
抗能力。Vain等[34]研究表明, 在转半胱氨酸蛋白酶抑制剂
基因的水稻种子中, 线虫的孵化率减少了 55%。半胱氨酸
蛋白酶抑制剂基因可以抑制植物中病虫害的发生发展。本
研究获得了编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因 , 可能属
于甘蔗抗性调控基因。细菌侵染甘蔗后, 甘蔗植株迅速启
动免疫应答系统, 增加半胱氨酸蛋白酶抑制剂的含量, 发
挥半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抗病作用。
本研究发现的油菜素内酯(BR)是一种植物甾醇类激
素物质, 在植物体中具有重要的功能。许多研究证明, BR
具有调节植物生理代谢, 提高作物品质和产量的作用, 并
能调节植物生长发育的许多过程[35]。在提高植物抗逆性
方面, BR能够增加生长在干旱条件下小麦的叶面积、叶绿
素含量和可溶性蛋白质的含量 [36], 提高干旱胁迫下花生
叶片 SOD、CAT活性[37], 提高大扁杏的脯氨酸含量, 明显
增强其抗旱性[38]。可以认为, 甘蔗植株受宿根矮化病侵染
时, BR 催促胁迫信号的产生, 诱导植株体内产生一系列
抗病物质增强植株的抗病性, 从而抑制病原菌的生长。因
此, 这些与植物防御反应相关基因优先表达, 可以作为提
高甘蔗抗病性的靶基因, 应深入探究其功能。
本研究发现的 F-box蛋白在真核生物中广泛存在, 最
初因发现存在于细胞周期蛋白 Cyclin F而得名[39]。F-box
蛋白可与 SKP1 和 Cde53形成泛素连接酶复合体(SCF复合
体), 选择性地结合降解蛋白, 参与泛素蛋白降解途径[40]。
F-box 蛋白是一类含有 F-box 结构域, 在泛素介导的蛋白
质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族[41]。这类
蛋白质在细胞周期循环过程[42]、基因转录[43]、防卫反应[44]
等多种生理过程中发挥重要作用, 可能参与了翻译控制、
细胞生长、免疫应答反应等重要环节。
NBS-LRR 基因是含有核苷酸结合位点 (nucleotide
binding site, NBS)和富亮氨酸重复 (leucine-rich repeats,
LRR)的胞内受体蛋白基因, 它占所有已克隆抗病基因的
70%左右 , 是最主要的一类抗病基因 [45]。近年来 , 对
NBS-LRR 抗病基因同源序列的研究已有不少报道, 如已
从水稻[46]、大豆[47]等植物中获得了一些该类抗病基因同
源 DNA片段, 成为抗病基因的候选基因。在甘蔗研究中,
阙友雄等 [48]对斑茅基因组进行体外扩增, 获得了对应区
段 7个 DNA片段, 每个片段均具有典型的 NBS结构域。
采用 RACE 技术, 阙友雄等[49]从甘蔗高抗黑穗病品中克
隆了一个 NBS-LRR类基因的 cDNA全长序列, 包括 4个
NBS区域保守结构域和 6个潜在 LRR结构域。本研究利
用 cDNA-SCoT差异分析技术获得了 NBS-LRR抗病基因,
说明在 RSD 病原菌侵染后, 甘蔗通过自身的调节能力,
迅速启动防御系统, 提高一些抗性基因的表达量, 来抵御
外来病菌的侵入。
除上述相关基因外, 本研究还发现许多与生物、非生
物胁迫相关的基因, 包括 α-微管蛋白、β-微管蛋白、ABA
胁迫成熟蛋白、60S核糖体蛋白、富含脯氨酸蛋白、茉莉
酸诱导蛋白、翻译起始因子 eif-2b α亚族、内生 1,3-β-葡
糖苷酶等。据此推测, 在甘蔗中可能存在涉及蛋白代谢、
信号转导等共同作用的外界胁迫抵御机制 , 而这些基因
的表达是否会影响以及在多大程度上影响甘蔗的抗病性,
或者是否就是甘蔗的抗病基因, 还需要继续深入研究。
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