全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
利用微生物治理重金属污染的几种途径
李樊 1 刘义2 孙伟峰3 何钢 4
( 1中南林业科技大学林学院,长沙 410004; 2江南大学生物工程学院,无锡 214122;
3江南大学食品学院,无锡 214122; 4 中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙 410004 )
摘 要: 综述了当前利用微生物治理重金属污染的几种途径, 重点突出了利用植物内生菌途径以及尝试应用生物代谢
网络手段的间接途径 ,同时也涉及了利用微生物基因构建转基因植物途径、植物微生物联合修复途径, 以期为从事微生物环
境治理、微生物冶金的科研工作者提供思路。
关键词: 重金属污染 内生菌 代谢网络
Certain Pathways ofHeavyM etals Pollution Treatment
w ith U tilization ofM icrobiology
L iF an
1
L iu Y i
2
SunW eifeng
3
H eGang
4
(
1
College of Forestry, Central South University of Forestry and T echnology, Changsha 410004;
2
Co llege of Bioengineering, J iang Nan University, W ux i 214122;
3
School of Food Science and T echnology, J iang Nan University, Wux i 214122;
4
Institute of B iological and Environm ental Sciences& T echnology,
Central South University of Forestry and T echnology, Changsha 410004)
Abstrac:t Certa in pa thways of heavy me tals po llution treatm ent w ith utilization of m icrob io logy w ere introduced in this paper. The
app lication of p lant endophy tic and ind irect pathw ay o f biom etabo lic netwo rk w ere h ighlighted. M eanwh ile, the usages o f transgen ic
p lant by m ic robio logy gene techno logy and plan tm icrobio logy rem ediation we re re ferred. Thesew orks w ere expected to prov ide som e i
deas fo r researchers in the field o f env ironm ent trea tm en t and m ic robial m eta llurgy.
Key words: H eavy m eta ls po llution Endophy tic bacteria M etabo lism network
收稿日期: 20100621
基金项目:中南林业科技大学青年基金项目 ( 2008001B) ,生物环境科学与技术研究所科研启动项目 ( 06A02)
作者简介:李樊,女,讲师,从事生物技术教学和科研工作; Em ai:l nafanl@i 163. com
在自然环境中, 微生物通常不能降解和破坏重
金属, 并且由于微生物个体太小,吸附的重金属很难
从土壤中去除,因此微生物对重金属的修复被认为
不是修复土壤重金属污染的根本途径。而植物修复
虽然克服了微生物修复难以收集的缺点, 但过量的
重金属往往对植物生长产生抑制, 且修复植物的生
物量太小,修复过程缓慢。而将二者结合起来对重
金属污染土壤进行修复可使生物修复效果的有效性
得以提高 [ 1]。目前对植物微生物联合修复的研究
主要集中于根际微生物与其宿主植物, 但根际微生
物在实际应用中往往会对多变的土壤环境不适应或
者受到土壤本土微生物竞争及原生动物的吞噬等作
用 [ 2] , 造成效果不稳定。
植物内生菌是寄居在植物体内但并不使植物表
现出特定症状的一类微生物, 它们生活在植物组织
内部,长期以来与宿主植物形成了紧密的共生关系,
在植物病害防治与生物修复中均显出独特的优
点 [ 3]。随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不
断深入,植物内生菌的生态和生理作用及其作为潜
在的生防资源和外源基因载体, 在农业和医药领域
中具有巨大应用潜力。如果能立足内生菌与植物紧
密的共生关系,从代谢的水平上辅以代谢工程、基因
工程和生物信息学手段, 寻找两者或多者之间的中
间代谢物,深刻揭示之间的代谢规律和基因调控规
2010年第 9期 李樊等: 利用微生物治理重金属污染的几种途径
律,则可更大程度地发挥内生菌的具大价值。
1 利用植物内生菌治理重金属污染
在内生菌与宿主植物长期协同进化过程中,彼此
构成了稳定的生态关系。由于植物与内生菌相互间
基因交换的结果,使内生菌具有产生某些与植物相同
或相似化合物的能力, 因此, 可作为天然活性物质的
重要来源,并为构建外源基因载体提供了理论依据。
11 构建外源基因的载体
因内生菌具有在植物体内定殖、繁殖、转移的特
点,可作为构建 工程菌 !的理想载体, 将某些抗病
虫基因导入到内生菌中,能提高植物的抗病虫能力,
而植物本身的基因并未发生改变, 这样可以保持植
物的天然性状 [ 4 ]。Boronin和 Kochetkov将多环芳
烃降解基因导入荧光假单孢菌,产生一组突变体,有
些变种的多环芳烃降解能力显著增强。他们再将重
金属 (如 N i、Co、Zn、Cd)阻抗质粒导入上述工程菌,
构建新一组突变体, 发现其中一个突变体的耐 Co
能力比原种高出 6倍, 但没有降低生防功能和多环
芳烃降解能力。在另一个试验中, Kochetkov等将 2
个含降解基因的质粒导入到 4个假单孢菌种, 这 4
个菌种以及它们的突变型呈现不同的生长动力学和
质粒稳定性。转化后, pOV质粒的邻苯二酚双氧酶
活性高于 PAS216质粒, 但这些菌种呈现相似的萘
( naphthe lene )双氧酶活性和水杨酸酯水解酶活性。
将带质粒的菌种接种到油菜种子, 萘的存在促进了
植物生长,而在高萘条件下,对照植物很快死亡。此
试验表明生防菌与降解质粒重组可更有效促进多环
芳烃污染土壤的生物修复。对高度水溶和挥发性有
机污染物 (如 xenobiotics,异源生物毒素 ) ,植物修复
技术往往难以达到预期目的,因为在生物降解前,大
部分污染物就已经从植物释放到大气。Barac等 [ 5]
报道了用接种内生工程菌以提高植物修复作用的可
能性。许多内生菌在根际能找到相似菌种。他们测
试了 2个洋葱伯克霍德氏菌 (B urkholderia cepacia )
菌株, 一个为内生菌, 另一个来自根际。将 pTOM甲
苯降解质粒导入到 2个菌株,发现修饰的内生菌能
有效降解甲苯、减少植物毒性、减少甲苯从叶子的挥
发,但修饰的根际伯克霍德氏菌只轻微改善了甲苯
的降解能力。此试验表明开发内生工程菌可作为提
高植物修复作用的一个有效手段。
12 尝试应用生物代谢网络手段的间接途径
宿主植物与内生的真菌是互惠共生关系,而内生
真菌之间也是互惠共生关系 (环境微生物学中称之为
共代谢 )。宿主植物与内生真菌关系是在特定的历
史、地理环境条件下,经过长期的协同进化,确定下来
的。它的科研意义不言而喻,其应用价值是巨大的。
微生物冶金领域, 人们发现利用几种 靠吃矿
石为生!的细菌共同浸矿大大好于只用一种细菌去
浸矿的效果;生物工程领域 (如混合发酵生产啤酒、
酒精等 ), 人们都是利用两种或两种以上的微生物
共同发酵,才能取得良好的效果; 还有农杆菌的应用
等。这些事实都说明了紧密的共生关系,除了常规
的可以在微生物中构建外源基因载体外,应该还有
更大的应用空间。并且在微生物冶金领域和某些其
它领域,已经有学者开始尝试从系统水平上将具有
共代谢关系的微生物种群作为一个整体研究, 力求
把两者或多者的代谢途径构建成一个网络, 从而从
整体上进行基因调控。事实上这种思路是可行的,
利用 DNA芯片技术能够同时检测大量基因的差别
表达,这使得能够鉴别生物反应器中跟细胞生长和
代谢状况密切相关的基因表达指纹图谱; 利用
NMR、LCMS、IR等技术能够同时检测甚至定量分
析代谢物组。这些高通量技术产生的海量数据等使
得重建代谢网络和调控网络成为可能,也为内生菌
治理重金属污染指出了一个发展方向。
在应用生物代谢网络时, 首先最关键的是要构
建出有生物意义的能解决生物问题的代谢网络, 即
要构建出能真正反映内生菌之间或内生菌与宿主植
物之间关系的代谢网络。当前, 已经有很多生物信
息学专家致力于生物代谢网络重建工作并且取得了
一些丰硕的成果, 但由于最终的代谢网络程序还是
得计算机专家编写,所以各种代谢网络都或多或少
地存在一些不能被生物专家认可的地方。事实上,
大多数代谢网络都只是 衣着华丽!, 但基本上很难
应用。所以在构建代谢网络的同时, 一定要注意代
谢网络的可应用性。具体可以分为以下几个步骤:
( 1)筛选出治理重金属污染效果较好的宿主植物和
几种关键内生真菌; ( 2)确认这几种关键内生真菌
是否存在共生关系; ( 3)高通量技术获得各自的代
谢物组和代谢反应; ( 4)获得各自的代谢网络并通
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过试验验证。这一步相当关键,构建代谢网络时,针
对当前的时弊,应该特别注意: ( a)从生物应用的角
度,在不影响正确性的前提下, 尽量删除不必要的或
对所研究问题不是很关键的节点和代谢反应, 最大
限度突出生物专家想要获得的信息; ( b)结合已经
研究得非常透彻的代谢反应如 TCA、EMP、HMP和
PPP等对已经构建出的网络作出分析判断; ( 5)连
接几个关键内生菌已经构建的代谢网络并找出关键
的中间代谢物或次生代谢物; ( 6)根据所连接的代
谢网络上调或下调某些关键基因, 检测宿主植物的
耐受和吸附重金属的能力是否提升。
2 利用微生物基因构建转基因植物治理重
金属污染
近年来发展起来的通过转基因植物进行污染环
境的修复技术可以将不同目的基因克隆并转化到生
物量大、生长周期短的植物中, 提高植物对污染物的
抗性和富积能力或提高超富积植物的生长速度或生
物量; 外源基因的高效表达还有助于进行植物修复
的机理研究,因此转基因植物修复污染环境也已经
成为目前研究和开发的热点。
构建转基因植物的外源基因一般来源于富集植
物或微生物。其中利用微生物中具有吸附或抗重金
属的基因来构建转基因植物是一种常用可行的手
段。如谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( glutamy lcysteine
synthe tase, ECS)催化谷氨酸和半胱氨酸合成 谷
氨酰半胱氨酸 ( G luCys ), 并进一步合成 GSH。
这些化合物都含有 SH, 可以和 Cd ( II)、Pb( II)、As
( III)等金属离子结合, 降低对植物的毒害, 促进它
们的吸收和累积。表达 ECS基因的拟南芥和印度
芥菜中 GSH和 G luCys的含量明显高于对照 [ 6]。
还有如铜绿假单胞菌中抗锌汞基因 czcABC也可起
到类似作用 [ 7]。
3 利用植物和微生物联合治理重金属污染
植物和微生物还可能进行协同代谢过程, 如植
物释放某种特殊底物, 诱导在降解过程中起重要作
用的双氧酶或其它酶的合成。Rugh等 [ 8]将 18种植
物种在多环芳烃处理土壤上,发现与对照比,植物显
著增加了多环芳烃的生物降解, 总细菌数和菲 ( Phe
nanthrene)降解菌也显著增加;分离到的降解菌比对
照土壤的降解菌有更强的降解能力。 Francova等从
污染土壤分离到 2个菌株: 睾酮假单孢菌 ( Co
mamonas testosteroni) B356和伯克霍德氏菌 LB400。
用几种多氯联苯衍生物测试细菌的分解能力和代谢
产物,发现多氯联苯降解产生过渡产物氯苯酸,烟草
和山葵等植物具有氯苯酸降解能力, 所以植物和微
生物可联合加强多氯联苯的降解。但大多数情况
下, 污染物的降解往往有一组微生物联合进行,对这
些微生物组合如何在根际进行空间分布并联合代谢
目前尚缺乏研究。
4 展望
当前, 利用内生菌治理重金属污染有着具大的
潜力和市场。由于基因克隆技术已经非常成熟, 单
纯的构建外源基因已经不能最大限度地解决实际问
题, 而且寻找微生物代谢之间的联系也将必然成为
未来微生物发展的一个重要方向。本着理论与实践
相结合和节约资源的思想, 着眼未来和相关领域的
发展,笔者提出尝试利用生物代谢网络间接治理重
金属污染途径,在相同试验量的情况下,获得更多有
价值的科研数据, 取得最好的实际效果。不过由于
受到既懂生物又懂计算机的人才有限的制约, 生物
代谢网络应该说还没有发展到实践水平。这主要是
由于,虽然生物专家重视生物代谢网络,但是生物信
息学工作者很难给出具有生物意义代谢网络, 所以
在实际合作中还存在一定的难度, 在今后的研究中
应当给予充分重视。
参 考 文 献
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(下转第 64页 )
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克隆法。PCR的快速、灵敏、操作简便等优点, 已成
为基因工程研究中不可缺少的技术之一 [ 7]。本研
究首次将这一技术与基因预测结合起来应用到 cD
NA文库的筛选中。鉴于 cDNA中不存在内含子和
其它重复序列,我们采用了基因预测与 PCR结合的
方法, 预测出目的片段的基因以及基因的 CDs序
列,根据 CD s序列设计引物。直接以绵羊的基因组
和 cDNA文库做模板,扩增出目的基因。该技术较
之噬菌体原位杂交 [ 8]以及噬菌体原位杂交与 PCR
技术相结合筛选 cDNA文库的方法更为简单、快捷。
以往的噬菌体原位杂交的方法由于需要反复接触放
射性同位素,因此对身体伤害较大, 也比较危险,而
用此方法, 可以去除这些顾虑。采用基因组和 cD
NA文库同时进行扩增并测序比对, 就进一步使试
验结果更可信。当然采用该方法时, 必须已知用于
杂交的序列,这样才可以预测出该段杂交序列的基
因和 CDs区,引物设计才有章可循。同时设计引物
的位置也是非常重要的。在外显子比较连续的区域
设计引物是该方法成功的关键所在。由于基因预测
是根据 ORFs,所以基因预测的结果可能比目的序列
真正含有的基因要多, 这就有可能使部分预测出的
基因不能从 cDNA文库中获得, 同时 cDNA文库的
质量也会在很大程度上影响目的基因的获取, 如在
本试验中没有扩增出来的 C11基因就有可能属于
上述两种情况。综上所述, 该方法较之与原位杂交
的方法更具有简便快捷、经济有效的特点。因此,本
研究认为运用基因预测与 PCR相结合从 cDNA文
库中获得表达基因是一种行之有效的方法。
参 考 文 献
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