全 文 ：西北农业学报　2010 , 19(1):64-67
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
火棘内生真菌的分离及抑菌活性测定＊
陈志敏1 ,田小曼2 ,吴云锋1＊
(1.西北农林科技大学 植物保护学院 ,陕西杨凌　712100 2.杨凌职业技术学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:从蔷薇科植物火棘的茎 、叶 、果中分离出内生真菌 15 株 ,其中茎中分离到 4 株(J1 ～ J4), 叶中分离到
8 株(Y1 ～ Y8), 果实中分离到 3 株(G1～ G3);分别测定 15 株内生真菌的液体培养物(发酵液和菌丝体混合
物)对 9 种植物病原真菌的抑菌活性 , 结果表明 , 有 13 株内生真菌(86.67%)对某些植物病原真菌表现出
50%以上的抑菌活性 ,其中 J4 菌株对 9 种植物病原真菌的抑菌活性都在 50%以上 , 最高可达 97.14%,其抗
菌谱较广 ,值得进一步研究。
关键词:内生菌;火棘;分离;抑菌活性
中图分类号:S476　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2010)01-0064-04
Isolation of Endophytes from Pyracantha f ortuneana and the
Test on Fungistasis of Some Endophytic Fungi
CH EN Zhimin1 , TIAN Xiaoman2 and WU Yunfeng1＊
(1.C ollege of Plan t Protect ion , Northw est A&F Universi ty , Yang ling S haanxi　712100 , C hina;
2.Yangling Vocat ional and T ech nical C ollege , Yanglin g Sh aanxi　712100 , China)
Abstract:15 kinds o f endophy tic fungi we re iso lated f rom the stem , leaves and frui t o f Py racantha fo r-
tuneana.And 4 st rains remarked as J1 ～ J4 w ere isolated f rom stem , 8 st rains remarked as Y1 ～ Y8
were isolated f rom leaves , 3 strains remarked as G1 ～ G3 were isolated f rom fruit.15 endophy tic fungi
were cultiv ated in liquid medium respectively .The to tal of culture including the mycelia and cul tural
liquid w ere ext racted w ith acetone af ter desiccating , triturating and the fungistasis of the ex tracts on 9
kinds of plant pathogens w ere determined.The results show ed that strains w hich have the ant ifungal
activi ties account for eighty six point sixty seven precent in the 15 endophy tic fung i.The ant ifungal
activi ties o f J4 to 9 kinds of plant pathogenic fung i w as notable , the inhibit ion rate w ere all up to fif ty
percent , the highest w as ninety seven point fourteen percent.The acetone ext racts of J4 showed a
bro ad antifungal spect rum.It w as w o rthing to be studied.
Key words:Endophy tic;Pyracantha fortuneana;Isolstion;Fungistasis
　　火棘 [ Pyracantha fortuneana (Maxim.)
Li]为蔷薇科苹果亚科(Maloideae)火棘属(Pyra-
cantha Roemer)的常绿野生灌木 ,俗称赤阳子 、红
子 、小红果 、火把果 、水沙子等 ,分布于中国东南和
西南各省的广大地区[ 1] ,其果实性味干酸 ,药用具
有健脾消积 、生津止渴 、清热解毒 、活血止血的功
效 ,治胸中痞块 、食积 、崩漏 、产后淤血 ,还可消虫 、
明目[ 2] 。其叶 、根均可作药用[ 3] 。火棘总提取物
具有清除氧自由基 、降血脂 ,增强免疫力 、增强体
力和促进消化功能等作用[ 4] 。
近年来的有关研究表明 ,从植物的根 、茎 、叶 、
果实中分离到多种植物内生真菌(Endophy tic
fungi),它们是植物微生态系统中的天然组成成
分。根据内共生理论 ,内生真菌可能产生与宿主
＊收稿日期:2009-12-04　　修回日期:2009-12-29
基金项目:教育部长江学者和创新团队发展计划资助(200558)。
作者简介:陈志敏(1973-),男 ,陕西咸阳市人 ,在职硕士 ,主要从事植物病理学研究。 E-mai l:chenzhimin@nw suaf.edu.cn
＊通讯作者:吴云锋 ,男 ,教授 ,主要从事植物病毒学研究。 E-mail:wuy f @nw suaf.edu.cn
相同或相似的次生代谢产物 ,因此药用植物的内
生真菌很可能产生一些具有多种生物活性的代谢
产物 ,是新化合物 、新药物筛选的潜在资源 ,在农
业 、医药业及食品工业中具有很高的应用潜
力[ 5-7] 。目前有关火棘内生真菌的研究国内外尚
未见报道 ,笔者对火棘茎 、叶 、果中的内生真菌进
行了分离 ,并对其抑菌活性进行了初步研究 ,以期
为火棘资源及其内生真菌的开发利用提供理论依
据。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料　火棘的茎 、叶 、果实 ,均采摘于
西北农林科技大学校园内 ,植株健壮 ,无病虫害。
1.1.2　病原菌　供试植物病原真菌共有 9种 ,分
别为烟草赤星病菌(Alternaria al ternata),苹果
炭疽病菌(Glomerel la cingulata),小麦根腐病菌
(Bipolaris sorok iniana),马铃薯干腐病菌(Py th-
ium solani),玉米弯胞病菌(Curvularia lunata),
葡萄炭疽病菌(Glomerel la cingulata Spauld),番
茄早疫病菌(A lternaria solani),西瓜枯萎病菌
(Fusarium oxy sporum f.sp.niveum),小麦赤霉
病菌(Gibberel la zeae),由西北农林科技大学植物
病理实验室提供 。
1.1.3　培养基　内生真菌分离 、活化 、抑菌活性
测定均用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基;内生
真菌摇床培养用的液体培养基为马铃薯葡萄糖
(PD)培养基。
1.2　方法
1.2.1　内生真菌的分离 、纯化　从不同火棘枝上
取茎 、叶 、果各数段 ,在流水下冲洗 ,对材料表面进
行消毒 , 先用 75%的乙醇处理 5 min , 然后在
0.1%的升汞溶液中浸泡 1 min ,无菌水冲洗 4 ～ 5
遍后 ,在无菌培养皿中将材料切成 3 ～ 5 mm 薄
片[ 8] ,置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中 ,切面朝向
培养基 ,每皿放 1 ～ 2块组织 , 28 ℃恒温培养 。同
时取表面消毒的未切开的茎 、叶 、果 ,分别置于平
板中作为对照。经过 5 ～ 7 d ,菌丝从组织块上长
出 ,形成一定大小菌落时(以组织块为中心向周围
进行扩散生长的为分离的目的菌种),从边缘挑取
菌丝移到另一 PDA 平板进行纯化 , 重复至纯培
养。培养过程中不断观察记录菌种生长状况 。
1.2.2　内生真菌的液体培养及其培养物的处理
　将活化的 15株火棘内生真菌分别接种于盛有
马铃薯葡萄糖液体培养基的三角瓶中 ,摇床培养
(160 r/min , 25 ℃)7 d ,每天观察记录其生长状
况。待发酵液发生颜色变化时终止发酵 。将培养
物(发酵液和菌球)从三角瓶中转移至培养皿上 ,
置于 60 ℃干燥箱内烘干 ,称量;而后将其在研钵
中研磨成粉末 ,以 1∶10(质量 g ∶体积 mL)的比
例室温下用丙酮处理 18 h ,再用超声波清洗器进
一步提取培养物内的化学成分(温度 60 ℃,时间
30 min ,功率 80%),得到各内生真菌液体培养物
的丙酮提取液[ 9] 。
1.2.3　抑菌活性测定　采用抑制菌丝生长速率
法[ 10] 。将各内生真菌培养物的丙酮提取液加入
已灭菌融化的固体 PDA 培养基中 ,每 145 mL 培
养基中加 5 mL丙酮提取液(用 5 mL 无菌水和丙
酮分别作空白对照),混匀 , 倒平板;用直径 0.5
cm 的打孔器在已活化的植物病原真菌的菌落边
缘按同心圆制备菌饼 ,然后将菌饼分别接种于上
述 PDA 平板上 ,每处理设 3个重复 ,于 28 ℃下恒
温培养 3 d ,采用十字交叉法测量菌落直径 ,按照
下式计算抑菌率:
抑菌率=(Dcon trol-D sample)/ Dcontrol×100 %。
其中 D control为对照菌落直径-0.5(cm), Dsample为
处理菌落直径-0.5(cm)。菌落直径均为 3次重
复的平均值。
1.2.4　J4丙酮提取液对 9种植物病原真菌的毒
力方程　分别取 J4丙酮粗提液 1 、2 、3 、4和 5 mL
于 5支试管中 ,编号后用丙酮分别定容至 5 mL ,
然后分别加入已灭菌融化(约 50 ℃)的固体 PDA
培养基中 ,按“1.2.3”中方法测定抑菌活性(用 5
mL 的丙酮作空白对照)。将 J4培养物的丙酮提
取液体积与病原真菌的抑菌活性建立回归方程 ,
求出 J4丙酮粗提液对 9 种植物病原真菌的毒力
方程 。
2　结果与分析
2.1　内生真菌分离纯化及形态观察结果
从火棘的果实中共分离出 3种真菌 ,分别编
号为 G1 、G2 、G3。从火棘的茎中共分离出 4 种真
菌 ,分别编号为 J1 、J2 、J3 、J4。从火棘的叶中共分
离出 8种真菌 ,编号为 Y1 ～ Y8。各菌株的菌落
形态特征见表 1。
·65·1 期　　　　　　　　　　　　　陈志敏等:火棘内生真菌的分离及抑菌活性测定
表 1　火棘内生真菌的形态观察结果
Table 1　The observation result of the endophytic fungi morphology from Pyracantha fortuneana
菌株
S t rain
菌落颜色 、形态
Color and shape of colony
气生菌丝形态
Sh ape of aerial mycelium
生长速度
Grow th rate
其他
Others
J1 菌落规则 ,呈深绿色外圈白色 菌丝短 ,呈绒毛状 生长较快
J2 菌落呈白色 气生菌丝发达 ,菌丝长且成簇生长 生长快
J3 菌落白色 ,略带粉色 菌丝短 ,呈绒毛状 生长慢 菌落上有同心螺纹
J4 菌落薄 ,呈白色 菌丝较长 生长快 生有水珠状的孢子
G1 菌落灰绿色 白色气生菌丝 生长快
G2 菌落白色 菌丝短 ,絮状 生长较慢
G3 菌落绿色 气生菌丝发达 ,菌丝长且成簇生长 生长较快
Y1 菌落呈白色 菌丝较细长 ,丝状 生长较快
Y2 菌落薄 ,呈白色 菌丝短 生长较慢
Y3 菌落较厚 ,呈白色 菌丝短 ,呈团生长 生长较慢
Y4 菌落呈深绿色 ,外圈白色 菌丝短 生长较快
Y5 菌落白色 菌丝短 生长较快
Y6 菌落呈砖红色 ,很薄一层 ,透明 无菌丝生长 生长慢 菌落上有同心螺纹
Y7 菌落棕色略显绿色 菌丝较长,呈绒毛状 生长快
Y8 菌落暗绿色 菌丝短 ,呈绒毛状 生长较快
2.2　火棘内生真菌培养物对植物病原真菌的抑
菌活性
由表 2 可以看出:在 15 株内生真菌中 ,
86.67%的菌株(Y6和 Y8除外)对 1种以上的病
原真菌有 50%以上的抑菌活性。其中 ,有 7株内
生真菌对 3种以上的植物病原真菌有 50%以上
的抑菌活性 ,有 5株(Y1 、G2 、J1 、J3 、J4)对 4种植
物病原真菌有 50%以上的抑菌活性;有 4株(Y1 、
J1 、J3 、J4)内生真菌对 5 种植物病原真菌有 50%
以上的抑菌活性;有 2株(J1 、J4)内生真菌对 6种
植物病原真菌有 50%以上的抑菌活性;有 1 株
(J4)内生真菌对 9 种植物病原真菌有 50%以上
的抑菌活性。抗菌谱较广 ,值得进一步研究。
另外 ,通过比较还得出:从火棘的叶 、茎 、果中
获得的所有内生真菌培养物的丙酮提取液对烟草
赤星病菌 、小麦根腐病菌 、葡萄炭疽病菌和番茄早
疽病菌的抑菌作用相对较强 。其中有 12株(即
80%的菌株)内生真菌液体培养物的丙酮提取液
对小麦根腐病菌的抑菌率高达 50%以上;有 8株
(即 53.33%)内生真菌液体培养物的丙酮提取液
对烟草赤星病菌的抑菌率高达 50%以上;有 5株
(即 33.33%)内生真菌液体培养物的丙酮提取液
对葡萄炭疽病菌和番茄早疽病菌的抑菌率高达
50%以上 。此外 ,有些菌株液体培养物的丙酮提
取液对某些植物病原真菌的抑菌率为负值 ,可能
是这些培养物的丙酮提取液中含有能够促进植物
病原真菌生长的物质 。
表 2　火棘内生真菌对 9 种植物病原真菌的抑菌率
Table 2　Inhibitory rate of the endophytic fungi isolated from Pyracantha fortuneana to 9 plant pathogens
菌株
S t rain
抑菌率 / % Inhibi tory rate
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9
Y1 81.25 62.50 85.11 31.37 44.68 -58.33 33.33 80.40 50.00
Y2 80.00 32.65 68.42 29.09 21.95 5.13 -26.26 9.23 43.84
Y3 68.57 56.00 76.00 26.67 44.44 43.64 37.04 30.77 40.68
Y4 79.17 29.69 85.11 31.37 42.55 -75.00 40.00 25.49 16.18
Y5 70.83 46.88 79.79 29.41 38.30 -95.83 20.00 1.96 27.94
Y6 17.14 16.00 48.00 17.78 31.11 43.64 7.41 30.80 44.07
Y7 45.83 12.50 59.57 18.63 28.72 -87.50 31.11 11.76 26.47
Y8 22.86 16.00 40.00 35.56 35.56 40.00 7.41 20.50 37.29
G1 27.08 15.63 65.96 23.53 19.15 -91.67 8.89 13.73 25.00
G2 28.57 32.00 64.00 53.33 44.44 50.91 59.26 46.15 47.46
G3 33.33 15.63 74.47 15.69 -10.64 -62.50 15.56 13.73 11.76
J1 57.14 48.00 80.00 75.56 93.33 80.00 74.07 15.38 54.24
J2 68.57 -20.00 40.00 36.00 40.00 54.55 66.67 46.15 47.46
J3 22.86 24.00 64.00 62.22 40.00 65.45 74.07 61.50 40.68
J4 97.14 80.00 72.00 66.67 75.56 76.36 74.07 51.30 91.53
·66· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　19 卷
2.3　J4丙酮粗提液对 9种植物病原真菌的毒力
方程
由表 3结果建立 J4 培养物的丙酮提取液体
积与病原真菌的抑菌活性的回归方程 ,初步得出
该提取液对几种病原真菌菌丝生长抑制的毒力方
程(表 4)。
表 3　不同体积 J4 丙酮提取液对 9 种植物病原真菌的抑菌率
Table 3　 Inhibitory rate of J4 acetone extracts with different volume to 9 plants pathogens
菌株
S t rain
抑菌率/ % Inhibitory rate
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9
1 m LJ4 40.00 51.85 58.82 34.04 41.38 5.71 40.00 30.77 26.67
2 m LJ4 64.00 37.04 64.71 25.53 55.17 17.14 62.86 35.90 44.44
3 m LJ4 72.00 51.85 70.59 46.81 62.07 34.29 80.00 46.15 40.00
4 m LJ4 80.00 66.67 82.35 55.32 72.41 40.00 85.71 51.28 53.33
5 m LJ4 97.14 80.00 72.00 66.67 75.56 76.36 74.07 51.28 91.53
表 4　J4 培养物的丙酮提取液对几种病原真菌菌丝生长抑制力
Table 4　Inhibitory rate of J4 acetone extracts from cultures to 9 plants pathogens
供试真菌
Tested fun gu s
菌株
S trains
毒力回归方程
Toxic reg ression equation
相关系数
Correlat ion coef fi cient
EC50/mL
B1 J4 Y =0.1303X+0.3154 0.9564 1.46731
B2 J4 Y =0.1438X+0.2294 0.9994 1.81780
B3 J4 Y =0.1764X+0.4707 0.9658 0.16100
B4 J4 Y =0.1064X+0.2411 0.9947 2.43271
B5 J4 Y =0.0856X+0.3564 0.9618 1.67570
B6 J4 Y =0.1642X-0.1455 0.9252 3.91181
B7 J4 Y =0.1543X+0.2858 0.9406 1.38205
B8 J4 Y =0.0564X+0.2615 0.9167 4.28700
B9 J4 Y =0.3246X-0.1073 0.9362 1.80918
3　讨论
从本研究结果可以看出 ,内生真菌在火棘的
茎 、叶 、果实等器官中普遍存在并且种类较多 ,但
火棘内生真菌菌株的分类地位有待进一步确定。
抑菌活性测定结果表明 ,在测试的火棘内生真菌
中 ,86.67%菌株对某些植物病原真菌表现出较好
的抑菌活性。菌株 J4 的液体培养物的丙酮粗提
液对 9 种植物病原真菌有 50%以上的抑菌活性 ,
对烟草赤星病菌的抑菌率高达 97.14%,其代谢
产物的浓度与其对部分植物病原真菌的抑菌活性
之间存在一定的线性关系 ,表明 J4代谢产物的抑
菌谱较广 ,抑菌活性也较高 ,对其抑菌活性成分的
分离纯化及结构鉴定等值得进一步研究 。
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