全 文 ：生物教术通报
· 研究报告 · 丑了口 年增刊
两广和云贵川等地区黄牛的微卫星标记遗传多样性
韩旭 ‘ 王志刚 ’ 刘丑生‘ 张桂香‘ 宋卫涛, 张自富,
’全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心 , 北京
中国农业科学院家禽研究所 , 扬州 中国农业大学 , 北京
摘 要 选择 对微卫星 标记 , 采用荧光一 多重 技术 , 对 个中外黄牛品种的等位基因数 、基因
频率、 多态信息含量和遗传杂合度进行分析 , 以 ’ 遗传距 离为基础 , 采用非加权组对算术平均法构建了聚类
图 。 结果表明 , 个黄牛品种首先分为中外两大类 类是我国地方黄牛品 种 , 类是 个引进品种 , 其中 个地
方黄牛品种又可分为两个分支 , 云贵川高原地区的 个品种关岭黄牛、 昭通黄牛、 宣汉黄牛 、凉 山黄牛和川南山地
牛聚为一支 , 两广与江西的 个品种涸州黄牛、徐闻牛和吉安黄牛聚为另一支 , 两分支聚类与品种的地理分布区域
相吻合。
关键词 微卫星 黄牛 遗传多样性
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我国是世界上畜禽遗传资源最为丰富的国家之
一 , 共有畜禽品种 、类群 576 个 , 占全球已知畜禽种
类的六分之一 。 我国多样化的地理 、 生态 、 气候条
件 , 众多的民族 , 加之长期以来广大劳动者的驯养和
精心选育 , 形成了丰富多彩 、种质特性各具特色的畜
禽品种资源 。
但长期以来 , 由于单纯追求畜牧业发展的数量 ,
忽视其独特的资源特性和生态意义 , 缺乏对畜禽品
种资源的足够认识 , 普遍存在 “ 重引进 、轻培育 , 重
改良、 轻保护 ” 的现象 , 再加上投人不足 , 基础设施
基金项目:中国地方牛种遗传距离测定项目(农财发 [20 2」9号 )
通讯作者 :韩旭( 19 82 一 ) , 女 , 研究方向:动物遗传资源保护与利用 ;E 一 m ail : m a脚e一28 18@ hot m ail .Com
生物杖术通根 B to te chn ole盯 2008 年增干IJ
和技术条件落后 ,致使我国畜禽遗传资源的保护和
可持续利用面临严峻挑战 , 部分畜禽品种数量减少 、
濒危 、甚至灭绝的现象并未得到根本遏制。 另外由
于地方品种普遍存在着同名异种或同种异名的问
题 , 给繁种 、资源保存和育种等方面工作带来了很多
不便。
我国历来重视畜禽遗传资源的保护与研究利用
工作 , 为深人了解我国地方黄牛品种的遗传变异情
况 , 本研究利用联合国粮农组织(FA O )和国际动物
传学会 (IS A G) 推荐的 12 个微卫星座位 , 对广东 、广
西 、 江西 、云南 、四川 、 贵州 6 省 (区 )的黄牛品种进
行遗传多样性分析 , 并与3 个引进品种进行比较 , 为
我国黄牛品种的起源研究 、资源保护以及开发利用
提供科学依据 。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 品种样本及来源 本研究中 8 个黄牛品种
血样的采集地及采集数量见表 1。 每个牛品种随机
采集约60 头 , 其中公牛不少于 10 头 。 要求采样个
体具备品种的典型特征 , 并且在三代或二代内没有
血缘关系 。 为更好地分析品种内与品种间的遗传变
异 , 同时选取 3 个引进品种进行对比分析 。
采用前腔静脉采血 , 每头牛采血量 ro ml 。 新鲜
血液用 l:l 的裂解液(100 m m oF L Tri s · H C I , 1 0 0
m m
o
F L E D T A
,
2 % s D s
) 裂解 , 常温下即可运输 , -
20 ℃长期保存 。
表 1 1 个中外黄牛品种血样的采集地及采集数t
编号 采集地
l0
l1
品种名称
吉安黄牛
关岭黄牛
涸州黄牛
昭通黄牛
宣汉黄牛
凉山黄牛
川南山地牛
徐闻牛
西门塔尔牛
夏洛来牛
德国黄牛
英文名称 采样数
6380154Ji ’ an ( J A )
e u an l i
n g ( G L )
W
e i zh
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( W Z )
Z h a o t o n g ( Z T )
X u an h an ( X H )
U a n g s h an ( 璐)
Chuannan M ountainous (CN)
X uwen (XW )
Simmental (SM T)
Ch, lal s ( CRL)
Cerm an Yellow ( CY)
江西省吉安市
贵州省安顺市关岭县
广西壮族自治区北海市
云南昭通市镇雄县
四川省宣汉县
四川省美姑县
四川省古蔺县
广东省湛江市徐闻县
内蒙古通辽市
辽宁肉牛繁育中心
河南省南阳市
0123456789
1 .1.2 主要化学药品及试剂 D N A 提取试剂盒购
自天根生化科技(北京)有限公司 , Ta q 酶 、 ro x b
uf-
er 均购自宝生物工程 (大连)有限公司 , d N T P S 购自
上海生工生物工程技术服务有限公司 , P O P4 胶 、 甲
酸胺等电泳检测试剂均使用美国应用生物系统公司
进 口试剂 。
1
.
2 方法
1.2 . 1 D N A 提取 D N A 的提取采用天根生化科技
(北京 )有限公司的 D NA 提取试剂盒 。 提取的基因
组 D NA 首先经 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测合格 ,
然后用生物分光光度计将其浓度调整为 20 一 50 n岁
nil 后即可进行 PC R 扩增 。
1
.
2
.
2 微卫星引物 应用的 12 对微卫星引物由联
合国粮农组织 (FA O )和国际动物遗传学会 (IS A G )
推荐(表 2 ) , 因此结果具有全球通用性和可 比性 。
引物由美国应用生物系统公司标记并合成 。 12 个
微卫星座位的相关信息详见表 2 。
年增刊 韩旭等:两广和云贵川等地区黄牛的微卫星标记遗传多样性 253
表2 12 个微卫星座位的相关信息
座位名称 引物序列(5 ‘神3 ’) 退火温度(℃ ) 片段范围 (bp) 荧光标记
C SSM 66 A C A CA A A TC CI , r 】, C T G C
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A G C T G A A A I
,
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A A T G C A C T G A G G A G C I
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E T H 2 2 5 G A T C A C C r T G C C A C T A I
,
1
,
1
,
C C T A C A T G A C A G C C A G C T G C T A C T 5 5
一 6 5 1 4 1 一 1 5 9 V I C
H A U 犯4 CTCTCTGCCTI, 1 , C l , C C C T G T A A T A C A C 门丁A G G A G A A A A A T A 52 一 5 5 1 1 0 一 1 2 3 6 一 F A M
1 1巧T 义刃6 T G T C T G T A 了叮C TG CTG T G G A C A C G G A A C CG A T CT A A A C G 55 280 一 3 (X) 6 一 F A M
I L S T 朋11 G CT T G C T A C A T G G A A A G T G C CT A A A A TG C A G A G C C CT A CC 55 3(X) 一 3 2 0 V I C
J N R A 06 3 A 叨叮G CA CA A G CTA A A TC TA 乃C C A A A C C A C A G A 为A T G C T T G G A A G 55 一 5 8 1 7 0 一 2 (X) V I C
E T H 1 0 G T T C A G G A C T G G C C C T G C T A A C A C C T C C A G C C C A C T 1
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C T C I 丁C T C 55 一 6 5 1 9 0 一 2 3 8 V I C
E T H 1 5 2 T A C T C G T A G G G C A G G C T G C C T G G A G A C C T C A G G G T T G G T G A T C A G 5 5 、 60 1 9 2
一 2 04 6
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E T l l 3 G A A C C T G C C T C T C C T G C A T I
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H E 四 C C CA I , 1 , C A G T C I , T C A G A G G T C A C A T C C A T G T T C T C A C C A C 5 2 一 5 7 1 4 3 一 1 6 5 6 一F A M
I LS f 叹刃5 G G A A G C A A T G A A A T C T A T A G C C T C T T C T G T G A G叨叮C T A A G C 54 一 5 8 1 7 3 一 1 8 3 V IC
IN R A 0 3 5 A T C C I
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C T G C 了门 , A T G A C A C T A T C C G 5 5 一 6 0 8 0 一 1 2 0 V IC
1
.
2
.
3 P C R 扩增 根据各引物序列之间的序列情 公式自编程序计算 。 用 DI S以N 软件包计算 Nei ’ S
况 、退火温度 、 目的片段大小 , 将引物两两组合进行 标准遗传距离(N ei’ 5 s t a n d a rd 罗netiC distanee , D s )
双扩增 , 分别从引物浓度 、 M g , ‘ 浓度 、退火温度 、循 (N ei, 1 9 7 2 ) 和 Nei’ s 遗传距离(Nei’ , g e n e t i 。 d is -
环次数进行优化 ,然后根据目的片段大小 、所标记的 tan ce , D A ) ( N ei et al . , 1 9 83 ) 。 采用非加权组对算
荧光进行组合。 其中 CSSM 66 、 E T H 2 2 5 、 H A U 孔4 、 术平均法 (Unw eighted pair脚up m ethod wi th arith -ILSrrso o6 、 I此TSO 11 和 IN R加63 作为一组进行检 m etie average , U p G M A ) 进行聚类分析 , 利用 Boot-
测 , E T H 1 0 、 E T H 1 5 2 、 E T H 3 、 H E L g 、 I L S T S0 0 5 和 IN 一 s t ran Te s t 检验所得聚类结果的可靠性 。
R A0 35 作为第二组进行检测 。 双座位 PCR 反应体 2 结果
系为 巧闪 , 参考 Craw fo rd (19 5) [‘] 的反应条件和程 2.1 等位基因分布
序 。 在 8 个地方黄牛品种的 12 个微卫星座位上 , 共
1.2.4 PcR 产物检测 先用聚丙烯酞胺凝胶电泳 发现 157 个等位基因。 从实验数据(表 3) 中可以看
检测 PcR 扩增效果 , P C R 产物扩增成功后 , 采用 到 ILs Tso 06 座位的等位基因数最多达到 19 个 ;IL-
A B1 3l o 一A va nt 全自动基因分析仪进行检测 。 s T so n 座位的等位基因数较少 , 只有 8 个;其余座
1.3 数据分析 位的等位基因数在 9 一 18 个之间 。
采用 G EN Epo p Version 3.3 计算等位基因频
率。 多态信息含量(pIC )根据 Botstein 等(一95 0 ) 的
表3 12 个微卫星座位上的等位基因数 、共有等位基因和多态信息含里
座位 等位基因数(个) 共有等位基因 共有等位基因(个) 多态信息含量
764089nU0,气‘内、飞01,Jj弓乙C S S M 6
E T l l2 2 5
H A U 1 2 4
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、
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、
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1 7 4
1 7 8
1 9 3
、
1 9 5
、
1 9 7
1 1 1
、
1 1 3
、
1 1 5
1 5 1
、
1 5 9
、
1 6 1
1 8 0
、
1 8 8
9 9
、
1 0 1
14839810942巧6
生物杖术通报 B io te ehn olo舒 B ule 点n 20 08 年增刊
在 n 个中外黄牛品种的 12 个微卫星座位上 ,
共有 42 个优势等位基因(表 4)。 优势等位基因是
指品种在特定 的基因座位上相对集中的等位基
因〔’〕。 从品种上看 , 涸洲黄牛(w z) 和徐闻牛 (x w )
的优势等位基因分布完全一致;从座位上看 , 主要集
中在 I玲TSO H 和 ILS TS0 05 两个座位上 。
表4 H 个中外黄牛品种的优势等位基因及频率
CSSM66 HAU程4 比T3〕1 1 E T H 10 E T H 15 2 IN R A 0 3 5
17 8 b p 18 2 b p 12 2 b P 2 6 0 b P 2 6 8 b P 2 14 bp 18 9 b P 195 b P
E T H3 I比1狱)05
1llbp 113bP 182bp 10 lbP
JA 0.56 0 .68 0 .76 0 .66 0 .7 1 0.73
0 .56 0 .50
0 .68
0.69
气、11.了一、.nUU0
.
8 2 0
.
9 0
0
.
6 9
0
.
5 1 0
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5 0
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8 0
0
.
6 9
0
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5 7 0
.
7 4
0 7 0
0
.
5 5 0
.
7 7
GLWz ZTXH巧CN
0.77 0.88 0.66 0.80 0.66
0.68 0.77 0.51 0.69
0.50 0.95 0.58
XW淞CRL
GY 0.53 0.54 0.74 0, 5 7 0 . 6 2 0 . 8 1
品种代号同表 1 B re ed 。od e s are th e s am e as in T a l〕le
2
.
2 微卫星座位的遗传多态性
H 个中外黄牛品种中 , 涸洲黄牛的平均等位基
因数最少为6.7 , 关岭黄牛的最多为 9.7 , 其他黄牛
品种的平均等位基因数在 5.2 一 9 . 2 之间 。 1 个中
外黄牛品种的期望杂合度和观察杂合度都大于
0.5 ,其中凉山黄牛的期望遗传杂合度和观察遗传杂
合度均为最高值 (表5 ) 。
表 5 1 个黄牛品种的多态信息含l (PIC )、期望遗传杂合度(He )和观察遗传杂合度(H 。 )
品种 平均等位基因数 多态信息含量 期望遗传杂合度 观察遗传杂合度
JAIA q 飞 0 _6 2 0 .6 4 5 0 .5 866 2
9 .7
6 .7
0 .7 1 0 .7 4 0
.6 (X 】
507942一、了O‘Uf0Un0 . 5 4 0
.
5 8 1
49
O户内、门J, ,一、J内、11., 才了了6…t.018.9 0.690.708.38.2 0.720.69
CLWZTxH巧N
X W 7.3 0.58
SMT 6.2 0.61 0.662 0.578
CRL 6.4 0.62 0.664 0.64 5
GY S , 2 0 . 5 7 0 . 6 2 8 0 . 5
64
品种代号同表 1
年增刊 韩旭等:两广和云贵川等地区黄牛的微卫星标记遗传多样性 255
根据等位基因频率计算了 H 个中外黄牛品种
间的遗传距离 , 可以看出吉安黄牛(JA )与夏洛来牛
(C R L) 间的遗传距离最大 , 徐闻黄牛(X W )与涸州
黄牛(W z) 间的遗传距离最小 。 遗传距离与地域距
离的分布一致(表 6 ) 。
表 6
JA
1 个牛品种间的 N ei ’ s 遗传距离(DA , 对角线上方)和 N ei ’ s 标准遗传距离《DS , 对角线下方)
GL W Z 盯 XH LS CN XW SM T CRL CY
JA * * * 0.145 0.l0() 1.182 0.685 0.715 0.671 0.667 1.158 0.652 1.2(X)
R气z,1.R只120…l‘.1一U0
.
0 6 1 * * * 0
.
1 6 2 0
.
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0
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0 2 7 * * * 0
.
7 9 2 0
.
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0‘UO.1月峥,乙
b月I门j…n0012031 ** 1.270.021** 0.2460.21 0.35 0.26n0 407,4勺L.1
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0.020 0.010 0.145 * *
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6一、口.遥月孟,
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0 4 4 0
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* * *
品种代号同表 1 Bre ed codes are th e sam e as in Tab le -
2 .3 聚类图
根据以上遗传距离 , 对 H 个中外黄牛品种采用
非加权组平均法(UPG M A )进行聚类分析 , 构建聚类
图 , 分别得到基于 Nei ’ S 遗传距离(D A)的 n 个中
外牛品种的 U PGM A 聚类图(图 l) 和基于 N ei ’ S 标
准遗传距离(D S)的 1 个中外牛 品种的 U PG M A 聚
类图(图2 ) 。
从图 1 中可以看出 , n 个黄牛品种首先分为中
外两大类: I类是我国地方黄牛品种 , 其中8 个地方
黄牛品种又可分为两个分支 , 云贵川高原地区的 5
个品种关岭黄牛 、昭通黄牛 、宣汉黄牛 、凉山黄牛和
川南山地牛聚为一支 , 两广与江西的 3 个品种涸州
黄牛 、徐闻牛和吉安黄牛聚为另一支 , 两分支聚类与
品种的地理分布区域相吻合 。 n 类是 3 个引进品
种 , 西门塔尔牛先与德国黄牛聚类 , 再与夏洛来牛聚
类 。 图 2 与图 1类似 , 只是凉山黄牛和川南山地牛
的聚类有所不同 。
GLzTXHLSNJAWz
X W
C R L
S M T
G Y
图 1 基于 N ei ’s 遗传距离《DA) 的 fl 个中外牛品种的 U PG M A 聚类图
注 :品种代号同表 1
生物杖术通银 B io te chn ole gy B “le 血 2008年增刊
,
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、N、亿WR才G Y2XL工从C日
图2 基于 N ei ’ s 标准遗传距离(D S) 的 1 个中外牛品种的 U PGM A 聚类图
注:品种代号同表 l。 N o t e : B re ed c记es are th e sam e as in T ab le l
3 讨论
3.1 品种内遗传 变异
多态信息含量(PIC )和遗传杂合度(H )都是品
种内遗传变异的度量值 , 其值的高低反映了品种内
个体的均匀度 ,数值高 , 品种内的遗传变异就大;反
之则品种内的遗传变异就小 。 PI C > 0 . 50 时具有高
度多态性 ;0 .25 < PI C < 0.50 为中度多态性 ;PIC <
0 .25 则为低多态性 。 由研究结果可以看出 , 8 个地
方黄牛品种的多态信息含量 Pl c 值均大于 0 .5 , 全
部属于高度多态性 。 说明我国地方黄牛品种的遗传
多样性丰富 , 具有较大的选择潜力 。
张吉清等[’〕报道在微卫星标记及其在牛遗传
育种中的应用中 , 牛微卫星位点等位基因数的变动
范围为2 一 18 个 , 本研究中发现 I玲r巧tX) 6 座位的等
位基因数达到了 19 个 。 微卫星多态性分析在畜禽
遗传多样性评估 、品种资源的分类 、保存和利用方面
发挥着重要作用 。 N ei 等冈认为微卫星比传统的血
液 、蛋白多态座位更具有多态性 , 根据其计算出的遗
传杂合度在0 .3 一 0 . 8 之间 , 因此在估计亲缘关系较
近的种群间的遗传距离 , 以及绘制系统发育树时更
为精确和高效 。
3
.
2 品种间遗传 变异与亲缘关系
品种间的遗传变异通常由遗传距离来表达 , 遗
传距离是用等位基因频率的函数表示的群体间遗传
差异的指标 , 能反映不同品种间在进化上的关系 。
通过遗传距离分析可估测品种结构和进化关系 , 从
而使人们可 以更好地区分品种 。 同时可 以利用微卫
星标记估计群体的遗传变异 , 目前欧洲牛群的研究
已比较清楚 、全面 , 其结论与牛品种的育成历史 、地
理分布结构相符〔’】。
我国地方黄牛品种与国外引进品种无论从体型
外貌和遗传距离测定结果相比较 , 差别均较大 。 3
个引进品种应单独聚为一类 , 这与罗永发等〔’〕采用
微卫星标记分析 13 个中外牛品种的遗传变异和品
种间的遗传关系的结论一致 。
从图 1 与图 2 的比较中可以看出关岭黄牛 、 昭
通黄牛与宣汉黄牛有较近的亲缘关系 , 涸州黄牛 、徐
闻牛与吉安黄牛有较近的亲缘关系 。 凉山黄牛和川
南山地牛与其他地方牛品种的关系稍微复杂 。 马月
辉等〔6]在部分黄牛品种(群体)遗传多样性分析中
提到不同品种黄牛同一座位的等位基因存在着差
异 , 并且随着地理位置差距的增加而越发显著。 陈
幼春等[’〕用蛋白位点的研究也得到了一致的结果 。
由于关岭黄牛 、昭通黄牛 、宣汉黄牛凉山黄牛和川南
山地牛均属于云贵川高原地区 , 而涸州黄牛 、徐闻牛
和吉安黄牛属于两广及江西的平原地区 , 地理位置 、
环境因素差别较大 , 因此 , 选择图 1 作为本研究的首
选聚类图。
关岭黄牛产于贵州省西南部 , 位于四川盆地和
广西丘陵之间的贵州高原 。 陈永泽等〔8〕在《贵州省
家畜品种志》中的《安龙府志》记有 :“ 辖内牛 ro 万
余 ,集散于关岭者多” ( “辖内”指盘江 13 县 ) 。 关岭
黄牛有的角基部能动摇 (又称 “ 响铃角 ” ) 。 昭通黄
牛分布于云南省昭通地区 n 个县内 , 从河谷到高寒
年增刊 韩旭等:两广和云贵川等地区黄牛的微卫星标记遗传多样性 2 57
山区均有分布。 与其他黄牛的遗传距离相比较 , 这
两种黄牛的遗传距离最小为 0.04 8 , 这说明它们的
遗传关系非常相近 , 应聚为一类 。
宣汉黄牛主产于大巴山南侧达县地区的宣汉 、
通江等县 , 分布在达县 、开江 、万源 、南江 、 巴中、平
昌、 开县 、城口等县和白沙工农区 。 宣汉黄牛与关岭
黄牛的遗传距离为0.083 , 与昭通黄牛的遗传距离
为 0.07 9 , 与其他黄牛的遗传距离相比较 , 它们之间
的遗传距离最小 。
涸州黄牛的中心产地是广西北海市的涸洲和斜
阳两岛。 李永禄等[’]主编的《广东省家畜家禽品种
志》中记载:涸州黄牛的形成与该岛的 自然条件和
人民长期的选育有着密切的关系 。 徐闻牛形成历史
较早 , 1 9 5 5 年在广州出土了东汉时期有较高肩峰的
陶牛 ,充分说明了这一点 。 涸州黄牛与徐闻牛的遗
传距离为0.058 , 聚为一类 。 由聚类图可以看出 ,
B o ts ra
p 抽样百分比的数值为 9 , 这说明它们的亲
缘关系十分接近 。 从优势等位基因及频率分布表中
可以看出(表4 ) , 这两种黄牛优势等位基因分布一
致 , 均为H A U T2 4 (122bp) 、 I L S S TS ( 2 6 0 b p ) 、 E T H 1 5 2
( 1 8 9 b p )
、
E T H 3 ( 川bp)、 I LS T S0 0 5 ( 1 8 2 b p ) 。 从历
史记录来看 , 韦文雅等仁’”〕在《广西家畜家禽品种
志》中记载:涸州居民多从雷州半岛和合浦县移入 ,
耕牛也随着移民带往该岛 。 从来源上看 , 涸州黄牛
来源于雷州半岛与广西西南部地区 。 从遗传距离
看 , 这两种黄牛的遗传距离很小 (D A = 0.058 ) , 因
此 , 涸州黄牛与徐闻牛应聚为一类 。 M ac hu gh 等[川
用 2 个微卫星位点分析 36 个不同品系的欧洲牛间
的遗传差异 , 并计算遗传距离 , 建立树状图 , 显示的
结果与已知各品系的历史一致 。
吉安黄牛产区位于江西省中部偏西 、赣江中游 。
吉安黄牛与涸州黄牛的遗传距离为 0.147 , 吉安黄
牛与徐闻牛的遗传距离为 0. 134 , 与其他黄牛的遗
传距离相比较 , 它们之间的遗传距离最小 , 这与聚类
图的划分也相一致 。 凉山黄牛分布于四川省凉山彝
族自治州和攀枝花市 。 川南山地牛产于四川盆地南
部边缘山区 。 凉山黄牛与川南山地牛的产区均以山
地为主 , 地理位置相差不远 , 且有交汇处 。 这两种黄
牛与关岭黄牛 、 昭通黄牛 、宣汉黄牛的遗传距离也较
为接近 , 且地理分布上同属于云贵川地区 , 因此聚类
图的划分—凉山黄牛与川南山地牛先相聚 , 再与上述三种黄牛相聚是比较合理的。
参 考 文 献
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( 上接第247 页)
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