全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
一株异养型亚硝酸盐氧化细菌的分离
及其降解特性的研究
李焱生 魏民 张艾晓 武斌 钟卫鸿
(浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州 310014 )
摘 要: 以亚硝酸盐和琥珀酸钠作为惟一氮、碳源从活性污泥中筛选分离一株能够高效氧化亚硝酸盐的硝化菌株, 并
对其形态学、生理生化及 16S rDNA同源性进行分析,在此基础上研究 pH、温度、转速、初始亚硝基氮的浓度以及盐浓度对其氧
化亚硝酸盐的影响。结果显示 ,在好氧条件下, 该菌株能在 12 h内将 356004 mg /L亚硝酸盐降解 99 53%。根据形态学特
征、生理生化特性以及 16S rRNA同源性分析, 初步将该菌株鉴定为施氏假单胞菌 (P seudom onas s tutzeri), 并将其命名为 LYS
86。该菌株氧化亚硝酸盐的最适 pH 8 0- 10 0, 温度 30 , 转速 180 r /m in,盐浓度 1 g /L。当培养基中初始亚硝酸盐浓度为
0 5 g /L时, 菌株 LYS86的硝化活性最高,随着培养基中初始亚硝基氮浓度的不断提高,菌株 LYS86的硝化活性会不断下降。
本研究利用硝化细菌选择性培养基从活性污泥中筛选到了一株异养型亚硝酸氧化菌菌株, 该菌株具有高效的硝化活性, 为今
后该菌株的实际应用及理论研究奠定了基础。
关键词: 亚硝酸盐氧化细菌 硝化活性 假单胞菌属 同源性分析 活性污泥
Isolation, Identification and Characterization of
a N itriteoxidizing Bacterium
L iYansheng W e iM in ZhangA ixiao Wu B in ZhongW e ihong
(College of B iological and Environmental Engineering, Zhejiang University of T echno logy, H angzhou 310014)
Abstrac:t A hetero trophic n itr iteox idizing stra in w ith h igh n itriteox id izing activ ity w as intended to be iso la ted from ac tivated
sludge and its optimum cu lture conditions for ox idizing n itrite w ere investigated to prov ide gu idance for Industr ia l m icrob ia l wastewa ter
treatment. U sing nitr ite and sodium succ inate as the so le carbon and n itrogen sources, a nitr ify ing stra in w ith h ighly n itr iteox idizing ac
tiv ity was isolated from activated sludge, the mo rpho log ica ,l physio log ica,l biochem ica l properties and 16S rDNA hom o logy analysis of
wh ich w ere investiga ted. In add ition, the influence o f pH, tem pe rature, shak ing speed, the initial concentra tion of nitrite, sa lt concen
tration and d ifferent carbon sources on n itrite ox idation w as a lso stud ied. Results show ed that a n itr ite ox id izing stra in w as iso la ted from
activated sludge. The n itrite rem oval effic iency w as up to 99 53% w ithin 12 h under the aerobic conditions w ith the initia lNO2N con
centration of 356004 mg /L. According to its m orpho log ica,l physiolog ica lb ioehem iea l character istics and 16S rDNA hom ology, this
stra in w as identified asP seudom onas stutzer i and nam ed LYS86, and the optim a l conditions o f culturewe re de term ined, includ ing opti
m al tem perature 30 , pH 8 0- 100, and sa lt concentration 1 g /L, respective ly. In add ition, the n itr ification ac tiv ity of th is strain
w as g reatly inh ib ited when in itia lNO
2
N concentration in medium was h igh. There fore, it proved that the heterotroph n itriteox id izing
stra in selected from activated sludge had h igh nitrifica tion ac tiv ity and cou ld be used for future industr ia l purpose.
Key words: N itr iteox idizing bacterium N itrification activ ity P seudom onas stutzer i H om o log ica l ana lys is A ctivated sludge
收稿日期: 20100317
基金项目:国家自然科学基金项目 (Y304091) ,浙江省自然科学基金项目 ( Y304091 )
作者简介:李焱生,男,在读硕士研究生,研究方向:环境微生物与基因工程; Em ai:l lihu iyao1986@ 163. com
通讯作者:钟卫鸿,博士,教授, 博士生导师,从事应用和环境微生物及基因工程技术方向研究; Em ai:l w hzhong@ zju t. edu. cn
近年来随着坏境污染的加剧, 水体污染的持续
恶化引起了人们的高度关注,这主要表现为自然界
水体中各种有害物质的积累威胁到了人们的健康,
例如,大量饮用含有过量亚硝酸盐的水可导致癌症。
2010年第 5期 李焱生等:一株异养型亚硝酸盐氧化细菌的分离及其降解特性的研究
同时水体中亚硝酸盐的过量积累也会对水生生物产
生较大的负面影响。因此筛选活性较高的微生物来
降解水中积累过多的亚硝酸盐对水质的净化显得十
分的重要 [ 1- 4]。
硝化作用是由硝化细菌的两个关键共生菌群相
互作用来实现的,分别是亚硝化细菌即氨氧化细菌,
利用体内的氨单加氧酶和羟胺氧还酶将氨氮转化为
亚硝酸盐,其中氨作为其惟一氮源;硝化细菌即亚硝
酸盐氧化细菌 ( N itr iteox id izing bacteria, NOB)利用
亚硝酸氧还酶将亚硝酸盐氧化为硝酸盐, 亚硝酸盐
作为唯一氮源 [ 5- 7]。其中亚硝酸盐氧化菌是由进化
上截然不同的 4类菌构成: 硝化杆菌属 (N itrobacter)
属于变形菌纲的 亚纲, 硝化球菌属 (N itrococcus)
属于 亚纲,硝化刺菌属 (N itrosp ina )属于 亚纲、
硝化螺菌属 (N itro sp ira )属于硝化螺菌门 ( phy lumN i
trosp ira)
[ 8]
, 由于这些菌株生长缓慢, 对废水中氨
氮的去除效率较低, 所需的处理周期较长等缺点
限制了它们在工业化处理氨氮废水中的大规模地
应用。近几年,随着研究的深入, 氨氧化菌被广泛
研究并取得了一定的成果, 而对亚硝酸盐氧化菌
的研究尚处于起步状态。亚硝酸盐氧化菌作为降
解水体中对生物体具有毒害作用的亚硝酸盐的关
键菌群,对分离高效氧化亚硝酸盐以及机制的研
究有着十分重要的意义。本研究利用选择性硝化
培养基从活性污泥中分离筛选到了一株硝化活性
较强的异养型亚硝酸盐氧化菌, 该菌株属于施氏
假单胞菌属 ( P seudomonas stutzeri), 这在国内外属
于首次报道, 是对亚硝酸盐氧化菌群的进一
步补充。
1 材料与方法
1. 1 材料
活性污泥取自取自稳定运行的生物转鼓反应器
系统。硝化细菌培养基 ( g /L ) : Na2HPO 4. 12H 2O
50; KH2 PO4 10; M gSO47H 2O 01; 琥珀酸钠 60;
N aNO2 05 g; 琼脂 20; 微量元素溶液 2 mL; pH
80。微量元素溶液 ( g /L ) : EDTA 500; ZnSO4
22; CaC l2 55; M nC l2 4H 2O 506; FeSO 4 7H2 O
50; ( NH 4 ) 6Mo7O24H2O 11; CuSO 45H2O 157;
CoC126H 2O 161; pH70。PCR引物由上海捷瑞公
司合成, Taq酶、PCR bu ffer、Mg2+及 dNTPs由 TaKa
Ra公司提供, 基因组 DNA提取和胶回收试剂盒试
剂盒由上海生工提供。其它试剂均为国产分析纯。
1. 2 硝化细菌的富集培养和分离纯化
从转鼓中取 1 g活性污泥投入 99 mL无菌水并
带有玻璃珠的三角瓶中,振荡使样品与水充分混匀。
再取 5 mL菌悬液加入到盛有 60 mL液体硝化细菌
培养基 150 mL的三角瓶中, 混匀后于 30 , 180 r /
m in培养 7 d,进行富集培养。每天分别向硝化菌培
养基中补充 1mo l/L NaNO 2 3mL。同时在培养过程
中取少量培养液加入二苯胺试剂遇培养液呈蓝色,
说明有硝化菌存在蓝色的深浅代表硝化细菌的硝化
能力强弱。每隔一个星期, 从上期培养液中吸出 5
mL培养液转入到新鲜的 60 mL的硝化细菌培养基
中; 连续培养四周后以稀释涂布法将培养液涂布到
分离平板上,置于 30 生化培养箱内培养直至平板
上长出清晰可见的菌落; 从平板上挑取单菌落转接
到新的平板上培养后保存 [ 9]。
1. 3 菌株的鉴定
将纯化好的菌株进行革兰氏染色, 同时观察
在光学和电子显微镜下细胞形态、大小及鞭毛有
无等状况。参照文献 [ 10]对分离的菌株进行初步
鉴定。将纯化好的硝化菌接种至硝化细菌培养基
中,过夜培养, 收集菌体并按照基因组提取试剂盒
的方法获得菌株的基因组 DNA用于 PCR扩增 16S rD
NA基因, 用通用引物 (正向引物 16S rDNAF: 5
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3; 反向引物 16S rDNA
R: 5AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3。以 基 因 组
DNA为模板 PCR扩增 16S rDNA基因。PCR反应体系
( 50 L):引物 16S rDNAF /R各 1L,模板 DNA 2 L,
10 PCR缓冲液 5 L, M gC l2 25mmo l/L 3 L, dNTP
25mmo l/L 25 L, Taq酶 5 U /L 05 L, 重蒸水
35 L。PCR程序: 94 预变性 5m in; 94 30 s, 56 退
火 30 s, 72 延伸 1 m in,经 35个循环后 72 延伸 10
m in。PCR产物经切胶回收试剂盒回收后与 pMD19T
载体连接,转化至 E. coli DH5宿主中,蓝白斑筛选阳
性转化子,从阳性转化子中提取质粒,鉴定正确之后送
至上海英骏生物有限公司测序。测序结果与 GenBank
中的 16S rDNA序列进行比对和同源性分析,并采用
NJ法构建系统进化树。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
1. 4 环境条件对硝化作用的影响
从斜面上挑取一环菌落接种至种子培养基中过
夜培养,再以 10%的接种量接入发酵培养中, 根据
试验要求,分别改变温度、pH、转速,碳源,盐浓度以
及培养基中初始的亚硝酸钠的浓度, 考察上述因素
对硝化菌去除亚硝基氮的影响。
1. 5 分析方法
亚硝酸盐含量的测定: N( 1萘基 ) 乙二胺光度
法 [ 11] ;硝酸盐含量的测定:紫外分光光度法 [ 11 ]。
2 结果与分析
2. 1 菌株的生理生化鉴定
采用硝化细菌培养基培养基从活性污泥中筛选
到了一株功能较强的亚硝酸盐氧化细菌, 该菌株在
培养 12 h之后能将 356004 mg /L亚硝基氮完全降
解 (图 1)。经革兰氏染色,镜检观察,该菌株为革兰
氏阴性杆菌 (图 2), 在 LB平板上菌落是粘着的, 有
特征性皱折,菌落呈红褐色, 电镜下可以观察到单极
生鞭毛 (图 3), 不产芽孢, 不发酵葡萄糖产酸产气,
吲哚试验和明胶液化试验均呈阴性, 淀粉水解试验
和接触酶试验均呈阳性阳性,综合菌落形态、革兰氏
染色以及生理生化特征, 参考 伯杰氏细菌鉴定手
册初步将该菌株鉴定为施氏假单胞菌属 (P seudo
monas stutzeri ), 并将该菌株命名为 LYS86。
2. 2 菌株 LYS86的 16S rDNA扩增和序列分析
以菌株 LYS86基因组 DNA 为模板, 分别为
16S rDNAF /R为引物扩增其 16S rDNA片段, 切胶
回收 15 kb左右基因片段,并将其连至 pMD19T载
体, 挑选阳性克隆进行 DNA序列测定。菌株 LYS
86的 16S rDNA序列的全长为 1 529 bp, 与 GenBank
数据库序列进行 B last比对,发现菌株 LYS86与施
图 1 菌株 LYS86以亚硝酸钠为惟一氮源进行硝化作用的情况
图 2 革兰氏染色的结果 ( 100 )
氏假单胞菌 ( P seudomonas stu tzeri )系统发生地位基
本相同,相似度达到 99%。从 GenBank中查找一些
与该菌株同源性高的典型菌株序列, 采用 C lustslX
图 3 透射电镜下的 LY S86菌株 ( 30 000 )
进行多序列匹配比对,通过 T reev iew 显示生成进化
树 (图 4)。结合形态学和系统发生分析结果将菌株
LYS86鉴定为施氏假单胞菌。
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2010年第 5期 李焱生等:一株异养型亚硝酸盐氧化细菌的分离及其降解特性的研究
2. 3 环境条件对菌株 LYS86硝化作用的影响
2. 3. 1 pH对菌株 LYS86硝化作用的影响 由于
硝化细菌的生长条件偏碱性, 但是它在氧化亚硝酸
盐的过程中生成了硝酸盐又降低了培养基中的 pH
值,所以对硝化细菌氧化亚硝酸盐的最佳 pH范围进
行研究显得十分必要 [ 12, 13] , 这可以为之后的工业化
应用奠定一定的基础。本研究考察了菌株 LYS86在
初始 pH为 60, 70, 80, 90, 100的硝化细菌培养
基中氧化亚硝酸盐的效果, 结果见图 5。从图 5中可
以看出,硝化细菌氧化亚硝酸盐的最适 pH值在 80
- 100之间, 这表明偏碱性的环境更有利于硝化细
菌硝化作用的进行,而酸性的环境会严重抑制硝化反
应的发生。出现这一现象,一方面可能是由于碱性条
件更有利于硝化细菌的生长代谢, 致使硝化细菌能够
大量繁殖。另外,在菌株 LYS86中进行硝化反应的
关键酶之一 亚硝酸氧还酶的最适 pH 值可能为
碱性,从而使得硝化作用的代谢强度较高,从而表现
出在碱性条件下氧化亚硝酸盐的能力更强。
图 4 菌株 LYS86基于 16S rRNA基因序列同源性的系统发育树
图 5 pH对 LYS86硝化活性的影响
2. 3. 2 温度对菌株 LYS86硝化作用的影响 温
度通过影响微生物体内酶的活性来影响微生物的生
长和代谢,只有在最适温度附近, 微生物才会表现出
良好的代谢活性。在温度低于一定值时,细胞膜呈
凝胶状态,营养物质的跨膜运输受阻,细胞会因饥饿
停止生长。随着温度的上升, 细胞内部的生化反应
加快,细菌生长加速; 但是超过一定的上限时, 对温
度敏感的组分会开始变性,细胞生长难于维持,甚至
导致细胞死亡。为了研究温度对硝化细菌氧化亚硝
酸盐的影响, 考察了菌株 LYS86在 25 , 30 和
37 三种温度下氧化亚硝酸的能力, 结果如图 6所
示。结果表明,当温度为 30 时,菌株 LYS86硝化
作用最强, 温度高于或低于此温度都不利于菌株
LYS86硝化作用的进行。在提高温度的过程中, 硝
化细菌的生长可以逐步的加快, 但达到最大值之后
再升高温度将会抑制菌的生长,加速菌的衰老,因此
影响硝化细菌氧化亚硝酸盐的能力。另外硝化过程
本身就是由一系列的酶促反应构成的,在此过程中
起关键作用的酶为亚硝酸氧化还原酶 Nor[ 14, 15] ,
按照酶抑制理论,酶促反应都有一个最适作用温度,
当温度低于最适温度时,随着温度的升高,酶促反应
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
速度加快, 当温度高于最适温度时, 随着温度的升
高,酶促反应速度就会降低,酶的失活速度加快。本
研究中菌株 LYS86在 30 下,硝化活性最好。
图 6 温度对 LYS86硝化活性的影响
2. 3. 3 转速对菌株 LYS86硝化作用的影响 有
研究表明,在培养过程中, 溶解氧的变化对硝化细菌
的生长和硝化能力影响较大 [ 16- 18 ]。为了研究溶解
氧对菌株 LYS86氧化亚硝酸盐的影响,考察了亚硝
酸盐氧化菌菌 株 LYS86 在 转速为 0 r /m in,
120 r /m in以及 180 r /m in 3种培养条件下氧化亚硝
酸盐的能力,结果如图 7所示。结果表明,当转速为
180 r /m in时,菌株 LYS86在培养 10 h之后亚硝基
氮的去除率达到了 986%, 而转速为 0 r/m in和
120 r /m in,去除率分别只有 598%和 743% ,这表
明随着转速的提高, 亚硝酸盐的的去除速率越快。
由于转速与培养液中的富氧速率成正比关系, 所以
该试验说明菌株 LYS86在氧充足的条件下硝化活
性较强,对氧气需求量有较严格的要求。从本试验
以及它关于假单胞菌的生理生化特性报道中均证明
该类军中属于典型的好氧菌。
图 7 转速对 LYS86硝化活性的影响
2. 3. 4 初始亚硝基氮浓度对菌株 LYS86硝化作用
的影响 很多物质在低浓度时可以用作基质, 但在
高浓度时则成为抑制剂, 抑制细菌的生长并干扰细
菌的代谢。NO2 N作为亚硝酸盐氧化细菌生长过程
中惟一的氮源, 培养基中 NO 2N的浓度对亚硝酸盐
氧化细菌的生长至关重要。NO2 N浓度过低, 不能
满足菌体正常生长的需求,浓度过高,会对细胞的生
长产生毒害作用, 同时还会通过底物抑制作用抑制
硝化反应中关键酶的活性, 从而影响硝化细菌的硝
化活性 [ 19]。考察了不同初始 NaNO 2浓度对硝化细
菌去除亚硝基氮的影响, 结果如图 8所示。结果表
明, 随着培养基中初始亚硝基氮含量的升高,硝化细
菌的硝化活性会不断下降, 这可能是由于硝化反应
中关键酶受到底物抑制以及 NO2 N浓度过高对细
胞产生较严重的毒害双重效应造成的。
2. 3. 5 盐浓度对菌株 LYS86硝化作用的影响 由
于实际的氨氮废水中含有一定的盐浓度,而微生物
对盐的耐受程度又是一定的。为了更好地模拟实际
的氨氮废水处理过程,为后续的工业化应用过程提
供一定的参考,考察了菌株 LYS86在不同的盐浓度
下氧化亚硝酸盐的能力, 试验结果如图 9所示。试
验结果表明,适度的盐浓度对硝化细菌氧化亚硝酸
盐具有一定的促进作用, 但是盐浓度过高反过来又
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2010年第 5期 李焱生等:一株异养型亚硝酸盐氧化细菌的分离及其降解特性的研究
会抑制硝化反应的进行。本研究中, 1 g /L的盐浓
度对于菌株 LYS86氧化亚硝酸盐效果最佳,当盐浓
度提高到 5 g /L时,硝化反应显著被抑制。盐浓度
主要是通过影响细菌细胞内外部渗透压的平衡从而
来影响微生物的生长和代谢,盐浓度过大会导致微
生物细胞面临的外部渗透压也会很大, 此时细胞会
因为失水过多而影响其生长代谢甚至会导致细胞
死亡。
图 8 初始的亚硝基氮浓度对菌株 LYS86硝化活性的
图 9 盐浓度对菌株 LYS866硝化活性的影响
3 讨论
目前,国内外对氨氧化菌的研究已经比较深入,
也取得了很大进展,但是, 亚硝酸盐氧化菌在水体治
理过程中的作用同样不容忽视,在这一方面国内外
对其研究还不够,另外国内外报道的亚硝酸盐氧化
菌株主要集中在自养性微生物上, 但由于这些菌株
具有自养性,生长缓慢,世代时间长, 在水体中的自
然数量受到限制, 这些缺陷都限制了它们在净化水
体过程中获得广泛应用, 而异养型亚硝酸盐氧化菌
菌株生长速率快, 对环境的适应能力强使得其重要
性正日益受到关注 [ 20, 21]。本研究从生物转鼓反应
器中的污泥中分离筛选到了一株硝化活性较高的亚
硝酸盐氧化菌,该菌株在好养条件下培养 12 h之后
可以将 356004mg /L亚硝基氮完全降解。经生理
生化和 16S rDNA鉴定发现该菌株与施氏假单胞菌
(P seudomonas stu tzeri)具有较高的同源性, 这与之前
所报道的硝化杆菌属 (N itrobacter ), 硝化球菌属 (N i
trococcus) , 硝化刺菌属 (N itrosp ina )、硝化螺菌属
(N itrosp ira )完全不同,是对亚硝酸盐氧化菌菌群的
补充。另外该菌株氧化亚硝酸盐受外界条件影响较
大, 如 pH,温度,盐浓度, 溶解氧浓度等会显著影响
其硝化活性的高低,这可能均与硝化途径中的关键
酶的活性高低密切相关。试验结果表明该菌株氧化
亚硝酸盐的最适 pH,温度, 转速, 盐浓度分别为 80
- 100, 30 , 180 r /m in和 1 g /L;当培养基中初始
亚硝酸盐浓度为 05 g / l时, 菌株 LYS86的硝化活
性最高,随着培养基中初始亚硝基氮浓度的不断提
高, 菌株 LYS86的硝化活性会不断下降。
参 考 文 献
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(上接第 191页 )
guilliermond ii TT009)为出发菌株, 对该菌株的原生
质体进行紫外诱变, 再生, 初选, 摇瓶复选, GDL产
量达到 125 g /L, 比诱变前提高了 288%。由此可
见,用原生质体紫外诱变的方法提高 GDL产量效果
比较显著,为今后的研究提供了一定的参考。
参 考 文 献
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