全 文 ：第 25卷第 6期
2005年 6月
生 态 学 报
ACTAECOLOGICASINICA
Vol.25,No.6
Jun.,2005
变性梯度凝胶电泳法研究我国不同土壤
氨氧化细菌群落组成及活性
袁 飞,冉 炜,胡 江,沈其荣*
(南京农业大学资源与环境科学学院,南京 210095)
基金项目:国家自然科学基金资助项目(40271098,40471074)
收稿日期:2004-03-23;修订日期:2004-09-19
作者简介:袁飞(1974～),女,江苏南通人,博士,主要从事土壤微生物研究.
*通讯作者 Authorforcorrespondence.E-mail:shenqirong@njau.edu.cn
Foundationitem:NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.40271098,40471074)
Receiveddate:2004-03-23;Accepteddate:2004-09-19
Biography:YUANFei,Ph.D.,mainlyengagedinmicrobiologyinsoil.
摘要:实验选用了我国 3种不同土壤研究土壤硝化活性、硝化细菌数量,并使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法研究了不同
土壤中氨氧化细菌(AOB)区系变化。通过 28d的土壤培养实验研究发现,潮土具有最强的硝化势,几乎 100%的铵态氮转化为
硝态氮;而红壤中的硝化势最弱,只有 4.9%的铵态氮转化为硝态氮。对这 3种土壤硝化细菌进行计数发现,3种土壤氨氧化菌
数 量差异显著,而 3种土壤亚硝酸氧化菌(NOB)处于一个数量级。采用氨氧化菌功能基因 amoA(氨单加氧酶 ammonia
monooxygenase)特异 PCR结合DGGE的方法对土壤氨氧化菌区系进行分析。红壤有4个氨氧化菌种属,与潮土和黄泥土没有
共同的氨氧化菌种属。4个种属中两个是与潮土和黄泥土亲源性比较远的,特有的氨氧化菌种属,这两个种属与已知的
Nitrosospira属的 cluster3bz97838和 Nitrosospira属的 cluster3aAF353263亲源性比较近。潮土有 5个氨氧化菌种属,潮土与黄
泥土有两个共同的氨氧化菌种属,这两个种属中的一个是潮土和黄泥土特有的,与其他氨氧化菌种属亲源性比较远的氨氧化菌
种属,这个种属与已知的Nitrosospira属的cluster3bZ97849亲源性比较近。黄泥土有 4个氨氧化菌种属,除了与潮土共有的一
个种属是两种土壤特有的氨氧化菌种属外,黄泥土还有一个与其他氨氧化菌种属亲源性比较远的,黄泥土特有的种属,与
Nitrosospira属的 cluster3aAF353263亲源性很近。3种土壤中分离到的硝化细菌表现出不同的硝化能力。实验结果表明,以
amoA基因为目标的 PCR-DGGE是比以 16SrDNA为目标的 PCR-DGGE更有效的研究氨氧化菌种群的方法;3种土壤的氨氧
化菌种群差异显著,尤其是红壤的氨氧化菌种群与另外两种土壤差异明显,这种差异可能与红壤的低 pH条件对氨氧化菌种群
的长期选择有关;3种土壤中的硝化活性与土壤中的硝化细菌数量没有显著相关,可能由于 3种土壤差异显著的土壤环境对硝
化活性的影响造成。因此在对不同土壤硝化细菌进行研究时不仅需要对硝化细菌数量进行研究,还需要研究不同土壤中硝化细
菌的种属及不同土壤环境条件对硝化细菌硝化活性的影响。
关键词:变性梯度凝胶电泳法;土壤;硝化活性;氨氧化菌
文章编号:1000-0933(2005)06-1318-07 中图分类号:S154.1,S154.37 文献标识码:A
Ammonia-oxidizingbacteriacommunitiesandtheirinfluenceonthenitrification
potentialofChinesesoilsmeasuredbydenaturinggradientgelelectrophoresis
(DGGE)
YUANFei,RANWei,HUJiang,SHENQi-Rong* (CollegeofNaturalResourcesandEnvironmentalScience,Nanjing
AgriculturalUniversity,Nanjing210095,China).ActaEcologicaSinica,2005,25(6):1318～1324.
Abstract:Nitrificationisanimportantcomponentoftheglobalnitrogencycleandtheend-productisnitrateandtherateof
nitrateproductionisverydifferentamongsoiltypes.Nitrificationcanleadtodifferenteffectsrangingfromtoomuchnitrate,
causingenvironmentalproblems,ortoolittlenitratecanleadtoreducedcropyields.Differencesinphysicalandchemical
propertiesofsoilsareoftenweldocumented,butmuchlessisknownaboutthesoilnitrifyingbacterialcommunities.
===================================================================
We
studiedthreesoilsofChinatodeterminetheirsoilnitrificationactivities,numbersofnitrifyingbacteria,andtheammonia-
oxidizingbacterialcommunity.MaximumnitrificationpotentialwasfoundinFluvoaquicsoilwithalmost100% ofammonium-
Nbeingtransformedintonitrate-Nafter28days.MinimumnitrificationpotentialwasmeasuredintheRedEarthsoilwithonly
a4.9% conversionrateduringthesametimeperiod.Numbersofammonia-oxidizingbacteria,determinedbytheMPN-Griess
method,weresignificantlydifferentamongthethreesoils.However,numbersofnitrite-oxidizingbacteriadeterminedbythe
MPN-PCRmethodweresimilar.APCRtechniqueusingtheammoniamonooxygenasegene(amoA)combinedwiththenew
DNA fingerprintingtechnique,denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE),wereusedtoanalyzethecompositionof
ammoniaoxidizingbacteriainsoils.DGGEanalysisofthethreesoilsweredifferentfrom eachother;therewere2similar
bandspresentinDGGEcolumnsfromtheFluvo-aquicsoilandthePermeablepaddysoil,butnosimilarbandswerefoundin
columnsfrom RedEarthsoil.FurtherstudyofthesequenceofamoA indicatedthatthereweredifferencesofammonia-
oxidizingbacteriacommunitiesamongthethreesoils.AphylogenetictreeincludingtheamoAstudiedinthispaperandamoA
from otherenvironmentsthedatabasewasestablished.TherewerefourspeciesofAOBfoundinRedEarth,bothwere
differentfrom theothertwosoilsstudied.Furthercomparisonshowedthatthesetwospecieswerecloselyrelatedto
Nitrosospiracluster3bZ97838andNitrosospiracluster3aAF353263,respectively.TherewerefivespeciesofAOBfoundin
Fluvo-aquicsoilandtwooftheseweresimilartothosefoundinthePermeablepaddysoil.Fluvo-aquicsoilandPermeable
paddysoilhadaspecificspecieswhichwascloselyrelatedtoNitrosospiracluster3bZ97849.TherewerefourspeciesofAOB
foundinPermeablepaddysoil,andoneofthemwasspecificspeciesforPermeablepaddysoilandthiswascloselyrelatedto
Nitrosospiracluster3aAF353263.Thenitrificationactivitiesofnitrifiersselectedfromthesethreesoilsweredifferent.Althe
resultsobtainedfromthisexperimentimpliedthatPCR-DGGEbasedontheamoAgenewasausefulmethodtostudyAOB
communitiesinsoils.EachsoilcontainedspecificAOBspeciesdifferentfromtheothers.Furthermore,theAOBoftheRed
Earthwereparticularlydifferentfromtheothertwosoils,whichmightberelatedtothelowpHofthissoil.Therewasno
relationshipbetweenthenitrificationpotentialandnitrifyingbacterianumbersofsoilsandthismightbeexplainedbythe
differentphysicalpropertiesofthesoils.
Keywords:denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE);soil;nitrificationactivity;ammoniaoxidizingbacteria
硝化作用影响环境中 NH+4 和 NO-3 水平[1]以及农田土壤的肥力水平[2],研究不同土壤中硝化作用具有重要的农学意义和
环境意义。硝化作用由两步反应组成,分别由氨氧化菌(AOB)和亚硝酸氧化菌(NOB)完成[3],其中第一步反应是硝化过程限速
步骤,所以目前对硝化细菌的研究大多针对氨氧化菌。由于使用常规的微生物培养方法研究硝化细菌时遇到了困难[4],并且传
统培养方法无法避免培养分离菌株与环境中实际存在菌株的差异[5],所以近期使用分子生物学手段研究硝化细菌,例如变性梯
度凝胶电泳(DGGE)技术[6～8]。本实验选用了我国 3种土壤,研究不同土壤硝化活性、硝化细菌数量和氨氧化细菌种群,以阐述
不同土壤硝化活性与硝化微生物之间的内在联系。
1 材料与方法
1.1 供试土壤
取表层土壤面(0～20cm),土壤基本理化和生物性状见表 1。红壤(Redearth)采自江西鹰潭,潮土(Fluvo-aquicsoil)采自江
苏宿迁,黄泥土(Permeablepaddysoil)采自江苏无锡。
表 1 供试土壤理化和微生物性状
Table1 Selectedchemicalandmicrobiologicalpropertiesofthesoilstested
供试土壤
Soil
pH
有机质 O.M.
(g/kg)
全氮 TotalN
(g/kg)
NO-3-N
(mg/kg)
NH+4-N
(mg/kg)
细菌 Bacteria
(107/gsoil)
真菌 Fungi
(103/gsoil)
放线菌 Atinomyce
(105/gsoil)
潮土 Fluvo-aquicsoil 8.2 9.8 0.73 30 17 3.0 0.7 1.3
黄泥土Permeable-paddysoil 7.0 12.6 0.58 20 3.0 60.3 2.3 12.0
红壤 Redearth 5.8 8.3 0.39 12 8.0 1.0 21.0 5.0
1.2 土壤硝化能力测定
将 154mgofN/kgdrysoil(280kgofN/hm2)用量的(NH4)2SO4加入装有 33g新鲜土壤(过筛<4mm)的广口瓶中,加入
水达到 60% WFPS(water-filedporespace),28℃黑暗培养 28d。广口瓶盖子扎孔后盖上,培养前称重。培养的 28d中,每 3d称
重,补充损失的水分,使水分保持 60%WFPS。每周测定 NH+4、NO-2 和 NO-3 浓度,以土壤中 NO-3 和 NO-2 浓度之和占 NH+4、
91316期 袁 飞等:变性梯度凝胶电泳法研究我国不同土壤氨氧化细菌群落组成及活性
NO-2 和 NO-3 浓度之和的百分数表示土壤硝化势[9]。
1.3 土壤 DNA提取
采用改进的 Yeates等人[10]的酶裂解法提取土壤中的 DNA。取 5g新鲜土壤加入离心管中,加入 10ml含蛋白酶 K(pro-
teinaseK)的抽提缓冲液。37℃,180r/min,培养 1h后加入 SDS60℃再培养 1h。离心收集上清,沉淀用抽提液重复上述步骤进
一步抽提,离心,收集上清与前次上清混合。上清使用饱和酚/氯仿/异丙醇混合液处理后,加乙醇静置,离心,轻轻倒去上清,于
室内自然风干,最后溶解于 0.5mlTE。
1.4 土壤硝化细菌计数
AOB使用 MPN-Griess法计数[9],NOB使用 MPN-diphylamine法[9]和 MPN-PCR法计数[11]。样品以 1:10比例进行梯度
稀释,3个重复,最后从 Cochran表查出硝化细菌的数量。土壤中提取的 DNA和 PCR扩增后的 DNA分别使用 0.8%和 2%琼
脂糖(wt/vol)电泳,TBE缓冲液。EB染色后在成像系统(BIO-RAD,Bio-RadLaboratories,America)下观察。
1.5 多聚酶链式反应(PCR)
土壤中提取到的 DNA使用氨氧化菌特异的 amoA引物对 amoA-1FandamoA-2R[8]进行 PCR,amoA-1F5端加 GC夹
子[12](CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG)。反应体系为:0.5µmol/L引物,1UTaqDNA
polymerase,PCR缓冲液,400µmol/LdNTP,模板 DNA(1µl),终体积 50µl。反应的步骤:94℃,2.5min;30循环 94℃30s,55℃
30s,72℃ 90s;72℃,5min。
1.6 变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析及片断序列测定
PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶,45% (6%[wt/vol]acrylamide-bisacrylamide[37.5:1];18% deionizedformamide,3.1
mol/Lurea)到 65% (6% [wt/vol]acrylamidebisacrylamide[37.5:1];26% deionizedformamide,4.5mol/Lurea)浓度梯
度。胶在DGENETM系统(Bio-Rad)中进行电泳,0.5×Tris-acetate-EDTA缓冲液,60℃,100V,电泳 17h。EB染色后,在成像
系统(BIO-RAD,Bio-RadLaboratories,America)下观察结果。
从 DGGE胶上切下电泳条带,震荡溶解到灭菌的去离子水中,再次 PCR扩增。PCR产物溶于大约 20µl灭菌的去离子水
中。纯化的条带用于由上海博雅生物技术公司予以测序。与已经报道的部分 amoA基因序列[13～15]进行比较,系统分类及分子
进化分析使用 MEGAversion2.0软件绘制系统树。
1.7 土壤氨氧化菌硝化能力
使用无机液体培养基(LM)对土壤氨氧化菌进行分离纯化培养。取 10g土壤(潮土,黄泥土,红壤)加入装有 100ml灭菌培养
基的 250ml三角瓶中。180r/min,26℃,黑暗培养 14d后,将 10ml培养液转接到 100ml含 5mmol/LNH+4-N的磷酸缓冲液(pH
5.8,7.0,8.0),同上条件培养 14d后,测定 NH+4、NO-2、NO-3 浓度。由于该方法纯化出来的氨氧化菌一直伴随有亚硝酸氧化
菌,产生的亚硝酸盐立即氧化为硝酸盐。所以以土壤中NO-3 和NO-2 浓度之和占NH+4、NO-2 和NO-3 浓度之和的百分数表示不
同土壤分离出的氨氧化细菌硝化能力。
图 1 不同土壤硝化势动态变化
Fig.1 Changesinnitrificationpotentialofdifferentsoilswith
incubationtime
1.8 土壤 NO-3-N和 NH+4-N的测定
用 2mol/LKCl以 1:4(wt/vol)比例浸提土壤,用 Bran+LUEBBE流动分析仪(Bran+LUEBBE,America)测定浸提液
的 NO-3-N和 NH+4-N浓度[16]。所有数据测定 3次作为测定平均值。
1.9 数据分析
数据采用 SPSS数据分析软件(SPSS,1999)。
2 结果与分析
2.1 不同土壤的硝化能力
在 28d培养结束时,潮土表现出最强的硝化能力,几乎
100%的 NH+4-N转化为 NO-3-N,其中在培养 7d后就有 60%的
NH+4-N转化为 NO-3-N,而红壤的硝化能力最弱,只有 4.9%的
NH+4-N转化为 NO-3-N,黄泥土的硝化能力介于两者之间,且在
培养 14d后随时间硝化能力上升迅速,到培养结束时已有 75%
的 NH+4-N转化为 NO-3-N(图 1)。
2.2 不同土壤硝化细菌计数
不同土壤中的氨氧化菌和亚硝酸氧化菌数量见表 2。采用
MPN-Griess法计算 3种土壤中氨氧化菌数量,3种土壤氨氧化
菌数量处于不同的数量级,差异显著。其中黄泥土中氨氧化菌最
0231 生 态 学 报 25卷
图 2 不同土壤 amoA基因 PCR产物 DGGE分析结果
Fig.2 DGGEanalysisofamoAfragmentsretrievedfromdifferent
soils
图 中 标 注 数 字 条 带 用 于 序 列 测 定 Thenumberofthebands
correspondtothefolowingsequencesanalyze(Fig3onright);F:
潮土;P:黄泥土;R:红壤 F:Fluvo-aquicsoil,P:Permeablepaddy
soil,R:Redearth
表 2 不同土壤中硝化细菌的数量
Table2 Countsofnitrifyingbacteriaindifferentsoils
土壤 Soil
AOBa
(No./gsoil)
NOBb
(No./gsoil)
潮土 Fluvo-aquicsoil 2.5×105 2.5×104
黄泥土 PermeablepaddySoil 4.5×107 2.5×104
红壤 Redearth 9.5×104 2.5×104
aAOB数量由 MPN-格式法测定 NumbersofAOBspergramof
drysoilwereobtainedbyMPN-Griessmethod;bNOB数量由 MPN-
PCR法测定 NumbersofNOBspergramofdrysoilwereobtainedby
MPN-PCRmethod
多,达到 107/gdrysoil;潮土其次,105/gdrysoil;红壤最小,
104/gdrysoil。采用 MPN-PCR法计算土壤中亚硝酸氧化菌,
3种土壤亚硝酸氧化菌数量没有差异。
2.3 不同土壤中氨氧化菌区系
图 2为 3种土壤中 DNA进行 AOB特异的 amoA基因扩
增后的 DGGE图谱,每种土壤都作了两次重复。3种土壤的
amoA扩增序列的 DGGE图谱有 11条条带,并且 3种土壤都
含有 4条以上条带,潮土有条带 3、6、7、8和 9;黄泥土有条带
2、3、9和 11;红壤有条带 1、4、5、10。由于每种土壤都作了两次
重复,对条带进行分析时只选在两次重复的 DGGE图谱中都
出现的条带进行研究。潮土和黄泥土的 DGGE图谱具有条带
3和条带 9两条相同条带,而红壤的 DGGE图谱与这两种土
壤的DGGE图谱没有共同条带。为了更好地了解这 11条条带
之间的相互关系,需要对这些条带进行序列分析。
将这 11条条带序列与 genbank中的氨氧化菌 amoA基因
序列一起使用 MEGA软件进行系统树分析(图 3)。所有 11条
条带之间的相似性都小于 99%(遗传距离大于 0.01),因此没
有条带的核苷酸序列是完全相同的。条带 3、4、5、6、7、8、11间
的相似性超过 90%(遗传距离小于 0.1)。其余的条带(1、2、9、
10)间的相似性都低于 90%(遗传距离大于 0.1)。条带 9和条
带 10间的相似性低于 65%,条带 9、10与其余条带间的相似
性低于 60%。
所有的 11条条带与 Nitrosospira属的 cluter1和 cluster3
的序列具有高度相似性。
对红壤图谱进行分析,发现,红壤图谱与潮土和黄泥土的
图谱没有共同条带。红壤图谱中的条带 1和条带 10与其余条
带间的相似性低于 90%,尤其是条带 10与其余条带的相似性
低于 65%,条带 1、10是红壤特有的条带。红壤图谱条带 10与
Nitrosospira属的 cluster3bz97838亲源性比较近,条带 1与
Nitrosospira属的 cluster3aAF353263亲源性比较近。
对潮土图谱进行分析,发现,潮土图谱与黄泥土图谱有共
同条带 3、9。潮土和黄泥土图谱共有的条带 9与其余条带的相
似性低于 65%,是潮土和黄泥土特有的条带,与 Nitrosospira
属的 cluster3bZ97849亲源性可能比较近。
对黄泥土图谱进行分析,发现,除了与潮土图谱共有的条
带9外,黄泥土图谱中的条带 2与其余条带的相似性低于 90%,为黄泥土特有的条带,与 Nitrosospira属的 cluster3a
AF353263亲源性很近。
根据变性梯度凝胶电泳(DGGE)对不同 DNA片断分离原理,可知 3种土壤样品的 PCR产物中含有数目不等的不同的
DNA片断,它们就是氨氧化菌的 DNA片断。
从上述结果可知,红壤有 4个氨氧化菌种属,红壤与潮土和黄泥土没有共同的氨氧化菌种属。红壤有与潮土和黄泥土的氨
氧化菌种属亲源性较远,特有的两个氨氧化菌种属,这两个种属与已知的 Nitrosospira属的 cluster3bz97838和 Nitrosospira属
的 cluster3aAF353263亲源性比较近。但是红壤与潮土和黄泥土也有相似性大于 90%的两条条带,因此红壤也有与潮土和黄泥
土亲源性很近的两个氨氧化菌种属。
潮土有 5个氨氧化菌种属,潮土与黄泥土有共同的两个氨氧化菌种属。这两个种属其中一个种属是潮土和黄泥土特有的,
与红壤的氨氧化菌种属亲源性较远的氨氧化菌种属,这个种属与已知的 Nitrosospira属的 cluster3bZ97849亲源性可能比较
近。潮土的另外 4个种属与红壤和黄泥土种属亲源性都比较近。
12316期 袁 飞等:变性梯度凝胶电泳法研究我国不同土壤氨氧化细菌群落组成及活性
图 3 DGGE图谱的相似性分析(条带号与图 2对应)
Fig.3 SimilaritiesbetweenDGGEbandsof3soils.(Thenumber
ofthebandscorrespondtoDGGEprofilesofFig.2)
黄泥土有 4个氨氧化菌种属,黄泥土除了与潮土共有的一
个种属是两种土壤特有的氨氧化菌种属外,黄泥土还有一个种
属是黄泥土特有的,与Nitrosospira属的cluster3aAF353263亲
源性很近。黄泥土的另两个种属与红壤和潮土种属的亲源性都
比较近。
2.4 不同土壤中氨氧化菌的硝化能力
3种土壤中分离到的氨氧化菌在相同 pH(5.8,7.0,8.0)条
件下硝化势差异不显著(图 4),但是从黄泥土(pH7.0)分离到的
氨氧化菌在 pH7.0缓冲液中硝化势为 31.50%,从潮土(pH8.0)
分离到的氨氧化菌在 pH8.0缓冲液中硝化势为 42.36%,从红
壤 (pH5.8)分离到的氨氧化菌在 pH5.8缓冲液中硝化势为
27.82%。可见,3种土壤硝化细菌在与土壤环境 pH近似的缓冲
液中硝化势差异显著,从红壤中分离到的氨氧化菌硝化势最小,
潮土氨氧化菌硝化势最大,黄泥土氨氧化菌介于两者之间。从图
4还可以看到 3种土壤分离到的氨氧化菌随着 pH升高硝化势
增加,但是不同土壤氨氧化菌对 pH表现出不同的反应,潮土
(pH8.0)在 pH低于 7(5.8和 7.0)的缓冲液中硝化势差异不大,
但是在 pH8.0时硝化势增加极显著;而黄泥土和红壤没有如此明显。
图 4 不同 pH条件下 3种土壤氨氧化菌硝化势比较
Fig.4 NitrificationpotentialofAOBinthreesoilsunderdifferent
pHcondition
3 讨论与结论
3.1 应用 amoA基因 PCR和 DGGE技术研究不同土壤氨氧化
菌种群差异
所有自然环境中对紫细菌门 β和 γ亚门的氨氧化菌的多样
性分析以往都是基于 16SrDNA序列差异进行的[17],但是对于
氨氧化菌这类细菌来说,仅仅基于 16SrDNA序列是远远不够
的[18],所以近期的研究开始将 amoA序列分析应用其中[11,19,20]。
amoA 基因负责编码氨单加氧酶(ammoniamonooxygenase
AMO)的 α亚基,是所有好氧氨氧化菌中的重要酶,催化氨氧化
到羟胺的过程[21],是硝化过程的限速步骤。不同氨氧化菌 amoA
基因序列差异比 16SrDNA序列差异大[22],因此对于研究氨氧
化菌这种在复杂的土壤环境中数量不多的自养细菌,基于 amoA
基因序列分析的方法比基于 16SrDNA序列分析的方法针对性
更强,提供的信息也更多,更适合用于分析氨氧化菌这类种间亲缘关系很近的种群研究[23,24]。从本实验可以看到,将本次实验
结果与以往用 16SrDNA序列分析得出的系统分类结果比较,所有的种群都属于 cluster1和 cluster3,但是 3种土壤的 DGGE
图谱确实存在明显差异,并且序列分析结果也表明 3种土壤氨氧化菌种群不同,其中 cluster3a和 cluster3b差异显著。可见,
amoA基因 PCR与 DGGE连用,是比 16SrDNAPCR与 DGGE连用研究氨氧化菌种群更灵敏的方法。
本实验中的 3种土壤氨氧化菌与Nitrosospira属的cluter1和cluster3具有高度亲源性,这结果与以往的结论"土壤环境中
硝化细菌以 Nitrosospira属为主,而非 Nitrosomonas属"[4,18]相一致。3种不同土壤具有相近或相同的氨氧化菌,又都有各自特
殊的氨氧化菌。其中红壤中的氨氧化菌种属比潮土和黄泥土氨氧化菌种属差异更大。Kowalchuk等人[18,25]和 Stephen等人[2,26]
研究表明在大多数酸性土壤中,Nitrosospira是最普遍的 AOB种属,并且酸性环境选择性适合 Nitrosospiracluster2。但是
Hastings等人[27]研究表明在 Nitrosomonas是酸性森林土壤中主要的 AOB种属。Bruns等人[6]和 Mendum等人[28]研究表明
Nitrosospiracluster3是大多数中性好气农田土壤中主要的 AOB种属,并且当农田土壤停止施肥后 AOB种属从 Nitrosospira
cluster3为主变为以 Nitrosospiracluster4为主。不同的土壤中 AOB种属不同,主要与土壤环境不同有关,其中土壤 pH是最重
要的影响因素[18],不同土壤 AOB种属可能就是不同的土壤环境对 AOB种属长期选择的结果。
3.2 不同土壤硝化能力及其硝化细菌数量
土壤培养实验结果表明 3种土壤硝化能力差异显著,尤其是红壤表现出极低的硝化活性,这与以往的报道结果一致[19],也
与自然界中红壤中硝酸盐含量极低的现象相一致。土壤硝化活性与硝化细菌活性有关。从土壤分离到的硝化细菌在不同 pH缓
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冲液中进一步培养发现,在与土壤 pH条件接近的情况下,潮土硝化细菌硝化能力最高,黄泥土其次,红壤最小。
将土壤氨氧化菌和亚硝酸氧化菌数量与土壤硝化活性进行比较后发现,硝化活性最强的潮土中氨氧化菌数量并不是最多
的,而是黄泥土中的氨氧化菌数量最多,而所有土壤中的亚硝酸氧化菌数量没有差异。土壤中的硝化作用活性与土壤中的硝化
细菌数量没有显著相关,有人将这种现象作为土壤中异养型硝化作用存在的证明[18],但是 Kowalchuk和 Stephen[18]也提到土
壤中硝化细菌种属差别很大,不同种属的硝化细菌可能硝化活性不同,从而可能导致土壤中硝化活性差异。Nannipieri等人[29]
认为,土壤中微生物的数量并不能代表土壤真正的功能,相同数量的土壤微生物在不同的土壤条件下表现出的活性差异很大。3
种土壤差异显著的理化性状可能影响了硝化细菌活性,因此在对不同土壤硝化细菌进行研究时不仅需要对硝化细菌数量进行
研究,还有研究不同土壤中硝化细菌的种属及不同环境条件对硝化细菌硝化活性的影响。
3种土壤中亚硝酸氧化菌数量没有差异。Degrange等人[11]也发现硝化势差异很大的土壤亚硝酸氧化菌数量并没有差异。
现有的一些研究发现土壤中亚硝酸氧化菌数量通常在 104～106这个数量级上,而且各种不同土壤中亚硝酸氧化菌数量差异不
大,不象不同土壤间氨氧化菌数量差别很大。这可能与采用的研究方法有关,通常使用 MPN-二苯胺方法进行检测,本实验初期
也采用二苯胺对产生的硝酸根离子进行检测,但是经过 3周的培养后,所有的试管(最高稀释 109)检测都呈蓝色,因为在有些情
况下亚硝酸根离子也会与二苯胺反应产生蓝色反应,所以通常还要继续培养至亚硝酸氧化菌将所有的亚硝酸根离子全都消耗
后再在测定不存在亚硝酸根的条件下测定硝酸根的存在,才可以确定为阳性反应管。这通常需要 2个月以上的时间,耗时太长。
随着分子生物学方法的引入,现在采用 MPN-PCR的方法测定亚硝酸氧化菌的数量。这种方法设计的引物都是主要针对
Nitrobacter,这种方法认为土壤环境中的亚硝酸氧化菌主要是 Nitrobacter,其他种属即使存在也可以用这种引物进行检测。现
在发现,在一些环境中存在着其他种属的亚硝酸氧化菌,而设计的这种引物对不同种属的亚硝酸氧化菌的检出率到底怎样,还
没有得到验证。MPN-PCR的方法无疑克服了培养过程产生的很多困难,是测定亚硝酸氧化菌的一种可行方法。
References:
[1] TroelstraSR,WagenaarR,DeBoerW.NitrificationinDutchheathlandsoils Ⅰ.Generalsoilcharacteristicsandnitrificationin
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