全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
植物基因表达转录分析中内参基因的选择与应用
牙库甫江·阿西木 关波 张富春
(新疆大学生命科学与技术学院 生物资源与基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)
摘 要: 管家基因能够在生物体细胞中表达和不断地被转录，对于维持细胞功能发挥重要作用，并在细胞中组成型稳
定表达。随着基因表达研究的深入，发现许多管家基因的表达也受到不同程度的调控。选择合适的管家基因作为内参对于
准确定量分析目标基因的表达水平至关重要。通过对植物基因表达研究中常用的内参对照基因的表达特性，综述了可以筛
选作为内参对照基因的标准和条件的验证。
关键词: 植物 内参对照基因 管家基因 基因表达 RT-PCR
Research Progress in Plant Reference Genes
Yakupjan Haxim Guan Bo Zhang Fuchun
(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，
College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046)
Abstract: House-keeping genes，due to their role in basic cellular process，were assumed to express constitutively． Recent study
indicated the expression of many housekeeping genes were found to be modified to some extent． Selecting the appropriate house-keeping
gene is the premise to precisely quantify gene expression． This paper reviewed the commonly used reference genes in plant research and
new progress in validating proper reference genes．
Key words: Plant Reference genes House-keeping gene Gene expression RT-PCR
收稿日期:2011-01-14
基金项目:新疆维吾尔自治区科技重大专项(200731138-3) ，上海市能源作物育种及应用重点建设实验室开放课题
作者简介:牙库甫江·阿西木，男，硕士研究生，研究方向:植物基因工程;E-mail:Buhram2000@ yahoo． com． cn
通讯作者:张富春，教授，博士生导师，研究方向:分子生物学;E-mail:zfc@ xju． edu． cn
基因表达分析在生命科学的众多研究领中被广
泛应用，其研究的深入在发现和预测新的基因及其
功能、了解基因表达调控的复杂网络等研究中起着
重要作用。对基因转录水平的研究可以通过基因芯
片分析、Northern 杂交(Northern blotting)和反转录
聚合酶链式反应(RT-PCR)技术来完成。在进行基
因表达的研究中，要精确判断基因表达的水平，就需
要有一个普遍表达的内部标准或一个管家基因
(house-keeping gene) (又称持家基因、看家基因) ，
而管家基因可使未知样本总 RNA量标准化。因此，
在进行比较基因表达研究时，管家基因用来作为参
考标准［1］，使基因表达的定性定量分析达到标准化
至关重要。目前用内参对照基因(reference gene)来
衡量目的基因的时空性表达是公认的标准化方法。
对照基因是指在特定物种或特定的组织中稳定表达
的，且在一定的试验条件下可检测的基因［2］。对照
基因在上述所述的各种基因表达分析方法中都被利
用。对基因芯片分析技术除了灵敏度和准确性的补
充，还可利用 RT-PCR 技术以及 Northern 杂交对基
因表达进行准确可靠的分析。因此，需要通过相对
稳定表达的内参对照基因对目标基因的转录量进行
标准化，否则材料的起始量、反转录的效率以及不同
组织间转录活性的整体差异都会影响最终的检测结
果。实时定量 RT-PCR(real-time quantitative RT-
PCR)是在传统的 PCR技术基础上发展起来的一个
新的核酸定量分析方法，具有定量准确、灵敏度高、
重复性好及高通量等特点，也已被广泛应用于基因
的表达分析，RT-PCR 也需要对照基因来校正和标
准化［3］。但目前对基因表达标准化的可靠程度存
在很多争议，特别是内参对照基因的选择。现就目
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
前植物基因表达研究中常用的内参对照基因及其应
用现状作一综述，以期为植物基因表达研究中内参
对照基因的选择提供一些思路和依据。
1 目前常用的内参对照基因及其特点
植物基因表达分析研究中比较常用的内参对照
基因是管家基因主要有肌动蛋白基因(ACT)、甘油
醛-3-磷酸脱氢酶基因(G3PDH /GAPDH)、18S 和
28S核糖体 RNA基因(18S rRNA、28S rRNA)及肽链
延伸因子(ef1-α)基因等。
肌动蛋白是真核细胞中主要的胞质微丝骨架组
分之一，包括 α、β、γ三种高度同源的肌动蛋白异构
体。其中 β-actin是植物基因表达研究中广泛使用
的内参基因［4 － 9］。
糖酵解途径中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH/
GAPDH)在细胞代谢中发挥着多种功能。GAPDH基
因的低拷贝数以及同源基因间较低的同源性使得它
作为探针具有独特的优势［10］。这是 GAPDH 使用广
泛的重要原因。此外，18S 和 28S 核糖体 RNA 基因
(18S rRNA、28S rRNA)也是常用的内参对照基因。
由于核糖体 RNA是由 RNA聚合酶 I合成，信使 RNA
则是由 RNA聚合酶 II合成，因此核糖体 RNA合成的
调节独立于信使RNA。在影响信使RNA表达的各种
条件下，各种核糖体 RNA 水平很少发生变化。与其
他内参对照基因直接进行对比可以发现，很多情况下
核糖体 RNA转录水平的稳定性都更好。但核糖体亚
单位要求使用总 RNA 和随机引物进行反转录，并且
与目标基因相比呈高丰度表达。肽链延伸因子(ef1-
α)是一类在蛋白质合成过程中能与氨酰 －转运 RNA
结合而广泛存在的蛋白，是翻译过程中的重要因子，被
认为是一类组成型表达的蛋白。但也发现其在高表达
蛋白的区域，例如生长组织、植物中的分生组织和发育
中的配子体中表达受到调控［11］，在生长停滞、转化过
程、衰老和细胞凋亡过程中其表达也有变化［12］。
除了上述的参照基因之外，微管蛋白基因(α-
tubulin和 β-tubulin)、核糖体蛋白(L25)基因、泛素
蛋白基因(UBQ)、F-box 蛋白基因、SAND 家族蛋白
基因、有丝分裂相关蛋白基因(YLS8)及亲环蛋白基
因(CYP)等也是目前用作内参的管家基因。
虽然上述的管家基因一直被作为内参对照基因
来标准化目的基因，但是最近不少研究发现结果显
示，不同管家基因在不同细胞类型和不同生理状态
下的表达并不是恒定不变的，这使管家基因作为内
参基因的作用受到挑战。
Tong 等［13］利用 ACT、CYP2、RPII、PLA2、RPL13、
GAPDH、18S rRNA、TUB、TUA、TEF2 和 UBQ10 等基
因作为内参对照基因研究桃树的基因表达。结果表
明，不同的内参基因在不同的组织中差异表达，其中
TEF2、UBQ10 和 RP II 基因的统计学稳定性最好，
18S rRNA、RPL13 和 PLA2 等基因的稳定性最差，不
适于作为内参对照。Maroufi 等［14］分析了 NADHD、
ACT、TUB、GADPH、H3、EF 和 18S rRNA等在菊苣的
叶子和根部中的表达稳定性。结果发现，ACT、EF 和
18S rRNA等基因的稳定性最好，可作为菊苣的内参
对照基因;而 GAPDH和 NADHD的表达稳定性相对
差，不能作为内参对照。Ding 等［15］通过定量 PCR
来证明了蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate syn-
thase) (SPS)是转基因水稻(genetically modified rice)
特异的内参对照基因。Jain等［16］在水稻中研究 18S
rRNA、25S rRNA、UBC、UBQ5、UBQ10、ACT11、GAP-
DH、eEF-1α、eIF-4a和 β-TUB 等常用内参基因的表
达模式。结果显示 UBQ5 和 eEF-1α 在不同的组织
稳定表达可作为参考基因。Nicot 等［17］将 7 个管家
基因:TUB、cyc、act、ef1-α、18S rRNA、aprt和 L2 等基
因作为内参对照基因研究马铃薯在生物及非生物胁
迫下的基因表达情况，研究结果显示ef1-α是最佳的
内参对照基因。
大量的研究结果表明，不同植物有最合适的内
参对照基因而同一种植物不同组织之间内参基因的
稳定性也存在差异。因此针对特定的试验条件和样
品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准
确的基因表达结果至关重要。
2 植物基因表达研究中内参基因的选择
标准
管家基因最初被认为是编码细胞基本生命活动
所需的蛋白，例如，C循环代谢、蛋白质翻译、细胞骨
架的稳定以及蛋白质的翻转折叠等。因此，管家基
因的表达水平在不同组织和器官中被认为是恒定不
变的。但大量的研究结果表明，任何一种看家基因
的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或试验因
素作用下“有范围”的恒定。在一种试验条件表现
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2011 年第 7 期 牙库甫江·阿西木等:植物基因表达转录分析中内参基因的选择与应用
稳定的内参基因不一定适用于另一种试验条件。此
外，同一基因家族内不同成员间表达上也可能有差
异。如肌动蛋白基因家族也被广泛用作内参基因，
但是其不同家族成员间的稳定性也不同，ACT2 /7
的稳定性较差，而 ACT11 的稳定性较好［18］。因此，
在所有组织器官、发育时期和生理状态条件下均稳
定表达的理想内参基因是不存在的。因此，研究者
必须结合具体的试验条件和样品类型来选择最佳的
内参基因。选用内参基因时应该考虑以下条件。
2． 1 选作内参的管家基因其本身的表达水平应
稳定
一个合适参照基因的重要标准是对于同一个植
物组织，其基因表达水平的波动应最小，并且要在不
同组织进行比较，其表达量在这些组织之间不应有显
著变化。管家基因表达的稳定性在不同植物组织中
可能并不相同。有些管家基因在不同种组织材料中
表达十分稳定［19］，而有些管家基因的表达水平则变
异性太大而不适合作为内参对照基因。当研究关注
于不同植物组织间基因表达的规律时，必须保证所选
内参基因不是组织特异表达的。内参基因不仅要有
表达水平的稳定性，其表达水平还应当与目标基因的
表达水平相近。因而在对表达水平相对较低的基因
如转录因子进行研究时就应选择相对低表达的管家
基因作为内参对照［20］，以获取更为可靠的分析结果。
2． 2 所选内参基因在给定试验设计中表达恒定
植物不同发育时期相关基因的表达以及不同环
境和处理对基因表达的影响也是许多研究者在研究
中所关注的热点问题。但不同发育时期的植物材料
中某些管家基因的表达水平也是变化的［5，21］。各种
胁迫处理下管家基因表达的研究也表明，管家基因
的表达也常常受到外界环境条件的影响［22］，某些胁
迫条件下，表达量变化的管家基因作为内参甚至会
对目标基因标准化的准确性产生显著的影响［17］。
显然，不同处理条件下选择何种管家基因作为内参
对照值得进行具体分析来确定［23］。如盐胁迫以及
渗透胁迫下 18S和 25S rRNA都是水稻中最优的内参
基因。水稻幼苗在 300 mmol /L NaCl 或 400 mmol /L
甘露醇处理下，18S和 25S rRNA表达量是所有参比
内参基因中最为稳定的［16］，因而是最适合在此种条
件下作为内参基因的管家基因。研究还发现拟南芥
等几种草本叶片在 10% 的 PEG 处理下，其 26S
rRNA的表达量始终很稳定［24］。因此，渗透胁迫下
还可以考虑选择 26S rRNA基因作为内参基因。
多种植物不同发育时期内参基因表达稳定性的
研究表明，肌动蛋白基因(Actin)和泛素蛋白基因
(UBQ)是不同发育时期的最适内参基因［5，16，20，25］。
处于不同发育时期的植物材料还可考虑选择肽链延
伸因子(ef1-α)作为内参基因。对不同发育时期管
家基因表达稳定性进行验证的结果［5，16］表明，肽链
延伸因子(ef1-α)在不同发育时期表达稳定，适合作
为内参基因对目标基因进行标准化。
核糖体 RNA基因适合作为各种激素处理下植
物的内参基因。通过比较不同激素处理对水稻中管
家基因表达稳定性的影响发现，18S 和 25S rRNA是
最合适的内参基因［16］。拟南芥等多种植物在赤霉
素处理下的最佳内参基因也是核糖体 RNA 基因
(26S rRNA)［24］。
2． 3 内参基因的确定要根据具体试验条件进行
验证
植物不同组织、不同发育阶段，盐胁迫、干旱胁
迫等非生物胁迫以及生物胁迫下植物基因的表达调
控是植物基因表达研究中的主要领域。而选择合适
的管家基因作为内参对于准确定量分析目标基因的
表达是至关重要的。越来越多的研究表明，上述管
家基因并不是在任何情况下都组成型的表达，而且
一个物种中稳定表达的管家基因很可能不适合作为
另一物种在特定试验条件下的内参基因［25］。选择
未经验证的不合适的管家基因作为内参，甚至可能
给目标基因的表达水平带来上百倍的变化［26］。因
此放之四海而皆准的管家基因其实是不存在的，内
参基因的选择需要在具体试验条件中得到验证。
选择传统的管家基因进行筛选验证是确定内参
基因的一个可行途径。另外，近年 Czechowski 等［27］
在植物基因组测序和基因芯片技术的基础上，利用
拟南芥(Arabidopsis thaliana)Affymetrix ATH1 基因
芯片筛选并最终验证得到的拟南芥在多种条件下稳
定表达的基因，也为植物基因的转录分析提供大量
全新的候选内参基因。研究者可以直接结合自身试
验条件从中选择合适的候选内参基因，然后在一些
统计学软件如 GeNorm［28］和 Best Keepr［29］的辅助下
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
筛选到可靠的内参基因。
3 结语
作为植物基因表达研究中的重要研究方法，实
时定量 RT-PCR技术和 Northern杂交都需要在试验
条件下相对稳定表达的管家基因作为内参对照。随
着对管家基因认识的深入，为了得到更为准确的试
验结果，选择具体试验条件下表达稳定可靠的内参
对照基因开始得到重视。不可否认，在植物基因表
达研究中对内参对照基因表达的稳定性进行系统验
证还只是刚刚开始。在基因组测序和基因芯片分析
结果的推动下，选择更为准确可靠的内参基因将更加
有助于准确无误地揭示植物基因表达的内在规律。
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