全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
阿维拉霉素生物合成与代谢调控研究进展
刘芳 李晓荣 邹祥
( 1西南大学药学院,重庆 400715; 2重庆市兽药工程技术研究中心,重庆 400716)
摘 要: 阿维拉霉素是发酵法来源的新型兽用的消化促进剂和代谢调节剂, 具有较高的生物安全性,通过改善动物肠
道内细菌群的生态结构促进动物生长。对阿维拉霉素的生物合成和代谢调控进行了综述, 同时结合系统生物技术观点, 为阿
维拉霉素菌种基因工程改造提供参考。
关键词: 阿维拉霉素 生物安全发 生物合成 系统生物技术
Advances on B iosynthesisApproach andM etabolic
Regulation of Avilamycin
L iu Fang L iX iaorong Zou X iang
(
1
College of Pharmaceutical Sciences, Southw est University, Chongqing 400715;
2
Chongqing Engineering T echnology R esearch C entre of D rugs for Veterinary Use, Chongqing 400716)
Abstrac:t Av ilam yc in is a new type o f d igestive enhancer and m etabo lic modu later by ferm enta tion techno logy, and has h igh b io
log ica l safety leve.l Av ilamyc in can perfect the eco log ica l structure o f intestina l bacter ia and prom o te the grow th of anim a ls. In th is arti
cle, the biosynthesis prog ress and them etabo lic regulative control o f av ilamyc in we re investigated, wh ich prov ided some nove l strateg ies
to improve the production ab ility of stra in by genetic eng ineer ing approach, com bined w ith the v iew of system biotechnology.
Key words: Av ilam yc in B iolog ica l safe ty B iosynthesis System b io techno logy
收稿日期: 20100906
基金项目:重庆市自然科学基金项目 ( CSTC, 2009BB1120) ,重庆科技创新能力建设项目 ( CSTC, 2009CB1010)
作者简介:刘芳,女,硕士,研究方向:微生物与生化药学; Em ai:l 987. l iufang@ 163. com
通讯作者:邹祥, Em ai:l zhx1030@ yahoo. cn
阿维拉霉素属于正糖霉素族的寡糖类抗生素,
由绿色产绿链霉菌 (S trep tomyces viridochromogenes)
发酵产生的二氯异扁枝衣酸酯,是一种新型兽用消
化促进剂和代谢调节剂。阿维拉霉素最先由美国礼
来公司研制开发,在欧盟, 日本,巴西,泰国等世界主
要养殖业国家,均被广泛应用于畜禽饲料中,效果显
著,是欧盟国家允许使用的兽用抗生素之一。尽管
阿维拉霉素产品已在我国已上市, 但由于阿维拉霉
素生物合成与代谢调控的复杂,国内在高单位的阿
维拉霉素菌种选育及工艺研究上没有取得实质性突
破,目前仍处于开发阶段。因此,本文就阿维拉霉素
的安全性、生物合成途径、基因工程菌改造方面的研
究进展展开综述,为进一步提高阿维拉霉素的发酵
水平提供借鉴。
1 阿维拉霉素的安全性
作为新型的兽用生长促进剂和代谢调节剂,阿维
拉霉素表现出很高的生物安全性。以小鼠和大鼠为
动物模型,在急性毒性试验、短期以及长期毒性试验、
眼粘膜刺激性试验、急性吸入毒性试验等各种试验中
均表现出很高的生物安全性, 无任何生长、存活或繁
殖上的不良反应。此外, 阿维拉霉素具有易降解特
性,在光照、酸性环境条件下能迅速降解,而碱性环境
降解速度较慢。袁霞 [ 1]将阿维拉霉素按灌服剂量直
接加入水中, 96 h后阿维拉霉素降解了 95%,并且研
究了在鲤体的血药动力学特征,表明阿维拉霉素在鲤
体内吸收少,分布快, 消除迅速,在鲤体内为零休药
期。用原子标记技术检测给猪口服阿维拉霉素后的
代谢情况,表明有 95%由粪便迅速排出体外, 5%经尿
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
液排出体外 [ 2]。M enotta等 [ 3]也证明阿维拉霉素动物
体内残留极少,是安全的动物食品添加剂。
阿维拉霉素作为抗生素类饲料添加剂在是否会
引起细菌抗药性问题受到了很大的关注。然而越来
越多的研究表明阿维拉霉素的抗性菌株在停止喂投
后迅速消失 [ 4, 6, 7] ,并且, 阿维拉霉素结构特殊, 是人
畜药物唯一属于奥尔托索霉素类的抗生素,因此, 无
交叉抗药性和耐药性的产生。Aarestrup等 [ 8]发现停
用阿维拉霉素后, 细菌抗性迅速减小。之后, Delso,l
Randa ll等 [ 5, 6]研究了使用阿维拉霉素对猪肠内细菌
抗性产生的影响时发现,当停止阿维拉霉素对细菌的
选择压力 1周后,抗性株不能存在,与其他肠球菌抗性
出现的试验数据进行比较,肠球菌对阿维拉霉素抗性
的出现是缓慢的过程并且持续很短的时间。 S im jee
等 [ 7]发现阿维拉霉素治疗和预防家畜肠流行病的效
果显著,并且于 2002至 2004年期间在意大利、法国、
西班牙 3个国家的不同区域中的患有家畜流行病的
兔子身上分离到 89株产气荚膜梭状芽胞杆菌,其中
没有抗性菌种出现。同时,由于阿维拉霉素没有用于
人类和动物的治疗作用,因而它避免了因应用治疗性
抗生素而出现的耐药性问题。可见,阿维拉霉素作为
兽用生长促进剂的应具有广阔的前景。
2 阿维拉霉素的抗菌活性及其促进禽、兽类
生长的机制
作为新型的促生长饲料添加剂, 阿维拉霉素具
有很大的优势,它能改变动物肠道内的细菌群的生
态结构,影响细菌群的代谢活性, 为宿主营造吸收营
养的优良环境。Castillo等 [ 9]研究表明,阿维拉霉素
增强了猪体内与病原微生物生长竞争的天然有益微
生物合理生态结构。阿维拉霉素能提高宿主动物对
营养的吸收率,调整吸收时间以有益于吸收。在抑
菌方面,阿维拉霉素主要抑制革兰氏阳性菌,且抑菌
活性很高,包括一些对抗生素产生抗性的菌株,如抗
万古霉素的肠球菌,具青霉素抗性的链球菌以及甲
氧苯青霉素抗性的葡萄球菌 [ 10 ] ;通过抑制细菌粘附
于宿主黏膜细胞表面,达到抑制细菌的感染间接预
防病菌感染的作用 [ 11 ] ,其抑菌作用在于作用于革兰
氏阳性菌的 50S核糖体亚基的一个位点干扰 tRNA
的结合,阻止了 70S起始复合物的形成,从而抑制了
蛋白质的生物合成 [ 12, 13 ]。
3 阿维拉霉素的生物合成途径
阿维拉霉素是绿色产绿链霉菌产生的次级代谢
产物。1997年 Ga isser等 [ 14 ]首先完成绿色产色链霉
菌中阿维拉霉素生物合成基因簇的测序, 在 S. viri
dochromog enes T57的染色体中, 一个长度为 60 kb
的 DNA片段被解读,包含了阿维拉霉素生物合成的
整个基因簇, 含 54个开放阅读框 (图 1), 并且对阿
维拉霉素的生物合成途径进行了推理。随着对阿维
拉霉素及其产生菌 S. viridochromogenes的研究的深
入, 其生物合成途径已逐步清晰。
图 1 阿维拉霉素生物合成基因簇
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2010年第 12期 刘芳等:阿维拉霉素生物合成与代谢调控研究进展
3. 1 阿维拉霉素生物合成途径始于二糖的生成
阿维拉霉素是以糖为骨架的低聚糖抗生素,其
结构由末端的双氯晚霉素酸分子 (残基 A )连接一
个七糖链组成,如图 2,表 1所示。
A. D ich loroisoevern in ic acid; B, C. Dolivoses; D. 2d eoxyDevalose; E. 4Om ethylDfucose; F. 2, 6d iOm ethylDm annose; G. 2Oisobu
tyrylLlyxose; H. m ethyleurek anate
图 2 阿维拉霉素及其衍生物 Gavibam yc in的分子结构
表 1 阿维拉霉素及其衍生物 Gavibam yc in的来源
菌株 物质来源 R1 R2 R3 R4 R5
S. v iridochrom ogenesT57 Av ilam ycinA CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 COCH 3
S. v iridochrom ogenesT57 Av ilam ycin B CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH (OH ) CH 3
S. v iridochrom ogenesGW 4 Gavibam ycinA1 H CH 3 CH 3 CH 3 COCH 3
S. v iridochrom ogenesGW 4 Gavibam ycinA3 H CH 3 CH 3 CH 3 CH (OH ) CH 3
S. v iridochrom ogenesGW 4GW2 Gavibam ycinC1 H CH 3 H CH 3 COCH 3
S. v iridochrom ogenesGW 4GW5 Gavibam ycinB1 H H CH 3 CH 3 COCH 3
S. v iridochrom ogenesGW 4GW6 Gavibam ycinI1 H CH 3 CH 3 H COCH 3
S. v iridochrom ogenesGW 2 Gavibam ycinJ1 CH 3 CH 3 H CH 3 COCH 3
S. v iridochrom ogenesGW 5 Gavibam ycinK1 CH 3 H CH 3 CH 3 COCH 3
S. v iridochrom ogenesGW 6 Gavibam ycinL1 CH 3 CH 3 CH 3 H COCH 3
S. v iridochrom ogenesO2 Gavibam ycin O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H
阿维拉霉素生物合成最有可能起始于由葡萄
糖生成 L来苏糖 (残基 G )。UDPD葡萄糖转化
为 UDPD葡萄糖醛酸, 之后经过去碳酸基作用生
成 UDPD木糖, 经过立体异构反应生成UDPL来
苏糖 (残基 G )。研究表明参与UDPD葡萄糖醛
酸转化为 UDPD木糖的基因是 av iE2, 其编码产
物 Av iE 2是一 个 UDPG lcA 脱羧酶。H o fm ann
等 [ 17]用 HPLCMS和核磁共振分析验证了 A v iE2
催化反应的产物为 UDPD 木糖, 这一结论与先
前 W eitnauer等 [ 21 ]推断的 av iE2基因是参与残基
H的生物合成过程这一结论不同。
从 UDPD木糖到 UDPL来苏糖 (残基 G )的
转化需要两步差向立体异构反应, 在阿维拉霉素
合成基因中催化这些步骤的很有可能是 av iQ 1、
av iQ 2和 av iQ3基因。同时, 对阿维拉霉素产生菌
进行 av iP缺失突变的研究, 并没有阻断阿维拉霉
素的合成, 表明 av iP基因不存在与 UDPL来苏
糖 (残基 G )的合成途径中, 这也与先前结论相
反 [ 17 ]。 L来苏糖与 L吡喃葡萄糖生成二糖基团
(图 3 ) [ 16 ] , 由 A v iX 12腺苷甲硫氨酸酶 [ 15 ]将这一
二糖基团差向异构化变为其终结构 dM anp
( 1 ) lLyxp, 即残基 FG。将 L来苏糖
(残基 G)连接到残基 H上的时候是由 Av iGT4催
化的。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
3. 2 阿维拉霉素生物合成的最后步骤是基团修饰
和活性转化作用
在阿维拉霉素分子中一个显著的特点是在其不
同的部位被氧甲基修饰, 这也是使得阿维拉霉素水
溶性差的原因, 并且阻碍了其作为药物的发展。通
过基因失活试验,使得生产菌产生了阿维拉霉素的
衍生物,命名为 Gav ibamycin。Gav ibamycin丢失了 1
个或几个甲基, 极性显著变化, 水溶性增加。在 4O
甲基D海藻糖 基团 (残基 E)上的甲基的丢失对极
性的影响最大。 Gav ibamycin E1水溶性增加 10
倍 [ 17]。在阿维拉霉素生物合成基因簇中发现了 3
个转甲基酶基因 av iG2、aviG6和 av iG5, 它们的甲基
修饰作用发生在阿维拉霉素生物合成的后期的阶
段,分别在甘露糖残基 (残基 F)的 C5位的侧链上
和 C2位上、海藻糖残基 (残基 E)的 C4位上进行
甲基化 [ 10]。
图 3 由 L来苏糖和 L吡喃葡萄糖构成的二糖结构
av iG1基因位于阿维拉霉素聚酮体生物合成基
因簇的上游, 是 2脱氧Deva lose (残基 D ) C3位上
的甲基转移酶。 av iG1与红霉素生物 dTDP碳霉糖
合成基因 eryBIII(在 dTDPL碳霉糖生物合成过程
中对 C3位进行甲基化 )功能相似,能互补 eryB III缺
失突变菌株 [ 18]。
在整个阿维拉霉素生物合成的后期, av iX12基
因将残基 F和 G(如图 3所示二糖结构 )差向异构化
为阿维拉霉素活性形式。Av iX12与已知的功能蛋
白没有很大的相似性, 但是它包含了 S腺苷甲硫氨
酸蛋白家族中典型的序列模序, 并且检测出 A viX12
包含 1个 [ 3Fe4S]簇。S腺苷甲硫氨酸蛋白家族中
的蛋白参与氧化过程,由此推断 av iX12基因很有可
能参与阿维拉霉素生物合成过程中的氧化反应。
Bo ll等 [ 15]通过 av iX12基因失活试验, 证实 aviX12
基因参与阿维拉霉素生物合成途径, 催化特殊的差
向异构反映。推断其机理可能是 Av iX12和 AdoM et
产生了 1个 5脱氧腺嘌呤, 这一 5脱氧腺嘌呤在甘
露糖分子的 C2位置上脱去氢原子, 形成中间体。
这一中间体通过某种未知的机制进行差向异构化反
应。至今, Av iX12是唯一的属于 S腺苷甲硫氨酸蛋
白家族,且催化糖差向异构化反应的蛋白。
Treede等 [ 19]通过基因失活研究表明 av iB1和
av iO2起到对阿维拉霉素分子中 H残基结构修饰的
作用,敲除 av iB1和同时敲除 av iB1、 av iO2基因的
突变株均产生在 H残基的 C4位上缺乏乙酰基的
阿维拉霉素衍生物。通过核磁共振技术和序列同源
性比较, 表明 Av iB1和 A v iB2催化丙酮酸盐转化为
乙酰基碳负离子的反应, Av iO2将此乙酰基碳负离
子连接到阿维拉霉素 H残基的 C4位上。然而也不
能否定 av iO2基因可能参与氧化 4OH, 以起始由
Av iB1 /Av iB2催化的缩合步骤这一假设。
Av iG4是 O甲基转移酶,负责残基 A上酚式羟
基的甲基化。苔色酸是残基 A的前体物, 其合成由
avMi 基因负责; av iN基因位于 avMi 基因上游, 产物
起始苔色酸的合成。从苔色酸合成残基 A要经过
甲基化和双卤化作用, 分别由 av iG4和 avHi 基因负
责 [ 14]。但此修饰作用是否在阿维拉霉素生物合成
的最后阶段进行尚未得知。
3. 3 阿维拉霉素生物合成的其他步骤
在整个基因簇内部, av iC1和 av iC2基因为阿维
拉霉素生物合成的调控基因, 这两个基因彼此紧挨
着, 并且以相同的方向进行转录。 av iC2基因根据
产生菌的生理状况来精确的调节 av i基因的表达水
平,从而控制阿维拉霉素的产量, aviC2基因也对自
身基因的表达产生自调节 [ 20]。 av iC1和 av iC2基因
对阿维拉霉素的产生是一个正向的调节, 且 av iC1
基因能调控 av iC2基因的表达。
4 基于阿维拉霉素生物合成途径的基因工程
菌改造
阿维拉霉素因其高效、低毒、安全、易降解等优
点,具有良好的应用前景。国内对于阿维拉霉素未
实现产业化的瓶颈在于菌种产素能力低,对于阿维
拉霉素高产菌种选育的研究尚处于初级阶段, 应用
传统的物理化学诱变结合高强度筛选的方法, 效率
低且基因突变随机,目的性不强, 因此需要建立新型
的阿维拉霉素菌种选育的方法。近年来阿维拉霉素
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2010年第 12期 刘芳等:阿维拉霉素生物合成与代谢调控研究进展
生物合成途径的日益明确 [ 14, 18, 21] , 基于现代生物技
术育种的高效性和定向性等特点, 对阿维拉霉素生
产菌菌种进行基因工程的改造就尤为必要。
阿维拉霉素的生物合成途径中主要以 1磷酸
葡萄糖、GDPD甘露糖和 5磷酸核糖为前体, 某些
糖结构基团的生物合成起始于与不同的己糖
库 [ 14, 21 ]。阿维拉霉素产生菌中众多的与糖代谢有
关的基因把糖类代谢联系成一个复杂的网状结构。
朱传合等 [ 22]研究表明磷酸戊糖途径和三羧酸循环
均是影响阿维拉霉素生物合成的重要代谢途径。6
磷酸葡萄糖脱氢酶是磷酸戊糖途径中的关键酶,琥
珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的关键酶, 当过量的铵
盐使得阿维拉霉素生物合成受抑制时, 6磷酸葡萄
糖脱氢酶的活性相应的降低,琥珀酸脱氢酶的活性
相应升高 [ 22]。因此可对途径中的关键酶 6磷酸葡
萄糖脱氢酶、琥珀酸脱氢酶进行强化表达有可能提
高阿维拉霉素合成的代谢流量。
运用系统生物学的研究方法, 如基因组、蛋白
组、转录组、代谢物组、代谢流组等来分析并指导工
业微生物菌株的改造能有效避免传统菌种改造的弊
端,将相关组学数据整合,通过计算机建模和预测,
从而确定相关的遗传操作靶点,使微生物的遗传育
种更具定向性 [ 23]。
系统生物学已经成功的应用于链霉菌的基因改
造。继 2001年英国剑桥 Sanger中心对天蓝色链霉
菌 ( S trep tomyces coelicolor )全基因组测序完成之
后 [ 24] , S trep tomyces averm itilis, S trep tomyces noursei和
S trep tomyces p eucetius也相继完成全基因组测序。现
代代谢工程整合组学数据, 建立整体层次上的数学
模型, 对基于功能基因组信息重建的代谢网络系统
进行分析,在整体上描述了生物反应过程及其调控
机制,并用于指导实现下一步基因工程目标。Butler
等 [ 25]根据碳流量与次生代谢的关系, 在 S. lividans
中操纵碳代谢途径,通过缺失基因 zw f(编码 6磷酸
葡萄糖脱氢酶的同工酶 ) , 减少 PPP途径的碳代谢
流量, 提高菌株的葡萄糖利用率,从而提高放线紫红
素和十一烷基灵菌红素的产量。敲除链霉菌中竞争
共同前体的代谢途径基因簇,或降低其表达水平,能
使共同前体代谢物尽可能多的流向目标代谢途径,
提高目标产物生成量。陈芝 [ 26]、蔡玉娟 [ 27 ]在 aveD
基因内部进行了基因缺失,造成甲基化酶 aveD的失
活, 阻断了阿维菌素 B组分向 A组分的转化, 使得
菌株只产阿维菌素 B。阿维拉霉素有 A到 N共 14
种结构,但起主要生物活性作用的是阿维拉霉素 A,
通过系统生物学方法研究可以得出阿维拉霉素 A
合成代谢途径的限速基因和调控机制。
5 展望
阿维拉霉素作为市场前景看好的兽用生长促进
剂, 由于对阿维拉霉素产生菌生物合成途径的复杂
和对链霉菌的遗传操作的困难, 使得阿维拉霉素菌
种选育工作进展很慢。当前有必要建立一套绿色产
色链霉菌可行的遗传操作系统, 结合系统生物学技
术, 有目的的进行阿维拉霉素的代谢工程改造,结合
发酵过程优化和放大技术, 早日实现阿维拉霉素产
业化。
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