全 文 :文章编号 :100028551 (2007) 052451205
60 Coγ射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株
及培养基优化
梁新乐1 陈 敏1 张 虹1 胡奇杰2
(11 浙江工商大学 ,浙江 杭州 310035 ;21 杭州凯胜生物技术有限公司 ,浙江 杭州 310014)
摘 要 :用60 Coγ射线对绿色产色链霉菌 A205 菌株进行了诱变处理 ,以正突变率为标准确定诱变的适宜
剂量为 350 Gy。诱变后得到 5 株较高产突变菌株 ,其中 H215 菌株经连续传代 6 次 ,遗传性状稳定 ,阿维
拉霉素发酵单位达到 6815mgΠL。采用响应面分析法对菌株 H215 生产阿维拉霉素的发酵培养基碳氮源
进行了优化设计。在所试验的碳氮源中 ,可溶性淀粉、核糖分别作为唯一碳源时 ,阿维拉霉素发酵单位
较高 ,分别达 82167 和 79145mgΠL ,乳糖、果糖、葡萄糖分别作为唯一碳源时菌株的效价较低 ;3 %的豆粕
粉和 2 %的大豆蛋白胨作为氮源时阿维拉霉素发酵单位分别为 7716 和 6217mgΠL。采用双碳源双氮源更
有利于菌株提高阿维拉霉素的发酵单位 ,响应面分析结果表明 ,可溶性淀粉、核糖和大豆蛋白胨对阿维
拉霉素发酵单位影响较显著。优化后的碳氮源组成为 :可溶性淀粉 20112gΠL ,D2核糖 7181gΠL ,豆粕粉
25123gΠL ,大豆蛋白胨 5106gΠL。优化后的模型计算出阿维拉霉素发酵单位由原来的 71163mgΠL 提高到
101148mgΠL。
关键词 :链霉菌 ;60 Co 诱变 ;阿维拉霉素 ;响应面分析法
60 Coγ2IRRADIATION MUTATION INDUCTION FOR
SCREENING OF AVILAMYCIN STRAINS WITH HIGH PRODUCTIVITY
AND ITS CULTURE MEDIUM OPTIMIZATION
LIANG Xin2le1 CHEN Ming1 ZHANG Hong1 HU Qi2jie2
(11 Department of Biochemcal Engineering , Zhejiang Gong Shang University , Hangzhou , Zhejiang 310035 ;
21 Hangzhou Kai Sheng Biotechnology Co Ltd , Hangzhou , Zhejiang 310014)
Abstract :60 Coγ2irradiation was used for mutation treatment to screen high avilamycin production strains. Irradiation at 350Gy
gave a positive mutation ratio at 2615 %. The derived mutant H215 strain of Streptomyces viridoehrongenes showed high
avilamycin productivity at 6815mgΠL. Then effects of different carbon and nitrogen sources on the producing strain H215 were
investigated by one factor test and optimized with Response Surface Methodology. The results indicated that the optimum
carbon and nitrogen source were soluble starch 20112gΠL , ribose 7181gΠL , soy powder 25123gΠL and soy peptone 5106gΠL.
Under those conditions , the predicted consistent value of avilamycins yield was 101148mgΠL , which was in consistent with the
measured value.
Key words : Streptomyces viridoehrongenes ;γ2irradiation induction ; avilamycins ; Response Surface Methodology ;
收稿日期 :2007205216
作者简介 :梁新乐 (19692) ,男 ,湖北江陵县人 ,副教授 ,研究方向为应用微生物学。E2mail : dbiot @mail . zjgsu. edu. cn 阿维拉霉素 (Avilamycin) 又名卑霉素 ,由绿色产色链霉菌 ( Streptomyces viridoehrongenes) 合成 ,属寡糖类抗生素[1 ] ,能抑制多种革兰氏阳性细菌的生长 ,阿维拉霉 素中以组分 A 的活性最高 ,对链球菌、杆菌、梭菌、葡萄球菌作用显著 ,其中包括对糖肽类抗生素具有抗性的肠球菌、青霉素抗性的链球菌以及甲氧苯青霉素抗
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性的葡萄球菌[2~4 ] ,可作为万古霉素或其他抗生素的
替代品来治疗多种感染性疾病。阿维拉霉素分子结构
独特 ,安全性高 ,不易被肠道吸收 ,基本无残留 ,毒性
小 ,不存在交叉耐药性 ,易降解 ,对环境污染小 ,同时还
具有良好的加工性能[5 ] ,因此在主要的养殖业国家如
欧盟、日本、巴西 ,被广泛添加于鸡、猪饲料中 ,以提高
畜禽的生产绩效和抗病能力[6 ] 。我国农业部于 2005
年批准进口使用[进口兽药再注册目录 , (2005) 外兽药
证字 56 号 ]。
目前阿维拉霉素主要由美国礼来公司生产 ,其商
品名为效美素 (Maxus100) [7 ] ,介绍其应用效果的文章
较多 ,但与其发酵生产相关的研究在国内外报道较少。
朱传合等[8 ,9 ] 将微波诱变效应、N + 离子注入法运用于
阿维拉霉素高产菌株的诱变育种上 ,突变株阿维拉霉
素效价分别达到 2115 和 8219 mgΠL。Weitnauer[10 ] 等对
绿色产色链霉菌株 TU57 的合成基因簇进行了研究 ,
通过基因重组获得了阿维拉霉素的结构类似物。除此
目前没有检索到其他关于阿维拉霉素生产效价的报
道。绿色产色链霉菌株 H215 是经亚硝基胍 (NTG) 等
诱变后筛选获得的 1 株阿维拉霉素的突变株。
响应面分析法 (Response Surface AnaLysis ,RSA) [11 ]
是综合试验分析和数学建模最经济合理的试验设计。
它以回归法作为函数恒算工具 ,通过多项式近似 ,把因
子与试验结果 (响应值) 的关系函数化 ,以此对因子进
行全面分析 ,研究因子与响应值之间、因子与因子之间
的相互关系[12 ] 。近年来该方法已成功地应用于发酵
培养基的优化、酶解反应等[13 ] 。本文采用响应面分析
法对 H215 发酵培养基中碳源和氮源的种类、浓度、配
比进行了优化设计 ,以期提高菌株的发酵单位。
1 材料与方法
111 菌种
阿维拉霉素产生菌株 Streptomyces virichromodenes
A205 ,本实验室 NTG诱变获得。
藤黄微球菌 ( Microccus luteus) 10209 ,中国工业微生
物菌种保藏中心。
112 培养基
培养基包括以下 5 种 : 1) 链霉菌活化培养基 :
KNO3 110gΠL , 可溶性淀粉 2010gΠL , KH2 PO4 015gΠL ,
MgSO4·7H2O 015gΠL ,FeSO4 0101gΠL ,NaCl 015gΠL , 琼脂
2010gΠL , pH 712~714 ;2) 发酵培养基 :甘露醇 3010gΠ
L , 豆粕粉 4010gΠL , L2缬氨酸 2134gΠL , pH 712~714 ;
3)牛肉膏蛋白胨液体培养基 :牛肉膏 310gΠL ,蛋白胨
1010gΠL , NaCl 510 gΠL , pH 710~712 ;4) 牛肉膏蛋白胨
半固体培养基 :牛肉膏 310gΠL ,蛋白胨 1010gΠL , NaCl
510 gΠL , 琼脂 1010gΠL , pH 710~712 ;5)牛肉膏蛋白胨
固体培养基 :牛肉膏 310gΠL ,蛋白胨 1010gΠL , NaCl 510
gΠL , 琼脂 2010gΠL , pH 710~712。
113 方法
11311 种子培养 将原始菌种转接到活化培养基平
板 ,于 28 ℃恒温培养 3d ,将孢子转接到另一块平板 ,
28 ℃恒温培养 3d 后再转接至试管斜面 (活化培养基) ,
28 ℃恒温培养 3d 后即为种子。
11312 种子扩培 将 10ml 019 %的生理盐水倒入产
孢子的斜面中 ,用接种铲刮下斜面表面的孢子 ,用灭菌
的移液管接入装有种子培养基的 100mlΠ500ml 三角瓶
中 ,每瓶 5ml (接种量 5 %) ,于 28 ℃,250rΠmin 摇培 48h
左右。
11313 发酵培养 将培养好的种子培养基接入装有
发酵培养基的 100mlΠ500ml 三角瓶中 ,每瓶 5ml (接种
量 5 %) ,于 28 ℃,250rΠmin 摇培 48h 后 ,停止发酵 ,提取
样品测定参数。
11314 效价测定法 采用二剂量法。取发酵液 5ml ,
加入 5ml 甲醇 ,混匀 ,置于 37 ℃培养箱中 2h。取出后
以 4000rΠmin 离心 10min ,取上清液做效价测定。每个
平板上都取一个牛津杯滴入同一浓度的标准液。求出
标准液抑菌圈直径的平均值 ,并与各平板的标准液相
比 ,得出一个校正数。用各个平板的校正数对发酵液
的抑菌圈直径进行校正 ,所得的校正值在标准曲线上
查得对应标准品浓度即为所测定发酵液生物效价。
11315 诱变选育方法 活化后的菌体用无菌生理盐
水 (0185 % 的 NaC1 溶液)稀释 ,γ射线诱变前稀释成细
胞密度为 106个/ ml 的菌悬液。60 Coγ射线诱变在浙江
大学原子核农业科学研究所进行 ,剂量分别为 150、
250、350、500Gy。
11316 数据分析 采用国际上最常用的统计软件
SAS910 对试验数据进行回归分析。用 P 值检验测试
回归系数的显著性。多项式模型方程拟合的性质由确
定系数 R2 表达 ,其统计学上的显著性由 F 检验确定。
用微分计算预测最佳点。
2 结果与分析
211 γ射线诱变筛选高产菌株
通过观察60 Coγ射线的诱变剂量与菌体致死率之
间的关系 (图 1) ,按照诱变剂量选择的一般原则 ,选取
菌体致死率大约在 60 %~95 %之间的诱变剂量来观
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察其正突变率。单菌落经摇培发酵与出发菌株相比
较 ,产量提高的为正突变株 ,最后统计各诱变剂量下的
正突变率 ,把正突变率最高的剂量作为最佳诱变剂量。
从图 1 可以看出60 Coγ射线照射剂量为 350Gy 时 ,正突
变率最高 (2318 %) 。与原始菌株 A205 阿维拉霉素发
酵单位 (2317mgΠL)相比 ,突变菌株 H2210、H2157、H224、
H276、H215 具有较大发酵单位 (图 2) ,其中 H215 的发
酵单位最大 ,为 6815mgΠL ,是原始菌株的 218 倍。为提
高 H215 发酵单位 ,本试验对其发酵培养基的碳源及氮
源进行了进一步优化。
图 1 γ射线对菌株 A205 致死率及正突变率的影响
Fig. 1 Effects of 60 Coγ2irradiation on
the lethal rate and positive mutant rate of A205 strain
图 2 出发菌株 A205 经γ射线诱变突变株的筛选结果
Fig. 2 Diagram of avilamycin production by mutants
derived from the mutation with
60 Coγ2irradiation on A205 strain
212 碳源对菌株 H215 阿维拉霉素发酵单位的影响
由图 3 可知 ,以可溶性淀粉、核糖、甘露醇分别作
为唯一碳源时 ,菌株 H215 阿维拉霉素发酵单位较高 ;
以乳糖、果糖、葡萄糖作为碳源时菌株的效价较低。菌
株 H215 以 2 %可溶性淀粉作为碳源 ,阿维拉霉素的发
酵单位最大 ,达到 82167mgΠL。其次是 2 %的核糖。文
献报道[10 ]的培养基一般以甘露醇作为碳源 ,但甘露醇
的原料价格较昂贵。可溶性淀粉廉价易得 ,因此以可
溶性淀粉作为主要碳源。考虑到菌体快速生长的需
要 ,除淀粉外还加入适量小分子糖 ,以缩短停滞期 ,促
进菌丝体的生长。
图 3 绿色产色链霉菌 H215 菌株发酵不同碳源
阿维拉霉素效价比较
Fig. 3 Comparison of avilamycin titer with different
carbon sources utilized by mutant H215
A :可溶性淀粉 ; B : 乳糖 ; C :果糖 ; D :葡萄糖 ;
E :核糖 ; F :甘露醇。字母脚注 1、2、3 分别表示
1 %、2 %、3 %的浓度。下图同
A :soluble starch ; B :lactose ; C :fructose ; D :glusoce ;
E:ribose ; F :sorbitol. Footnote 1 , 2 , 3 denote 1 % , 2 % and
3 % concentration , respectively. The same as Fig. 4
213 氮源对菌株 H215 阿维拉霉素发酵单位的影响
图4表示了不同氮源对菌株H215阿维拉霉素发
图 4 绿色产色链霉菌 H215 菌株发酵不同
氮源阿维拉霉素效价比较
Fig. 4 Comparison of avilamycin titer with different
nitrogen sources utilized by mutant H215
A :豆粕粉 ; B :大豆蛋白胨 ; D :酵母膏 ; E :牛肉膏 ;
F :硝酸钾
A : soybean powder ; B :soybean peptone ; D :yeast extract ;
E:beef extract ; F :potassium nitrate
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酵单位的影响。豆粕粉、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、
硝酸钾都可以作为阿维拉霉素发酵用氮源 ,不同种类
氮源对发酵单位影响较大。其中 3 %的豆粕粉和 2 %
的大豆蛋白胨作为氮源时阿维拉霉素的发酵单位有较
大值 ,分别为 7716 和 6217mgΠL。酵母膏、牛肉膏、硝酸
钾等氮源经常用于放线菌的菌种活化与种子培养中 ,
但这些较易利用的氮源不利于促进次级代谢产物的生
成 ,阿维拉霉素发酵单位较小 ,不适合于发酵培养基。
214 响应面法( SAS 法)确定最佳碳氮源组合
本试验采用双碳源双氮源做响应面来确定碳氮源
的最佳比例。以可溶性淀粉、豆粕粉、核糖和大豆蛋白
胨为 4 个试验因子 ,分别表示为 x1 、x2 、x3 、x4 。采用二
次回归方程常用的中心组合设计原理来设计试验方
案。根据单因素试验结果以及经验设计因素的水平
值 ,其因素和水平见表 1 ,每个试验重复 3 次 ,取其平
均值用 SAS 软件进行分析。
表 1 试验变量的实际浓度及其对应的编码值
Table 1 Levels of the variables tested in CCD (gΠL)
编码值 coded levels x1 x2 x3 x4
- 1 15 25 215 215
0 20 30 5 5
+ 1 25 35 715 715
注 :x1 :可溶性淀粉 ;x2 :豆粕粉 ;x3 :核糖 ;x4 :大豆蛋白胨
Note : x1 : soluble starch ; x2 : soybean powder ; x3 : ribose ; x4 : soybean peptone
以发酵单位为响应值 y ,可溶性淀粉、豆粕粉、核
糖以及大豆蛋白胨为 4 个自变量 ,用 SAS 软件对试验
数据做响应面分析。由表 2 可知 ,拟合的二次回归方
程式为 :
y = 101109 - 2103 x1 + 2191 x2 + 0126 x3 +
4107 x4 - 29157 x1 x1 - 5126 x2 x1 +
4124 x3 x1 - 2190 x3 x2 - 6126 x4 x1 +
11189 x4 x2 - 3126 x4 x3
整个回归模型的 R2 为 019873 , F 值为 56153 ,回
归标准差 313996 ,说明回归方程的拟合程度较好。
表 2 发酵单位为响应值的回归分析结果
Table 2 Analysis of variance for the fitted
quadratic polynomial model
参数
term
自由度
DF
参数估计
effect
标准误差
SS
t 值
t value
P > F
intercept 1 1011085000 11699978 59146 < 010001
x1 1 - 21026250 01849989 - 2138 010443
x2 1 21906250 01849989 3142 010091
x3 1 01258750 01849989 0130 017686
x4 1 41066250 01849989 4178 010014
x1x1 1 - 291566250 11900633 - 15156 < 010001
x2x1 1 - 51263750 01849989 - 6119 010003
x3x1 1 41243750 01849989 4199 010011
x3 x2 1 - 21903750 01849989 - 3142 010091
x4 x1 1 - 61258750 01849989 - 7136 < 010001
x4x2 1 111888750 01849989 13199 < 010001
x4x3 1 - 31258750 01849989 - 3183 010050
Root MSE回归标准差 313996
图 5 所示为 SAS 软件对试验数据的回归 ,从图中
可以看出试验响应因子间的作用对于应变量发酵单位
的影响 ,都存在一个明显的顶点 ,即有一个极大值。根
据程序分析 ,计算得 x1 为 01046 ( 20112gΠL ) , x2 为
01045 (25123gΠL) , x3 为 11324 (7181gΠL) , x4 为 01099
(5106gΠL ) 时发酵单位有最大产量 ,模型预测值为
101148mgΠL。
图 5 (a ,b ,c)响应面的立体图
Fig. 5 The response surface plots (a ,b ,c) of the model equation fitted to the data of the central composite design
x1 :可溶性淀粉 ; x2 :豆粕粉 ; x4 :大豆蛋白胨
x1 :soluble starch ; x2 :soybean powder ; x4 :soybean peptone
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215 培养基优化配方验证
通过上面的培养基优化 ,确定最优发酵培养基配
方中碳源与氮源分别为可溶性淀粉 20112gΠL ,D2核糖
为 7181gΠL ,豆粕粉为 25123gΠL ,大豆蛋白胨为 5106gΠ
L。通过摇培发酵验证 , 阿维拉霉素发酵单位为
103199±412mgΠL ,试验结果和预测值很接近 ,说明整
个方程的预测较为成功。
3 结论
本试验以链霉菌 A205 为出发菌株 ,经过60 Coγ射
线诱变 ,获得了较佳的诱变剂量并筛选获得高产突变
株 H215。采用响应面法对其发酵培养基配方中的碳
源、氮源的种类、浓度与组合进行了优化设计。试验结
果表明 ,优化后的培养基配方与原始培养基相比 ,组份
虽然增多了 ,但产物阿维拉霉素的合成获得了较大的
提高。文献报道的培养基以甘露醇作为碳源 ,以豆粕
粉、缬氨酸作为氮源 ,成本较高 ;经优化后以可溶性淀
粉、核糖作为碳源 ,适量增加大豆蛋白胨 ,取消缬氨酸 ,
原料成本下降的同时发酵单位也提高了。
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