全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
双效表达载体的构建及其 U6启动子的功能效率鉴定
项海涛 1, 2 杨彬 2 温峰琴 1 胡永浩1 柳纪省 2
( 1 甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070; 2中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原
生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室 农业部草食动物疫病重点开放实验室,兰州 730046 )
摘 要: 利用 pBudcE4 1双表达载体构建 shRNA与蛋白共表达载体, 为双效疫苗的研制提供新的研究思路。以
含 U6启动子的载体为模板, PCR扩增得到 U6启动子 , 用其置换载体 pBudcE4 1内的 CMV启动子的核心部分构建
shRNA与蛋白共表达载体。用干扰绿色荧光蛋白表达的方法鉴定重组载体中的 U6启动子能否启动 shRNA的表达。
经 PCR扩增、双酶切鉴定及 DNA测序证明成功构建了载体 pBudcE4 1U6。用干扰载体 pBudcE4 1U6eGFPshRNA与
含 eGFP的载体共转染 293T细胞后 , 荧光显微镜观察显示 eGFP的表达量下降 ; 流式细胞仪检测细胞的转染效率降低。
研究结果证明 U 6启动子正常发挥作用。成功构建 RNA i与蛋白共表达载体 , 为利用该载体研制动物双效疫苗奠定了
基础。
关键词: RNA i 共表达载体 U6启动子 构建 鉴定
Construction of Doubleeffect Vector and Function
Identification ofU6 Promoter
X iangH a itao
1, 2 Yang B in2 W en Fengq in1 Hu Yonghao1 L iu J ix ing2
(
1
AnimalM edicine College, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070;
2
StateK ey Laboratory E tio logical Biology, K ey
Laboratory of Animal Viro logy of M inistry of Agriculture, K ey Laboratory of Graz ing A nimalD iseases of M inistry of A griculture,
Lanzhou Veterinary R esearch Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Lanzhou 730046)
Abstrac:t The coexpression vecto r pBudcE41 was used to construct to express shRNA and pro te in simu ltaneous lyU6 prom o ter
w as amp lified by PCR using plasm id conta in ing U6 promo ter as tem plate, and the co re sec tion of CMV prom o ter o f pBudcE41 w as
substituted for U6 promo ter The p lasm id pBudcE4 1U6 w as constructed Inte rfering o f expression o f EGFP w as used to iden tify
whe ther the shRNA can be promo ted by U6 prom ote r Results show ed tha t the p lasm id pBudcE4 1U6 w as proved successfully con
structed identified w ith PCR, restriction endonuc lease ana lys is and DNA sequence analysisThe expression of g reen fluorescent pro tein
w as reduced that w as observed by fluorescence m icroscopy F low cy tom etry detection exhibited that transfection effic iency de
creasedThe resu lts a lso indicated that the U6 prom oter deve lop its no rm al func tionThus the vectorw hich coexpress shRNA and pro
te in w ould be used to m anufacture doubleeffect vaccine
Key words: RNA i Coexpress ion vec to r U6 promo ter Construction Iden tification
收稿日期: 20080924
基金项目:国家 973!前期专项 ( 2004CCA00500) ,国家 863!项目 ( 2006AA10A204 )
作者简介:项海涛 ( 1984) ,男,山东潍坊人,在读硕士,研究方向:动物传染病学; Em ai:l x iang3312@ 163 com
通讯作者:柳纪省, Em ai:l liu jixing@ hotm ail com
RNA i现象广泛存在于果蝇、真菌、昆虫、植物以
及哺乳动物中,由于其高效率、高特异性等特点,部
分科学家已将其以基因治疗的方式应用于一些重大
传染病的治疗 [ 1] , 比如人类的 H IV病毒、偶蹄类动
物的口蹄疫病毒。RNA i是通过人工导入的与内源
靶基因具有相同序列的双链 RNA (有义 RNA和反
义 RNA )特异性地与内源靶基因的 RNA结合,进而
形成 RNA诱导沉默复合物 ( RISC )降解 mRNA, 阻
断靶基因的表达 [ 2, 3]。多项研究表明, RNA i对流感
病毒、H IV、HPV、逆转录酶病毒、口蹄疫病毒等都具
有明显的抑制作用 [ 4 ~ 8 ]。随着 RNA i技术的发展,
以 DNA载体介导的 RNA i技术逐渐成为 RNA i抗病
2009年第 4期 项海涛等:双效表达载体的构建及其 U6启动子的功能效率鉴定
毒研究的主要方法 [ 9]。
本实验室首先提出的兼具基因治疗及基因免疫
双重效果的双效疫苗旨在解决疫苗接种产生的免疫
空白期问题,防止动物在该期发病。双效疫苗的研
究已取得了一定进展,主要是运用反义核酸技术,已
成功构建出口蹄疫双效表达载体 [ 10]。本试验结合
最新的基因治疗方法, 构建 shRNA与免疫蛋白共表
达的双效表达载体,将 RNA i引入双效疫苗的研究,
为双效疫苗的研究提供新的思路。
1 材料与方法
11 材料
限制性内切酶 Nde I、H ind∀, 质粒提取试剂盒,
DNA凝胶回收试剂盒, 100 bp DNA LadderM arker、
EcoT14 I digestM arker均购自大连宝生物公司; T4
连接酶购自美国 NEB公司; 真核表达载体购自美国
Inv itrogen公司; 293T细胞购自 ATCC; 胎牛血清购
自美国 PAA公司; DMEM, 胰蛋白酶购自美国 GIB
CO公司; P lasm idM ax K it购自德国 Q iagen公司;带
U6启动子的载体由兰州兽医研究所常惠芸研究员
惠赠。
12 方法
121 引物的设计合成 用 Prmi er Prem ier50引物设
计软件针对 U6启动子的核心部分设计上下游引物,正
链引物 PU :l 5#GCATATGGATCCGACGCCGCCA3#, 负
链引物 PU2: 5#GAAGCTTAAACAAGGCTTTTCTCC3#。
由大连宝生物公司合成 PAGE级引物。
122 U 6启动子的克隆 用合成的引物以带 U 6
启动子的载体质粒为模板扩增 U6启动子, 扩增程
序: 94∃ 5 m in, 94∃ 40 s, 55∃ 1 m in, 72∃ 90 s; 30
个循环, 72∃ 最后延伸 10 m in。反应结束后取样进
行琼脂糖凝胶电泳检测。用 DNA凝胶回收试剂盒
回收扩增产物, 将其与 pMD18Tsimple克隆载体
16∃ 过夜连接。将连接产物转化 DH5感受态细
胞,筛选阳性克隆,小量提取质粒,酶切及 PCR鉴定
后送 Inv itrogen公司测序。
123 双表达载体 pBudce41载体的构建 将
pBudce41载体用 NdeI+H in d∀双酶切,酶切产物琼
脂糖凝胶电泳后, 回收载体大片段。将回收得到的
U6启动子基因片段与 pBudce41载体酶切大片段以
3%1的比例加到连接体系中, 16∃ 过夜连接。将连接
产物转化 DH5大肠杆菌感受态细胞。筛选阳性菌
落,摇菌后提质粒,进行电泳、酶切及 PCR鉴定后送
Invitrogen公司测序。
124 U6启动效果的鉴定 采用干扰绿色荧光蛋
白 ( eGFP)表达的方法 [ 11]干扰载体 pBudcE41U6
eGFPshRNA的构建参考文献中针对 eGFP基因片段
设计的干扰小片段,两端引入H ind∀ + BamH I酶切位
点,送大连宝生物公司化学合成,其序列如下: ( F链 )
5#AGCTTTCGCAGCACGACTTCTTCAAGTTCAAGAGA
CTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTTTTGGAGG3#; ( R链 )
5#GATCCCTCCAAAAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTC
TCTTGAACTTGAAGAAGTCGTGCTGCGAA3#。
退火形成双链以后连入 pBudcE41U6的 H ind
∀ + BamH I之间, 构建针对 eGFP的 RNA干扰载
体。挑选阳性克隆, 提取质粒, 进行电泳、酶切及
PCR鉴定后送 Inv itrogen公司进行测序验证。阳性
重组子命名为: pBudcE41U6eGFPshRNA。
细胞的培养及转染 293T细胞用 DMEM培养
基 (含 10%胎牛血清、100 U /m l青霉素、100 U /m l
链霉素 )于 37∃ , 5% CO 2培养箱培养, 细胞长至
80%~ 90%融合时传代。转染前一天, 将处在对数
生长期的 293T细胞以 1 & 105个 /孔接种到 6孔板,
待细胞长至 80%~ 90%融合时进行转染。干扰载体
pBudcE41U 6eGFPshRNA与含 eGFP的载体共转
染 293T细胞,并设阴性对照, 观察绿色荧光蛋白的
表达情况。质粒 ( pBudcE41U 6eGFPshRNA为 ∋,
pBudcE41U 6为 (, 含有 eGFP的载体为 ∀ )分 3
组: A( ∋ + ∀ )、B ( ( + ∀ )、C ( ∀ ) , 每组中每个质
粒各取 5 g, 稀释于 100 l的水中, 缓慢加入 100
l CaC l2 ( 05mo l /L) ,混合后加入到 200 l的 2 &
H eBS, 静置大约 30 m in, 出现细小颗粒沉淀后加入
到 293T的培养基中, 14 h后更换新培养液,继续培
养 28 h,荧光显微镜下观察,用 PBS收集各组细胞 1
& 106,通过流式细胞仪 ( FACS)检测转染效率。
2 结果
21 U6启动子的扩增
PCR产物电泳后,在略大于 300 bp处可见特异
的 DNA条带,与预计结果相符 (图 1)。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
1, 2PCR扩增产物; 3DNA分子质量标准
图 1 U6启动子 PCR扩增产物
22 载体的 PCR鉴定、双酶切鉴定
PCR扩增鉴定,条带特意; pBudcE41U6Nde I
+H ind∀双酶切鉴定,可见 41 kb和 325 kb两条
带,结果与预计大小相符, 结果见图 2。
1U6扩增鉴定产物; 2, 3pBudcE41U6的酶切产物;
4DNA分子质量标准
图 2 pBudcE4 1U6的 PCR鉴定和酶切鉴定
23 载体序列的测定
pBudcE41U6、pBudcE41U6eGFPshRNA 的
测序由 Inv itrogen公司完成 (图 3,图 4)。
24 载体 pBudcE41U 6中 U 6启动子效率鉴定
荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达, 结果
如图 5所示。细胞转染约 8 h后即可在荧光显微镜
下看到荧光, 28 h后荧光已完全表达, 荧光显微镜
下观察照相。可见 A组的荧光表达量要低于 B组、
C组的表达量, 说明干扰质粒能够干扰绿色荧光蛋
白的表达。
图 3 pBudcE4 1U6质粒图谱
图 4 干扰小片段测序图
流式细胞仪检测阳性细胞的转染效率,结果如
图 6所示。通过流式细胞仪检测各组的质粒转染效
率, 以此判定 RNA i是否起作用。结果显示: A组的
转染效率约为 61% ; B组的转染效率约为 79% ; C
组的效率约为 87%。结果与荧光显微镜下观察的
实验结果相符,说明 pBudcE41U 6中的 U6启动子
能够启动 shRNA,转录出的 siRNA能够干扰目的基
因的表达。
3 讨论
近几年的研究表明, 19~ 23个碱基的 dsRNA不
会促发干扰素效应, 能够特异性地降解 mRNA , 引
起基因沉默, 说明 RNA i可以应用于哺乳动物细
胞 [ 12]。由于 RNA i可以特异性地抑制基因表达, 所
以可用于病毒感染的治疗及预防 [ 1 ]。因此, RNA i
的基因治疗有可能是目前为止对付对于传统药物和
疫苗有耐受的病毒最有效的方法 [ 13 ]。
动物在接种疫苗后不能立即产生免疫力, 需要
一定的诱导期,这段时期被称为免疫空白期。在接
种疫苗后,动物体内抗体达到峰值需要的时间长短
不一,短的 1~ 3 d, 长的可达数周或者更长。由于接
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2009年第 4期 项海涛等:双效表达载体的构建及其 U6启动子的功能效率鉴定
图 5 绿色荧光蛋白的表达情况
图 6 流式细胞仪检测结果
种疫苗后受动物自身的免疫干扰及存在免疫抑制性
疾病等原因,动物的免疫空白期时间会延长甚至无
法获得足以抵抗病毒的抗体量,获得坚强的免疫力。
处于免疫空白期的动物一旦进入市场交易环节,与
带毒动物接触后,极易引发疾病。
本研究中所构建双效载体中的 U6启动子与
EF1启动子是各自独立的。 EF1启动子在多
种哺乳动物细胞中的启动强度是 CMV启动子的
43~ 665倍 [ 14] , 可以启动免疫基因的表达, 以达
到基因免疫的作用, 同时 U6启动子启动干扰小片
段 shRNA [ 15] ,不断地转录出 siRNA, 达到长时间抑
制病毒复制的目的, 实现了 RNA i与免疫基因的同
时表达,为双效疫苗的研制奠定基础。
参 考 文 献
1 陈煜,谢小芳 世界华人消化杂志, 2006, 14 ( 21) : 2123~ 2129
2 Yu JY, DeRu iter SL, Tu rn er DLP roc N atlA cad Sc,i 2002, 99 ( 9 ):
6047~ 6052
3 Novina CD, Sharp PA Natu re, 2004, 430: 161~ 164
4 Jacque JM, Triques K , S teven son M Natu re , 2002 , 418: 435
~ 438
5 Ge Q , Fi lip L , Bai A , et al Proc N at lA cad S ci USA, 2004, 101
( 23 ): 8676~ 8681
6 C hen W, Yan W, Du Q, et al J V irol , 2004, 78 ( 13 ): 6900~
6907 (下转第 90页 )
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
siRNA,为采用 RNA干扰技术确定 MKK4在 myosta
t in激活 JNK中的作用打下了良好的基础。
致谢:本研究在美国马里兰大学完成,感谢马里兰大学孟江洪
教授在实验中给予的帮助。
参 考 文 献
1 M cPherron AC, Law ler AM, Lee S J Natu re, 1997, 387: 83~ 90
2 H uang ZQ, Chen DW, Zhang KY, et al C ell S igna,l 2007, 19:
2286~ 2295
3 DavisR J C el,l 2000, 103: 239~ 252
4 A tf i A, D jellou l S, Chastre E, et al J B iol C hem, 1997, 272:
1429~ 1432
5 Mu ld er KM C ytokine Grow th Factor Rev, 2000, 11: 23~ 35
6 W angW, Zhou G, Hu MC, et al J B iol Chem, 1997, 272: 22771
~ 22775
7 YuenM F, LaiCL Lancel In fectD is, 2001, 1: 232~ 241
8 W ong DK, Ch eung A, Rou rke K, et al Ann InternM ed, 1993,
119: 312~ 323
9 AzaB lan c P, C ooper CL, W agn er K, et a l M ol C el,l 2003, 12:
627~ 637
10 Padd ison P J, S ilva JM, C onk lin DS, et al Natu re, 2004, 428
( 6981 ) : 427~ 431
11 B ern s K, H ijm ans EM, M u llend ers J, et a l N ature, 2004, 428
( 6981) : 431~ 437
12 Zh eng L, L iu J, B atalov S, et al Proc NatlA cad S ciUSA, 2004,
101: 135~ 140
(上接第 85页 )
7 H u WY, M yers CP, K ilzer JM, et al Curr B io,l 2002, 12: 1301
~ 1311
8 JiangM, M ilner J Oncogene, 2002, 21: 6041~ 6048
9 Sui G, Soohoo C, Af far EB, et al Genet ics, 2002, 99 ( 8) : 5515
~ 5520
10 韩晓荣,柳纪省,杨彬,等 动物医学进展, 2008, 29( 3) : 5 ~ 9
11 谢书阳,张敬之,黄淑帧,等 中华医学遗传学杂志, 2005, 22
( 4) : 431~ 434
12 Coum ou lX, Deng CX B ioch im ie, 2006, 88 ( 6) : 637~ 643
13 Leonard JN, S chaffer DV G ene Therapy, 2006, 13: 532~ 540
14 K ima SY, Leea JH, Sh ina H S, et al Journal of B iotechnology,
2002, 93 ( 2) : 183~ 187
15 Shuk la V, Coum ou lX, Deng CX In t J B iol S c,i 2007, 3: 91~ 99
90